Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.
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Artigo de método
Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tornou-se cada vez mais claro que os astrócitos modulam função neuronal não só a nível sináptico e célula única, mas também no nível da rede. Astrócitos são fortemente ligados uns aos outros através de junções e acoplamento através destes cruzamentos é dinâmico e altamente regulamentado. Um conceito emergente é que funções hamartomas são especializadas e adaptadas para as funções do circuito neuronal com o qual eles estão associados. Portanto, métodos para medir vários parâmetros das redes hamartomas são necessários para melhor descrever as regras que regem a sua comunicação e acoplamento e a entender melhor as suas funções.
Aqui, usando o software de análise de imagem (ex., ImageJFIJI), descrevemos um método para analisar imagens confocal de redes hamartomas reveladas pela tintura-acoplamento. Estes métodos permitem 1) uma detecção automatizada e imparcial de pilhas etiquetadas, 2) cálculo do tamanho da rede, 3) cálculo da orientação preferencial da tintura espalhar dentro da rede e 4) reposicionamento da rede dentro da área de interesse .
Esta análise pode ser usada para caracterizar redes hamartomas de uma determinada área, comparar as redes de diferentes áreas associadas a diferentes funções ou comparar redes obtidas em condições diferentes que têm efeitos diferentes sobre o acoplamento. Estas observações podem levar a importantes considerações funcionais. Por exemplo, analisamos as redes hamartomas de um núcleo trigeminal, onde anteriormente mostramos que hamartomas acoplamento é essencial para a capacidade dos neurônios mudar seus padrões de fuzilamento de tónico para ruptura rítmica1. Ao medir o tamanho, confinamento e orientação preferencial das redes hamartomas esse núcleo, podemos construir hipóteses sobre domínios funcionais que eles delimitam. Vários estudos sugerem que várias outras áreas do cérebro, incluindo o córtex de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos e núcleos sensoriais no tálamo e no córtex visual, para citar alguns, podem beneficiar de uma análise semelhante.
Introdução
Muitos estudos têm descrito como o diálogo do neurônio-astrocyte em um nível celular sub ou sináptico pode ter implicações em funções neuronais e a transmissão sináptica. Está bem estabelecido que astrócitos são sensíveis ao redor de atividade neuronal; na verdade, eles possuem receptores para muitos neurotransmissores incluindo glutamato, GABA, acetilcolina e ATP (ver comentários publicados anteriormente2,3,4). Em troca, hamartomas processa sináptica elementos ensheath e influência de atividade neuronal ambos lá e em locais extrasynaptic regulação homeostase iónica extracelu....
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Protocolo
Todos os procedimentos de morada pelas regras institutos canadenses de pesquisa em saúde e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados com animais da Universidade de Montreal.
1. preparação de fatias de cérebro de rato
- Prepare 1 L de uma solução baseada em sacarose (tabela 1) e 1 litro de líquido de cerebral-espinhal artificial padrão (aCSF) (tabela 2).
- Bolha a solução de sacarose com uma mistura de 95% O2 e 5% CO2 (carbogênio) por 30 min antes de colocá-lo em-80 ° C por cerca de 30 min, até que a solução é frio, mas não totalmente congelada. Use este sacarose gel....
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Resultados
Acoplamento entre as células do cérebro não é estático, mas prefiro dinamicamente regulamentado por muitos fatores. Os métodos descritos foram desenvolvidos para redes hamartomas reveladas sob diferentes condições de analisar e entender sua organização em NVsnpr. Estes resultados foram já publicados1. Biocytin enchimento de astrócitos único foram realizadas na parte dorsal do NVsnpr em três condições diferentes: em repouso (em controlar as condições na ausência de .......
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Discussão
Existe um número de métodos eletrofisiológicos para avaliar funcional acoplamento entre astrócitos23,24. No entanto, esses métodos não fornecem informações sobre o arranjo anatômico das redes hamartomas. Vários estudos já mostraram que "corante ou marcador-acoplamento", como feito aqui, ocorre apenas em uma fração de juntamente com as células que são detectadas por métodos eletrofisiológicos25,26,
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é financiado por institutos canadenses de pesquisa saúde, Grant/prêmio número: 14392.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produtos químicos Fisher NaCl | S671-3 | ||
| KCl | Produtos químicos | P217-500 | |
| KH2PO4 | Produtos químicos Fisher | P285-500 | |
| MgSO4 | Fisher Produtos químicos | M65-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Produtos químicos | S233-500 | |
| C6H12O6 Dextrose anidra | Fisher Chemicals | D16-500 | |
| CaCl2 di-hidratado | Sigma | C70-500 | |
| Sacarose | Sigma S9378 | ||
| Sal de potássio de ácido D-glucônico | Sigma | G45001 | |
| MgCl2 anidro | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| ATPTris Sal | Sigma | A9062 | |
| GTPTris Sal | Sigma | G9002 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| Carbenoxolone dissódico | sal Sigma | C4790 | |
| complexo avidina-biotina: kit ABC | Vestor laboratories | PK-4000 | |
| Streptavidine-alexa 594 | Sondas Moleculares | S11227 | |
| Triton | Fisher Chemicals | BP151-500 | |
| Xileno | Fisher Chemicals | X5-1 | |
| Meio de montagem aquoso 1: Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Meio de montagem de resina sintética à base de toluen: Permount | Fisher Chemicals | SP15-100 | |
| Slide Drying Bench | Fisherbrand | 11-474-470 | |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Vidro de cobertura do microscópio | Fisherbrand | 12-544A | |
| Lâmina de microscópio ColorFrost | Fisherbrand | 12-550-413 | |
| PFA | Fisherchemicals | 04042-500 | |
| Olympus FluoView FV 1000 Microscópio confocal | Lente | ||
| 40X | Lente | Olympus LUMPLFLN40XW | |
| 20X | Lente | Olympus XLUMPLFL20XW | |
| 4X | Micropipeta Olympus | XLFLUOR4X/340 | |
| extrator | Sutter Instrument | P97 | |
| Micromanipulador | Sutter Instrument | MP 225 | |
| Câmera CCD | Sony | CX-ST50 | |
| Monitor preto e branco | Sony | SSM-125 | |
| Digidata | Molecular devices | 1322A | |
| Patch Clamp amplificador | Axon instrument | Mulitclamp 700A | |
| Software de aquisição de eletrofisiologia | Dispositivos moleculares | pClamp 8 | |
| Software de análise de eletrofisiologia | Dispositivos moleculares | Clampfit 8 | |
| Software de análise de imagem | ImageJFIJI | Software de código aberto. Versão FIJI incluindo pacote plug-in. | |
| Editor de imagens vetoriais | Adobe | Illustrator CS4 | |
| Aplicativo de planilha | Microsoft Office | Excel 2010 |
Referências
- Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus. Glia. 66 (2), 311-326 (2018).
- Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. Glial calcium: homeostasis and sign....
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Reimpressões e permissões
