Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

Abstract

Mediada por Carboxylesterase metabolismo é pensado para jogar um papel importante na resistência de inseticida em vários tipos de insetos. Vários carboxylesterase de genes foram encontrados acima-está regulada em tensão de voar a casa resistente, Considerando que seus papéis em conferir resistência inseticida permaneceram para ser explorado. Aqui, nós projetamos um protocolo para a caracterização funcional de carboxylesterases. Três experimentos de exemplo são apresentados: (1) expressão e isolamento de proteínas carboxylesterase através de um inseto mediada por baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema de expressão de células; (2) um MTT baseada em célula (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium brometo) ensaio de citotoxicidade para medir a tolerância das células de inseto à permetrina diferentes tratamentos; e (3) em vitro estudos metabólicos para explorar os recursos metabólicos do carboxylesterases em direção a permetrina. O gene carboxylesterase MdαE7 foi clonada de uma casa resistente voar estirpe ALHF e usado para construir um baculovirus recombinante para Sf9 infecção de células. As realidades de célula contra permetrina diferentes tratamentos foram medidas com o ensaio de MTT. A tolerância de célula reforçada do grupo experimental (células de baculovirus infectado MdαE7-recombinante) comparado com os dos grupos controle (CAT-recombinante baculovirus infectados células e células de baculovirus infectados de GFP-recombinante) a permetrina tratamentos sugeriram que os recursos do MdαE7 em metabolizar inseticidas, protegendo assim as células de danos químicos. Além disso, carboxylesterase proteínas foram expressas em células de inseto Sf9 e isoladas para realizar um estudo metabólico em vitro . Nossos resultados indicaram uma significativa em vitro eficiência metabólica de MdαE7 em direção a permetrina, indicando diretamente o envolvimento do carboxylesterases em metabolizar inseticidas e assim conferir resistência inseticida em casa voa.

Introduction

Resistência de inseticida é atualmente um grande problema de casa fly controle mundial^1,2. Os esforços para determinar o mecanismo de resistência de inseticida facilita o melhor entendimento desta questão e, assim, fornecer novas estratégias para efetivamente prevenir ou minimizar a propagação de resistência desenvolvimento³. Carboxylesterases, como uma das enzimas de desintoxicação principais, têm atraído muita atenção por seus papéis em sequestro e metabolizar inseticidas em vários insetos^4,5,6

Protocol

1. expressão e isolamento de proteínas do alvo com um sistema de expressão de células de inseto mediada por Baculovirus

1. Direcionalmente clone sem corte-terminados produtos PCR de proteínas do alvo de moscas domésticas.
   1. Projetar primers PCR de proteína verde fluorescente (GFP) e o gene MdαE7 casa voar com base em suas sequências e os requisitos especiais do vetor escolhido (tabela 1).
   2. Usar uma DNA-polimerase termoestável, correcção e primers da etapa 1.1.1 para realizar uma reação de PCR de 150 µ l (30 µ l de tampão de reação, 3 µ l de dNTPs 10 mM, 1,5 µ l de DNA polimerase, 6 µ l de DNA de casa modelo voar, 7,5 µ l de prim....

Results

A viabilidade celular em direção a permetrina diferentes tratamentos (ensaio de MTT)

A citotoxidade de permetrina foi examinada em MdαE7-recombinante baculovirus infectado Sf9 células (grupo experimental) e CAT-recombinante baculovirus (fornecido pelo kit de baculovirus infectado) infectados células (grupos de controle). As tolerâncias de célula reforçada de permetrina em MdαE7 expressando células fortemente apoiar as funções metab.......

Discussion

Nas últimas décadas, sistemas de expressão heteróloga têm sido amplamente utilizados para expressar e isolar grandes quantidades de proteínas, permitindo assim a determinação bioquímica e funcional e caracterização de enzimas em vitro. Até à data, vários sistemas de modelo diferente, incluindo Escherichia colie Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae, Spodoptera frugiperda foram adaptados para a expressão da proteína recombinante e a escolha da sistema in vitro é c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q5 DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs inc.	M0491L
QIAquick	Kit de clonagem QIAGEN	28704
pENTR / D-TOPO, com One Shot TOP10 Chemical Competent E. coli	Invitrogen por tecnologia de vida	K240020	primers de sequência M13 médios e universais S.O.C foram incluídos neste kit.
Kit de minipreparação de plasmídeo PureLink HiPure	Invitrogen da life technology	K210002
Gateway LR Clonase II Mistura enzimática para kits BaculoDirectTM	Invitrogen by life technology	11791-023
Kit de transfecção de DNA linear BaculoDirect C-Term	Invitrogen by life technology	12562-019	Reagente de transfecção de cellfectin e ganciclovir foram incluídos neste kit
plasmídeo pENTR-CAT	Invitrogen by life technology		Incluído no Kit de Transfecção de DNA Linear BaculoDirect C-Term, concentração: 0,5 ug/uL
Soro Bovino Fetal inativado por calor, Certificado	Gibco pela Life Technologies	10082-139
Células Sf9 em Sf-900 III SFM	Gibco da Life Technologies	12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer	G Biosciences por A Geno Technology Inc	786-411
Sf-900 III SFM (1&vezes;) Meio Completo Serum Free	Gibco da Life Technologies	12658-019
Meio de Inseto da Grace, não suplementado	Gibco da Life Technologies	11595030
Permetrina (isômeros) padrão analítico	SUPELCO da Solutions WithinTM	442748
Metanol (classificado como analítico)	Sigma-Aldrich	67-56-1
Acetonitrila (grau analítico)	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Filtros de Seringa com 0.45 μ m Membrana GHP (Certificada para HPLC)	Pall Life Sciences	21890388
Alliance Waters 2695 Sistema HPLC	Waters
T100 Ciclo Térmico	Bio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000 / 2000c Espectrofotômetros	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek