Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.
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Artigo de método
Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de T helper 1 (Th1) células é uma maneira útil para avaliar o papel desempenhado pelas células T em uma resposta imune. Este protocolo descreve a diferenciação em vitro dos progenitores da medula óssea (BM) para obter granulócitos macrófagos colônia-estimulando factor (GM-CSF) derivado-células dendríticas (DCs). O protocolo descreve também a transferência adotiva de peptídeos ovalbumina (OVAp)-carregado DCs GM-CSF-derivados e as células T CD4 do ingênuo de ratos transgénicos OTII a fim de analisar na vivo ativação, proliferação e diferenciação de células Th1 do transferidas as células T CD4. Este protocolo contorna a limitação de puramente na vivo métodos impostas pela incapacidade de manipular ou selecione população celular estudado especificamente. Além disso, este protocolo permite que estudos em um ambiente em vivo , evitando assim alterações funcionais fatores que podem ocorrer em vitro e inclusive a influência dos tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos. O protocolo é uma ferramenta útil para gerar mudanças em DCs e T células que modificar adaptáveis respostas imunes, potencialmente, fornecendo resultados importantes para compreender a origem ou o desenvolvimento de inúmeras doenças associadas imunes.
Introdução
Células T CD4 e apresentadoras de antígenos (APCs) de células como DCs são necessários mediadores da imunidade a patógenos microbianos1,2. Nos órgãos linfoides secundários, as células T CD4 são ativadas mediante reconhecimento de antígenos específicos apresentados por APCs3,4,5. Células CD4 T ativadas proliferaram e diferenciarem em células de Th effector específicos distintos que são necessárias para o desenvolvimento de uma correta resposta imune adaptativa6,7
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Protocolo
Procedimentos experimentais foram aprovados pela Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e da Comunidad Autónoma de Madrid, em conformidade com diretrizes de espanhol e europeus. Os ratos foram criados em condições (SPF) livre de patógeno específico e foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono (CO2).
1. isolamento de células de medula óssea de rato de tíbias e fêmures
Nota: A cepa de rato C57BL/6 congenic carrega o diferencial de leucócitos marcador Ptprcum, geralmente reconhecido como CD45.1 ou Ly5.1, Considerando que estirpes de tip....
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Resultados
A Figura 1 ilustra as etapas descritas neste protocolo. A Figura 2 ilustra o isolamento e a cultura de células de rato BM. A adição de GM-CSF e LPS para essas culturas permite a geração em vitro e maturação de DCs. a Figura 3 ilustra a análise de citometria de fluxo da diferenciação e maturação de obtidos DCs DCs. OVAp-carregado derivado de GM-CSF BM e célula vital isolado rastreamento manch.......
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Discussão
Este protocolo permite a caracterização da capacidade de DCs BM-derivado de modular a ativação, proliferação e diferenciação das células T CD4 de ingênuo. Além disso, ele pode também ser usado para avaliar a suscetibilidade de células T CD4 a modulação por DCs BM-derivado. Com este protocolo, mudanças nestes eventos podem ser medidos em vivo.
Dependendo da hipótese sob investigação, várias combinações de células T e DCs podem ser usadas. Por exemplo, um pode analisar as consequências .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Simon Bartlett para edição inglesa. Este estudo foi suportado por concessões do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), o programa de Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; com o co-financiamento do Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). A CNIC é suportado pelo Ministério da economia, da indústria e competitividade (MEIC) e Fundação Pro CNIC e é um Severo Ochoa centro de excelência (SEV-2015-0505). RTF é fundada pela Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG por ISCIII, BHF pelo Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G pelo ISCIII Miguel Servet programa e imas12.<....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Etanol | VWR Chemicals | 20.824.365 | 5 L |
| Tesoura | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Fórceps | Fine Science Tools (FST) | 11000-13 | |
| Pinça Fina | Ferramentas de Ciências Finas (FST) | 11253-20 | |
| Bisturi | (FST) | 10020-00 | Caixa de 100 lâminas |
| Soro Fetal Bovino | SIGMA | F7524 | |
| Penicilina/estreptomicina | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Placas de Petri estéreis | Falcon | 353003 | |
| agulha de calibre 25 | BD Microlance 3 | 300600 | |
| Seringa de 1 ml | Novico | N15663 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | Falcon | 352096 | |
| Tubos cônicos de 50 ml | Falcon | 352098 | |
| 70 μ m filtro de nylon BD | Falcon | 352350 | |
| Tampão de lise do sangue vermelho | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Albumina de soro bovino | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Placas de cultura | Falcon | 353003 | |
| Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoetanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Piruvato de sódio | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamina | LONZA | BE17-605E | |
| Fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos murinos recombinantes (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolissacarídeo (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| de 96 poços | Costar | 3799 | |
| v450 anticorpo CD11b anti-camundongo | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anticorpo CD64 anti-camundongo | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-camundongo CD115 | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse Anticorpo CD11c | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-camundongo MHCII | BioLegend | 125507 | |
| APC anticorpo CD86 anti-camundongo | BioLegend | 105011 | |
| APC anticorpo CD80 de camundongo | BioLegend | Tubos de | |
| Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL | |
| OTII Peptídeo | de ovoalbuminaInvivoGen | 323-339 | |
| anti-camundongo biotinilado CD8&alfa; anticorpo | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-camundongo biotinilado anticorpo IgM biotinilado | BioLegend 406503 | ||
| anti-camundongo biotinilado anticorpo B220 | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-camundongo biotinilado CD19 anticorpo | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anticorpo anti-camundongo biotinilado MHCII (I-Ab) | BioLegend | 115302 | |
| anti-camundongo biotinilado anti-camundongo | |||
| 103003 | |||
| 117303 | anti-camundongo anti-camundongo biotinilado anti-camundongo | ||
| Anticorpo CD25 | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anticorpo DX5 biotinilado de camundongo | BioLegend | 108903 | |
| microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Separador de células magnéticas | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separador |
| Colunas de separação | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anticorpo CD4 anti-rato | BioLegend | 100408 | |
| APC anticorpo CD3 anti-rato | BioLegend | 100235 | |
| FITC anticorpo CD8 anti-rato | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anticorpo CD25 anti-rato | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anticorpo CD69 anti-rato | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-rato CD45.1 anticorpo | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-rato CD45.1 anticorpo | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-rato CD45.1 anticorpo | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-rato CD45.2 anticorpo | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomicina | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Miristato 13 (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldeído | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Tampão de permeabilização intracelular | eBioscience | 00-8333 | |
| Anticorpo IFNg anti-camundongo APC | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Bloco FC (anti-camundongo CD16 / CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6. Camundongos SJL CD45.1 | O Laboratório Jackson | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Analisador de Células | BD Biosciences | 649225 | |
| Solução DAPI | Thermofisher | 62248 |
Referências
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lym....
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Reimpressões e permissões
