Artigo de método

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

DOI:

10.3791/58081

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30 de outubro de 2018

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1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Neste artigo

Resumo

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Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Resumo

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Macrófagos e células dendríticas são células cruciais que formam a primeira linha de defesa contra patógenos. Eles também desempenham papéis importantes no início de uma resposta imune adaptável. Trabalho experimental com estas células é bastante desafiador. Sua abundância em órgãos e tecidos é relativamente baixa. Como resultado, eles não podem ser isolados em grandes números. Eles também são difíceis de transfect com construções de cDNA. No modelo murino, estes problemas podem ser parcialmente superados por diferenciação em vitro de progenitores da medula óssea na presença de macrófagos de M-CSF ou GM-CSF para células dendríticas. Desta forma, é possível obter grandes quantidades dessas células de poucos animais. Além disso, os progenitores da medula óssea podem ser transfectadas com vetores retrovirais carregando do cDNA construções durante as fases iniciais de cultivo antes da sua diferenciação em células dendríticas derivada de medula óssea e macrófagos. Assim, a transdução retroviral seguida de diferenciação em vitro pode ser usada para expressar várias construções de cDNA nestas células. A habilidade de expressar proteínas ectópica substancialmente amplia a gama de experiências que podem ser executadas nessas células, incluindo a imagem de célula viva de proteínas fluorescentes, purificações em tandem para interactome análises, análises de estrutura-função, monitoramento de funções celulares com biosensores e muitos outros. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para retroviral transdução de murino medula óssea derivada de células dendríticas e macrófagos com vetores que codifica para proteínas fluorescente-etiquetadas. O exemplo de duas proteínas do adaptador, OPAL1 e PSTPIP2, vamos demonstrar sua aplicação prática em citometria de fluxo e microscopia. Também discutimos as vantagens e as limitações desta abordagem.

Introdução

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Células mieloides representam uma parte indispensável dos nossos mecanismos de defesa contra patógenos. Eles são capazes de eliminar rapidamente os micróbios, bem como células morrendo. Além disso, também estão envolvidos na regulação da reparação e desenvolvimento do tecido e na manutenção da homeostase1,2,3. Todas as células mieloides diferenciarem dos progenitores mieloides comuns na medula óssea. Sua diferenciação em vários subconjuntos funcionalmente e morfologicamente distintos é em grande medida controlada por citocinas e suas várias combinações de4

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Protocolo

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Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comité de peritos sobre o bem-estar de animais experimentais do Instituto de Genética Molecular e pela Academia de Ciências da República Checa.

1. preparação do reagente

  1. Prepare o tampão de amônio-cloreto-potássio (ACK). Adicionar 4,145 g de NH4Cl e 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de DDQ2O, em seguida, adicionar 100 µ l de 0,5 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e filtro-esterilizar.
  2. Prepare o polyethylenimine (PEI) solução. Adicionar 0,1 g de PEI a 90 mL de DDQ2O. Agitação, adicione 1 M de HCl gota a gota até que o pH é infer....

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Resultados

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Sinalização de adaptador de proteínas é geralmente pequenas proteínas sem qualquer atividade enzimática. Eles possuem vários domínios de interação ou motivos, que mediam a ligação a outras proteínas envolveram na transdução de sinal, incluindo tirosina quinases, fosfatases, ubiquitina ligases e outros21. Para a demonstração da funcionalidade do presente protocolo, adaptadores de células mieloides, PSTPIP2 e OPAL1 foram selecionados. PSTPIP2 é uma bem caracterizadas.......

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Discussão

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A expressão da proteína de interesse em células-alvo é uma etapa chave em muitos tipos de estudos biológicos. Diferenciada de macrófagos e células dendríticas são difíceis de transfect por transfecção padrão e técnicas de transdução retroviral. Ignorando o transfeccao dessas células diferenciadas com retroviral transdução da medula óssea progenitores, seguido de diferenciação, quando eles já carregam a construção desejada, é um passo crítico, permitindo a expressão dos cDNAs ectópica nestes tipos de células. Um exemplo d.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Checa Science Foundation (GACR) (número do projeto 16-07425S), por Charles University Grant agência (SAUNG) (número do projeto 923116) e pelo financiamento institucional do Instituto de Genética Molecular, Academia de Ciências da República Checa República (RVO 68378050).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA15028
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA10270Para suplementação de mídia
KHCO3Lachema, Brno, República TchecaN/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)A9434
PenicilinaBB Pharma AS, Praga, República TchecaN/APENICILINA G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
EstreptomicinaSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)S9137Sal de sulfato de estreptomicina em pó
GentamicinaDr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, República TchecaN/A
Polietilenonimina, linear, MW 25.000Polyscience, Warrington, PA, EUA23966
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)E5134
PBSPreparado internamente pela instalação de mídia da IMG ASCR, Praga, RepúblicaTchecaN/A
APC anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo, clone M1/70BioLegend (San Diego, CA, EUA)101212análise de citometria de fluxo
PE anti-camundongo F4/80 Anticorpo, clone BM8BioLegend (San Diego, CA, EUA)123110análise de citometria de fluxo
APC anti-camundongo CD11c Anticorpo, clone N418BioLegend (San Diego, CA, EUA)117310análise de citometria de fluxo
M-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, EUA)315-02
GM-CSFPeproTech (Rocky Hill, NJ, EUA)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUAH1398uso em 1-2 µ g/mL
Análise de citometria de fluxo

Referências

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  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology.

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Etiquetas

Macr fagos Derivados da Medula sseaProtocolo de Transdu o RetroviralAn lise por Citometria de FluxoImagem por MicroscopiaC lulas de Empacotamento Platinum EcoIsolamento de Medula sseaDiferencia o por M CSFDiferencia o por GM CSF

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