Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.
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Artigo de método
Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mediada por Carboxylesterase metabolismo é pensado para jogar um papel importante na resistência de inseticida em vários tipos de insetos. Vários carboxylesterase de genes foram encontrados acima-está regulada em tensão de voar a casa resistente, Considerando que seus papéis em conferir resistência inseticida permaneceram para ser explorado. Aqui, nós projetamos um protocolo para a caracterização funcional de carboxylesterases. Três experimentos de exemplo são apresentados: (1) expressão e isolamento de proteínas carboxylesterase através de um inseto mediada por baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema de expressão de células; (2) um MTT baseada em célula (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium brometo) ensaio de citotoxicidade para medir a tolerância das células de inseto à permetrina diferentes tratamentos; e (3) em vitro estudos metabólicos para explorar os recursos metabólicos do carboxylesterases em direção a permetrina. O gene carboxylesterase MdαE7 foi clonada de uma casa resistente voar estirpe ALHF e usado para construir um baculovirus recombinante para Sf9 infecção de células. As realidades de célula contra permetrina diferentes tratamentos foram medidas com o ensaio de MTT. A tolerância de célula reforçada do grupo experimental (células de baculovirus infectado MdαE7-recombinante) comparado com os dos grupos controle (CAT-recombinante baculovirus infectados células e células de baculovirus infectados de GFP-recombinante) a permetrina tratamentos sugeriram que os recursos do MdαE7 em metabolizar inseticidas, protegendo assim as células de danos químicos. Além disso, carboxylesterase proteínas foram expressas em células de inseto Sf9 e isoladas para realizar um estudo metabólico em vitro . Nossos resultados indicaram uma significativa em vitro eficiência metabólica de MdαE7 em direção a permetrina, indicando diretamente o envolvimento do carboxylesterases em metabolizar inseticidas e assim conferir resistência inseticida em casa voa.
Introdução
Resistência de inseticida é atualmente um grande problema de casa fly controle mundial1,2. Os esforços para determinar o mecanismo de resistência de inseticida facilita o melhor entendimento desta questão e, assim, fornecer novas estratégias para efetivamente prevenir ou minimizar a propagação de resistência desenvolvimento3. Carboxylesterases, como uma das enzimas de desintoxicação principais, têm atraído muita atenção por seus papéis em sequestro e metabolizar inseticidas em vários insetos4,5,6
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Protocolo
1. expressão e isolamento de proteínas do alvo com um sistema de expressão de células de inseto mediada por Baculovirus
- Direcionalmente clone sem corte-terminados produtos PCR de proteínas do alvo de moscas domésticas.
- Projetar primers PCR de proteína verde fluorescente (GFP) e o gene MdαE7 casa voar com base em suas sequências e os requisitos especiais do vetor escolhido (tabela 1).
- Usar uma DNA-polimerase termoestável, correcção e primers da etapa 1.1.1 para realizar uma reação de PCR de 150 µ l (30 µ l de tampão de reação, 3 µ l de dNTPs 10 mM, 1,5 µ l de DNA polimerase, 6 µ l de DNA de casa modelo voar, 7,5 µ l de prim....
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Resultados
A viabilidade celular em direção a permetrina diferentes tratamentos (ensaio de MTT)
A citotoxidade de permetrina foi examinada em MdαE7-recombinante baculovirus infectado Sf9 células (grupo experimental) e CAT-recombinante baculovirus (fornecido pelo kit de baculovirus infectado) infectados células (grupos de controle). As tolerâncias de célula reforçada de permetrina em MdαE7 expressando células fortemente apoiar as funções metab.......
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Discussão
Nas últimas décadas, sistemas de expressão heteróloga têm sido amplamente utilizados para expressar e isolar grandes quantidades de proteínas, permitindo assim a determinação bioquímica e funcional e caracterização de enzimas em vitro. Até à data, vários sistemas de modelo diferente, incluindo Escherichia colie Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae, Spodoptera frugiperda foram adaptados para a expressão da proteína recombinante e a escolha da sistema in vitro é c.......
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Q5 DNA polimerase de alta fidelidade | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick | Kit de clonagem QIAGEN | 28704 | |
| pENTR / D-TOPO, com One Shot TOP10 Chemical Competent E. coli | Invitrogen por tecnologia de vida | K240020 | primers de sequência M13 médios e universais S.O.C foram incluídos neste kit. |
| Kit de minipreparação de plasmídeo PureLink HiPure | Invitrogen da life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Mistura enzimática para kits BaculoDirectTM | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| Kit de transfecção de DNA linear BaculoDirect C-Term | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Reagente de transfecção de cellfectin e ganciclovir foram incluídos neste kit |
| plasmídeo pENTR-CAT | Invitrogen by life technology | Incluído no Kit de Transfecção de DNA Linear BaculoDirect C-Term, concentração: 0,5 ug/uL | |
| Soro Bovino Fetal inativado por calor, Certificado | Gibco pela Life Technologies | 10082-139 | |
| Células Sf9 em Sf-900 III SFM | Gibco da Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences por A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1&vezes;) Meio Completo Serum Free | Gibco da Life Technologies | 12658-019 | |
| Meio de Inseto da Grace, não suplementado | Gibco da Life Technologies | 11595030 | |
| Permetrina (isômeros) padrão analítico | SUPELCO da Solutions WithinTM | 442748 | |
| Metanol (classificado como analítico) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrila (grau analítico) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Filtros de Seringa com 0.45 μ m Membrana GHP (Certificada para HPLC) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 Sistema HPLC | Waters | ||
| T100 Ciclo Térmico | Bio-Rad Laboratories Inc. | ||
| Nanodrop 2000 / 2000c Espectrofotômetros | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
Referências
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al.
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Reimpressões e permissões
