Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

Summary

Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.

Abstract

O número de novas drogas identificado pelo tradicional, telas em vitro tem diminuído, reduzindo o sucesso desta abordagem na busca de novas armas combater a resistência a múltiplas drogas. Isto levou à conclusão de que pesquisadores não só a necessidade de encontrar novas drogas, mas também precisam desenvolver novas formas de encontrá-los. Entre o candidato mais promissor métodos são todo-organismo, in vivo , os ensaios que uso elevado-throughput, fenotípicas leituras e hospeda que variam entre Caenorhabditis elegans Danio rerio. Esses hosts têm várias vantagens poderosas, incluindo grandes reduções no falsos positivos hits, como compostos que são tóxicos para o anfitrião e/ou biounavailable são tipicamente caiu na tela inicial, antes de seguir caro acima.

Aqui nós mostramos como nosso ensaio tem sido usado para interrogar a variação do anfitrião na bem documentada c. elegans— patossistema líquido da matança dePseudomonas aeruginosa . Também demonstramos várias extensões desta técnica bem trabalhado para fora. Por exemplo, somos capazes de realizar elevado-throughput genéticas telas usando RNAi em 24 - ou 96 poços placa formatos de fatores do hospedeiro consulta nessa interação patógeno-hospedeiro. Usando este ensaio, telas de genoma inteiro podem ser concluídas em poucos meses, que drasticamente podem simplificar a tarefa de identificar alvos de drogas, potencialmente sem a necessidade de abordagens de purificação bioquímica laborioso.

Também relatamos aqui uma variação do nosso método que substitui a Gram-positive bactéria Enterococcus faecalis para o patógeno gram-negativa p. aeruginosa. Muito, como é o caso de p. aeruginosa, matar por E. faecalis é dependente do tempo. Ao contrário do anterior c. elegans— ensaios deE. faecalis , nosso ensaio de E. faecalis não precisam preinfection, melhorar seu perfil de segurança e reduzindo as chances de contaminar o equipamento de tratamento de líquido. O ensaio é altamente robusto, apresentando infecção de post ~ 95% taxas de morte 96 h.

Introduction

A identificação e o desenvolvimento de antibióticos de amplo espectro, eficazes, agora quase um século atrás, levaram a um momento decisivo na saúde pública onde havia uma crença generalizada que infecciosa doença seria um flagelo do passado. Dentro de poucas décadas, esse otimismo começou a diminuir, como patógeno após patógeno desenvolver mecanismos de resistência que limitado a esses tratamentos uma vez milagrosos. Há algum tempo, a corrida armamentista entre os esforços de descoberta de drogas e os patógenos parecia equilibrada. No entanto, o abuso de antimicrobianos recentemente culminou no surgimento de cepas de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter ....

Protocol

Cuidado: P. aeruginosa e E. faecalis são patógenos de biossegurança nível 2, e devidas precauções de segurança devem ser tomadas para prevenir a infecção acidental e para minimizar a contaminação das superfícies. Todas as mídias e materiais que entram em contato com patógenos devem ser esterilizados e/ou descartadas. Orientações adicionais estão disponíveis a partir da publicação do CDC biossegurança em microbiológicas e laboratórios biomédicos (BMBL), 5ª edição.

1. preparação e manutenção de p. aeruginosa

1. Raia de p. aeruginosa de um estoque congelado em uma placa de ágar LB (lisogenia caldo). I....

Results

Parâmetros importantes para o desempenho

Uma compreensão adequada da biologia subjacente a este ensaio é necessária para a solução de problemas e otimizando o ensaio. Para o efeito, nos referimos primeiro vários papéis chaves elucidar os mecanismos de patogênese de p. aeruginosa-mediada matando em líquido^7,20. Desde que as etapas descritas acima são seg.......

Discussion

Este ensaio (ou ensaios semelhantes onde outros agentes patogénicos são substituídos por p. aeruginosa ou E. faecalis) são útil para uma variedade de finalidades, incluindo a descoberta de medicamentos. Também é útil para abordar questões biológicas fundamentais, tais como a identificação de fatores de virulência, a elucidação das vias de defesa do hospedeiro e determinando as máquinas reguladoras envolvidas na interação patógeno-hospedeiro.

Embora o ensaio de matança líquida.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		Citômetro de fluxo de objeto grande/classificador de vermes
Cytation 5	Dispensador
EL406	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Bloco RB de poço profundo	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Greiner de placa de 384 poços	Bio-One	MPG-781091
Meios de Crescimento de Nematóides (NGM)			Quantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 2,5 gramas de Peptona, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de placas
			de Slow Killing (SK) de água mili-QQuantidade por litro: 18 gramas de ágar, 3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de Peptona, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampão de fosfato, e 973 mL de água mili-Q
		matança lenta (SK)	Quantidade por litro:  3 gramas de NaCl, 3,5 gramas de peptona, 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de tampão fosfato e 973 mL de água mili-Q
Caldo de lisogenia (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
Brian Heart Caldo de infusão (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
		para minhocas	Quantidade por 100 mL: 10 mL de solução de NaOH 5 M, 20 mL de solução de hipoclorito de sódio a 5% e 70 mL de água estéril
S Quantidade basal			por litro: 5,85 gramas de NaCl, 6 gramas de KH2PO4, 1 grama K2HPO4, e 1 litro de ágar água milli-Q
	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl2	USBiological Life Sciences
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
Quantidade de tampão			por litro: 132 mL de K2HPO4 (1M) e 868 mL de KH2PO4 (1M)
KH2PO4	Acros Organics	7778-77-0
K2HPO4	USBiological Life Sciences	P5100
Solução de hipoclorito de sódio a 5%	BICCA	7495.5-32
Solução de NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Breathe-easy	Diversified Biotech	BEM-1
SYTOX Laranja Mancha de Ácido Nucleico	Fisher Scientific	S11368
Cepas Bacterianas
P. aeruginosa (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli superalimento (OP50)
E. coli RNAi Bactérias que expressam (HT115)
Worm Cepas <
em>glp-4(bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::Repórter GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)