Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.

Abstract

Tornou-se cada vez mais claro que os astrócitos modulam função neuronal não só a nível sináptico e célula única, mas também no nível da rede. Astrócitos são fortemente ligados uns aos outros através de junções e acoplamento através destes cruzamentos é dinâmico e altamente regulamentado. Um conceito emergente é que funções hamartomas são especializadas e adaptadas para as funções do circuito neuronal com o qual eles estão associados. Portanto, métodos para medir vários parâmetros das redes hamartomas são necessários para melhor descrever as regras que regem a sua comunicação e acoplamento e a entender melhor as suas funções.

Aqui, usando o software de análise de imagem (ex., ImageJFIJI), descrevemos um método para analisar imagens confocal de redes hamartomas reveladas pela tintura-acoplamento. Estes métodos permitem 1) uma detecção automatizada e imparcial de pilhas etiquetadas, 2) cálculo do tamanho da rede, 3) cálculo da orientação preferencial da tintura espalhar dentro da rede e 4) reposicionamento da rede dentro da área de interesse .

Esta análise pode ser usada para caracterizar redes hamartomas de uma determinada área, comparar as redes de diferentes áreas associadas a diferentes funções ou comparar redes obtidas em condições diferentes que têm efeitos diferentes sobre o acoplamento. Estas observações podem levar a importantes considerações funcionais. Por exemplo, analisamos as redes hamartomas de um núcleo trigeminal, onde anteriormente mostramos que hamartomas acoplamento é essencial para a capacidade dos neurônios mudar seus padrões de fuzilamento de tónico para ruptura rítmica¹. Ao medir o tamanho, confinamento e orientação preferencial das redes hamartomas esse núcleo, podemos construir hipóteses sobre domínios funcionais que eles delimitam. Vários estudos sugerem que várias outras áreas do cérebro, incluindo o córtex de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos e núcleos sensoriais no tálamo e no córtex visual, para citar alguns, podem beneficiar de uma análise semelhante.

Introduction

Muitos estudos têm descrito como o diálogo do neurônio-astrocyte em um nível celular sub ou sináptico pode ter implicações em funções neuronais e a transmissão sináptica. Está bem estabelecido que astrócitos são sensíveis ao redor de atividade neuronal; na verdade, eles possuem receptores para muitos neurotransmissores incluindo glutamato, GABA, acetilcolina e ATP (ver comentários publicados anteriormente^2,3,4). Em troca, hamartomas processa sináptica elementos ensheath e influência de atividade neuronal ambos lá e em locais extrasynaptic regulação homeostase iónica extracelu....

Protocol

Todos os procedimentos de morada pelas regras institutos canadenses de pesquisa em saúde e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados com animais da Universidade de Montreal.

1. preparação de fatias de cérebro de rato

1. Prepare 1 L de uma solução baseada em sacarose (tabela 1) e 1 litro de líquido de cerebral-espinhal artificial padrão (aCSF) (tabela 2).
2. Bolha a solução de sacarose com uma mistura de 95% O₂ e 5% CO₂ (carbogênio) por 30 min antes de colocá-lo em-80 ° C por cerca de 30 min, até que a solução é frio, mas não totalmente congelada. Use este sacarose gel....

Results

Acoplamento entre as células do cérebro não é estático, mas prefiro dinamicamente regulamentado por muitos fatores. Os métodos descritos foram desenvolvidos para redes hamartomas reveladas sob diferentes condições de analisar e entender sua organização em NVsnpr. Estes resultados foram já publicados¹. Biocytin enchimento de astrócitos único foram realizadas na parte dorsal do NVsnpr em três condições diferentes: em repouso (em controlar as condições na ausência de .......

Discussion

Existe um número de métodos eletrofisiológicos para avaliar funcional acoplamento entre astrócitos^23,24. No entanto, esses métodos não fornecem informações sobre o arranjo anatômico das redes hamartomas. Vários estudos já mostraram que "corante ou marcador-acoplamento", como feito aqui, ocorre apenas em uma fração de juntamente com as células que são detectadas por métodos eletrofisiológicos^25,26,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produtos químicos Fisher NaCl		S671-3
KCl	Produtos químicos	P217-500
KH2PO4	Produtos químicos Fisher	P285-500
MgSO4	Fisher Produtos químicos	M65-500
NaHCO3	Fisher Produtos químicos	S233-500
C6H12O6 Dextrose anidra	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 di-hidratado	Sigma	C70-500
Sacarose		Sigma S9378
Sal de potássio de ácido D-glucônico	Sigma	G45001
MgCl2 anidro	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Sal	Sigma	A9062
GTPTris Sal	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Carbenoxolone dissódico	sal Sigma	C4790
complexo avidina-biotina: kit ABC	Vestor laboratories	PK-4000
Streptavidine-alexa 594	Sondas Moleculares	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xileno	Fisher Chemicals	X5-1
Meio de montagem aquoso 1: Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Meio de montagem de resina sintética à base de toluen: Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Slide Drying Bench	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Vidro de cobertura do microscópio	Fisherbrand	12-544A
Lâmina de microscópio ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Microscópio confocal	Lente
40X	Lente	Olympus LUMPLFLN40XW
20X	Lente	Olympus XLUMPLFL20XW
4X	Micropipeta Olympus	XLFLUOR4X/340
extrator	Sutter Instrument	P97
Micromanipulador	Sutter Instrument	MP 225
Câmera CCD	Sony	CX-ST50
Monitor preto e branco	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp amplificador	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Software de aquisição de eletrofisiologia	Dispositivos moleculares	pClamp 8
Software de análise de eletrofisiologia	Dispositivos moleculares	Clampfit 8
Software de análise de imagem	ImageJFIJI	Software de código aberto. Versão FIJI incluindo pacote plug-in.
Editor de imagens vetoriais	Adobe	Illustrator CS4
Aplicativo de planilha	Microsoft Office	Excel 2010