Para expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com câncer de pulmão para tratamento com pembrolizumab, de forma confiável e reproduzível, nós desenvolvemos um ensaio que usa o concentrado de 22 3 anticorpo em um amplamente disponível imuno-histoquímica autostainer, para amostras tanto biópsia e citologia.
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Artigo de método
Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pembrolizumab em monoterapia foi aprovado para o tratamento de primeira e segunda linha de pacientes com PD-L1-expressando avançado câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC). Ensaios de expressão PD-L1 com o ensaio diagnóstico complementar de 22 3 PD-L1 imuno-histoquímica (IHC), o que dá uma proporção de tumor partitura (TPS), foi validada no tecido do tumor. Desenvolvemos um otimizado desenvolvido laboratório teste (LDT) que usa o concentrado de 22 3 anticorpo (Ab) em um autostainer IHC amplamente disponível para espécimes de biópsia e citologia. O TPS-PD-L1 foi avaliada com 120 seções emparelhados todo-tumor de tecido e amostras de biópsia e com 70 combinado amostras de biópsia e citologia (lavagens brônquicas, n = 40; derrame pleural, n = 30). O Ab 22 3 que baseado em concentrado LDT mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e citologia espécimes (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinado usando o ensaio de 22 3 companheiro de IHC PD-L1 em ambos os TPS corta pontos (≥ 1%, ≥ 50%). A LDT otimizada apresentada aqui, usando o concentrado de Ab 22 3 para determinar a expressão de PD-L1 em ambos os tecidos de tumor e em amostras de citologia, vai expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com NSCLC para tratamento com pembrolizumab em monoterapia de forma confiável e reprodutível.
Introdução
Ensaios clínicos recentes têm demonstrado a eficácia do pembrolizumab, um humanizado IgG4 kappa isotipo anticorpo monoclonal que bloqueia a interação entre a morte celular programada 1 (PD-1) e seus ligantes, PD-L1 e L2-PD, no tratamento de pacientes com avançado NSCLC1,2,3,4.
Atualmente, pembrolizumab é aprovado para tratamento de NSCLC PD-L1-expressando em ambos os pacientes tratamento-ingénuos com uma expressão de PD-L1 TPS de ≥ 50% e nenhum receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou linfoma anaplásico quinase (ALK) tumor genômica de aberrações cromossómicas3 e para previamente tratados pacientes com um TPS-PD-L1 de ≥ 1%1.
Expressão de proteínas de PD-L1 detectado pelo IHC foi amplamente utilizado como um ensaio de biomarcador preditiva das terapias anti-PD-1/PD-L1. Em ensaios clínicos pembrolizumab, PD-L1 TPS obtidos com fixada em formol amostras de tecido (FFPE) parafina foi determinada utilizando o companheiro de IHC PD-L1 22 3 ensaio5. Este ensaio foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) e tem sido a marcação CE na Europa para a determinação do tumor PD-L1 TPS5.
Opções globais adicionais através de instituições para avaliações confiáveis e de alta qualidade da PD-L1 TPS com LDTs que usam o concentrado anticorpo 22 3 são essenciais para apoiar as decisões clínicas feitas a respeito da elegibilidade de pacientes para pembrolizumab tratamento. Um grande número de laboratórios de patologia não tem acesso para o ensaio de IHC PD-L1 22 3 diagnóstico complementar. Portanto, é essencial o desenvolvimento de confiáveis e consistentes LDTs compatíveis com plataformas de autostainer IHC adicionais, amplamente disponíveis.
Além disso, há uma necessidade de estabelecer LDTs usando amostras de citologia que são o único espécime tipo frequentemente disponível a partir de pacientes NSCLC. O ensaio de companheiro de IHC PD-L1 22 3 é validado para ressecções, biopsias de agulha e broncofibroscopias somente se a broncoscopia produz 100 células de tumor. Embora os tipos de amostra acima são frequentemente obtidos, amostras de citologia são mais facilmente coletadas e são o tipo de amostra mais comumente disponíveis em algumas instituições6,7. No entanto, não há atualmente nenhum ensaio validado de diagnóstico disponíveis para a avaliação da expressão PD-L1 em amostras de citologia; LDTs confiáveis compatíveis com amostras de citologia iria facilitar ainda mais o teste de PD-L1 de alta qualidade.
Além disso, ao estabelecer a validação clínica de uma LDT, o IHC deve ser realizada de forma semelhante ao correspondente clinicamente validado teste comercial8. Por exemplo, várias etapas críticas devem ser verificadas para obter o mesmo sinal em seções seriais como titulação de anticorpos, atrasos de pré-tratamento, tempo de incubação e de sistemas de amplificação9.
Recentemente desenvolvemos uma LDT otimizada que usa o concentrado de 22 3 anticorpo para avaliar a expressão de PD-L1 no tumor biópsias e citologia amostras10,11. Encontramos uma alta concordância com a LDT contra o "padrão ouro" PD-L1 IHC 22 3 ensaio10,11. Este protocolo clinicamente validado oferecerá suporte confiável e de alta qualidade PD-L1 testes globalmente em todas as regiões.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local (Comitê de ética de pesquisa humana, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo é ajustado especificamente para o uso do anticorpo 22 3 concentrado em um stainer IHC automatizado disponível comercialmente (referido como autostainer aqui, consulte a Tabela de materiais) para amostras de citologia e biópsias de tumor.
1. preparação de amostras de tecido do Tumor
- Fixar o tecido do tumor em neutro tamponado formol a 10% (NBF) em uma gaveta.
Nota: Tecido de Tumor de tumores de pulmão proximal é geralmente obtido por broncoscopia, realizada sob sedação moderada por um pneumologista, ou especialista de pulmão. Para lesões periféricas e doença pulmonar difusa, é indicada uma biópsia transbrônquica ou agulha. Esses procedimentos são geralmente feitos em uma sala de cirurgia ou unidade de cuidados intensivos. - Incorpore a gaveta em parafina.
Nota: Fixação pode ser alcançada por perfusão ou imersão imediatamente após a dissecação e normalmente requer 8 – 10 h. O volume de fixador deve ser de 15 – 20 x maior do que o volume de amostra. Não é aconselhável fixar tecido de biópsia para mais de 10 h, porque overfixation podem causar mascaramento do antígeno. A velocidade de fixação é de cerca de 1 mm/h à temperatura ambiente. - Infiltrar-se a amostra de tecido fixo com cera no processador de tecidos (ver Tabela de materiais).
Nota: A desidratação é realizada em três banhos de álcool com o aumento da concentração de 70%, 85% e 90%. Água é finalmente removida por três banhos de álcool final do absoluto. A compensação é realizada em três banhos de tolueno e a infiltração de cera em banhos de cera quente (44-60 ° C). - Incorporar o tecido no interior de um molde cheio de parafina derretida (ver Tabela de materiais) e aguarde a solidificação.
- Secção do tecido parafina em uma espessura de 3 μm em um micrótomo.
- Transferência da faixa de opções de parafina para um vidro de microscópio carregados positivamente deslize (ver Tabela de materiais).
- Secar o slide para 1 h a 37 ° C.
Nota: Guarde as seções de tecido a 2 – 8 ° C (preferida) ou à temperatura ambiente até 25 ° C para preservar a antigenicidade e mancha dentro d 15 de seccionamento.
2. preparação das amostras de citologia
-
Coletar Lavagem brônquica em uma solução conservante (ver tabela de materiais).
Nota: Para isso, técnica de broncoscopia padrão é usada.- A distribuição do brônquio a amostrar de lavagem. Recolha a lavagem em um recipiente limpo. Rótulo do recipiente com o paciente do primeiro e último nome, data de nascimento e fonte do espécime.
- Transferir as águas de lavagem brônquicas para um tubo cónico de 50 mL e adicionar 2 g de DL-ditiotreitol pó (ver Tabela de materiais), vórtice do tubo por 30 min e então ele Centrifugue a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de uma solução mucolítico (ver Tabela de Material).
- Agitar a amostra por 20 min em velocidade média (nível 9) e centrifuga-lo a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e depositar o centrifugado em tubos de coleção contendo 10% NBF.
- Adicione 4 gotas de um eritrócito de preparação de bloco (ver Tabela de materiais) para o centrifugado.
- Transferir o centrifugado para uma gaveta, corrigi-lo em 10% NBF e parafina-incorporá-lo para a preparação de bloco celular e seccionamento (ver passos 1.1 – 1.7).
3. ensaio de coloração PD-L1
- Ligue a autostainer e o computador.
- Clique duas vezes no ícone autostainer e escolher o usuário.
- Clique em 'Criar rótulo' e no 'Protocolo'.
- Clique duas vezes no protocolo 22 3.
Nota: O protocolo primeiro está instalado no computador a autostainer clicando em ' criar protocolo '. O protocolo completo é fornecido como arquivo suplementar 1. - Escreva o ID do paciente no rótulo e clique em 'Imprimir'.
- Manter o rótulo do slide.
- Abra a gaveta slide pressionando no botão da gaveta que foi escolhido.
- Coloque o slide rotulado a almofada térmica com a etiqueta voltada para cima e para dentro.
- Feche a gaveta do slide.
- Remova as tampas dos dispensadores e carregar os reagentes nas prateleiras dos reagentes.
- Abra o capô do corante e coloque os racks no carrossel dos reagentes, certificando-se que eles se encaixam e segure na posição.
- Feche o capô.
- Sobre o software, clique no instrumento que será usado e clique em 'Executar'.
- No final do procedimento de IHC, enxágue o slide por alguns segundos com água da torneira e uma gota de uma solução de limpeza.
- Re-hidratar o slide com um banho de etanol 100% e um segundo banho de etanol a 95% por alguns segundos.
- Coloque o slide dentro da máquina de lamínula para um carregamento automatizado da lamela.
4. interpretação da coloração PD-L1
Nota: Uma patologista qualificada deve realizar a interpretação do teste de IHC PD-L1.
- Avalie a qualidade da manchar o PD-L1, analisando os controles positivos e negativos antes do exame da amostra do paciente.
Nota: Os resultados obtidos na amostra do paciente são considerados inválidos se a coloração dos controles não é aceitável. - Confirme a presença de um mínimo de 100 células de tumor viável sob um microscópio.
Observação: Relatório quando a amostra do paciente tem menos de 100 células de tumor. - Em uma baixa ampliação de 4x, avalie todas as áreas do tumor bem preservado de positivo e negativo.
Nota: Em uma ampliação baixa, coloração parcial da membrana ou membrana coloração de intensidade fraca (1 +) pode ser difícil de reconhecer. - Pontuação de coloração parcial ou total da membrana celular.
Nota: A coloração citoplasmática tem de ser excluída da interpretação. - Calcule o TPS, avaliando a proporção de células de tumor positivo PD-L1 em relação a todas as células do tumor presentes nas áreas tumor bem preservada.
Nota: Somente as células do tumor viável devem ser examinadas. Todos os outros elementos celulares, como células do sistema imunológico, células necróticas, células normais e artefatos, tem que ser excluídos do exame.
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Resultados
Usando o procedimento apresentado aqui e conforme descrito em detalhes no recentes publicações10,11 deste grupo, LDT otimizado foi clinicamente validado com 120 amostras de biópsia FFPE NSCLC arquivamento de pacientes submetidos à cirurgia ressecção ou uma biópsia no Hospital Universitário Pasteur, Nice, entre março de 2007 e março de 2016. Além disso, para a avaliação da expressão de PD-L1 de amostras de citologia, TPS foi avalia...
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Discussão
Podemos ter validado uma LDT otimizada usando o concentrado de anticorpo 22 3 PD-L1, comparando-a com o correspondente clinicamente validado teste comercial10,11. 3 a 22 concentrado LDT baseados em anticorpo que mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e amostras de citologia (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinada usando o ensaio de IHC PD-L1 22 3 ≥ 1% TPS e o ≥ 50% TPS cortar pontos. Como recentemente recomendada ...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi patrocinado pela Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Os financiadores não desempenharam nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Solução conservante para espécimes de citologia |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Solução mucolítica |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Sistema de console de incorporação de tecido | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| lâmina de vidro para microscópio SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol em pó | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 anticorpo concentrado | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP | Multimer Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplificação H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplificador | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplificação Multômero | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Cobre | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxilina II | Ventana | #790-2208 | |
| Reagente Azulado | Ventana | #760-2037 | |
| Condicionamento Celular 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Capa de Filme Tissue-Tek | Sakura | 4742 |
Referências
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Reimpressões e permissões
