Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.
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Artigo de método
Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de T helper 1 (Th1) células é uma maneira útil para avaliar o papel desempenhado pelas células T em uma resposta imune. Este protocolo descreve a diferenciação em vitro dos progenitores da medula óssea (BM) para obter granulócitos macrófagos colônia-estimulando factor (GM-CSF) derivado-células dendríticas (DCs). O protocolo descreve também a transferência adotiva de peptídeos ovalbumina (OVAp)-carregado DCs GM-CSF-derivados e as células T CD4 do ingênuo de ratos transgénicos OTII a fim de analisar na vivo ativação, proliferação e diferenciação de células Th1 do transferidas as células T CD4. Este protocolo contorna a limitação de puramente na vivo métodos impostas pela incapacidade de manipular ou selecione população celular estudado especificamente. Além disso, este protocolo permite que estudos em um ambiente em vivo , evitando assim alterações funcionais fatores que podem ocorrer em vitro e inclusive a influência dos tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos. O protocolo é uma ferramenta útil para gerar mudanças em DCs e T células que modificar adaptáveis respostas imunes, potencialmente, fornecendo resultados importantes para compreender a origem ou o desenvolvimento de inúmeras doenças associadas imunes.
Introdução
Células T CD4 e apresentadoras de antígenos (APCs) de células como DCs são necessários mediadores da imunidade a patógenos microbianos1,2. Nos órgãos linfoides secundários, as células T CD4 são ativadas mediante reconhecimento de antígenos específicos apresentados por APCs3,4,5. Células CD4 T ativadas proliferaram e diferenciarem em células de Th effector específicos distintos que são necessárias para o desenvolvimento de uma correta resposta imune adaptativa6,7. Controle desses processos é fundamental para produzir uma defesa adequada adaptável que mata o patógeno sem produzir dano de tecido prejudicial8. Células th são definidas de acordo com a expressão ou a produção de moléculas de superfície, fatores de transcrição e citocinas efetoras e executam funções essenciais e precisas em resposta a agentes patogénicos1. Células do subconjunto de células Th1 expressam o fator de transcrição T-aposta e a citocinas interferon γ (relato) e participarem na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares1. Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 é um meio útil de avaliar a T células dramatização em uma resposta imune.
Este protocolo permite que vivo em análise da capacidade de in vitro -gerado DCs BM-derivado de modular o ativação, proliferação e diferenciação de Th1 de células T CD4 de ingênuo. O protocolo também serve para avaliar a capacidade das células T CD4 de ingênuo para ser ativado, induzidas a proliferar e Th1 diferenciadas (Figura 1). Este protocolo versátil contorna a incapacidade especificamente manipular ou selecione população celular estudados em puramente na vivo protocolos. Os efeitos de diversas moléculas e tratamentos em controladores de domínio podem ser estudados usando BM de camundongos geneticamente modificados5 ou tratar ou manipular geneticamente isolados de células BM9. Da mesma forma, respostas de células T podem ser exploradas através da obtenção de células T para transferência adotiva de diferentes fontes ou após várias manipulações3,8,10.
As principais vantagens do presente protocolo são dupla. Ativação de célula t, proliferação e diferenciação de células Th1 são analisados com uma abordagem de citometria de fluxo; e isto é combinado com estudos em vivo , evitando, assim, alterações que podem ocorrer em vitro , incluindo tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos11.
O uso de corantes vitais é uma técnica amplamente utilizada para controlar a proliferação celular, evitando o uso da radioactividade. A medida da proliferação com estes reagentes baseia-se na diluição do corante após a divisão celular. Além disso, esses corantes podem ser detectados em vários comprimentos de onda e são facilmente analisadas por citometria de fluxo em combinação com vários anticorpos fluorescentes ou marcadores. Destacamos a utilidade do presente protocolo, mostrando como a ativação de célula T, proliferação e diferenciação de células Th1 podem ser analisados por citometria de fluxo.
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Protocolo
Procedimentos experimentais foram aprovados pela Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e da Comunidad Autónoma de Madrid, em conformidade com diretrizes de espanhol e europeus. Os ratos foram criados em condições (SPF) livre de patógeno específico e foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono (CO2).
1. isolamento de células de medula óssea de rato de tíbias e fêmures
Nota: A cepa de rato C57BL/6 congenic carrega o diferencial de leucócitos marcador Ptprcum, geralmente reconhecido como CD45.1 ou Ly5.1, Considerando que estirpes de tipo selvagem C57BL portadores do alelo Ptprcb , conhecido como CD45.2 ou Ly5.2. Variantes cd45.1 e CD45.2 podem ser distinguidas por citometria de fluxo, usando anticorpos. Ratos cd45.1, CD45.2 e CD45.1/CD45.2 podem ser usados como fontes de célula ou como destinatários para transferência adotiva, permitindo o rastreamento das populações distintas de células por citometria de fluxo. Utilizar preferencialmente idade- e correspondência sexo masculinos ou femininos de ratos abaixo de 12 semanas de idade.
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Preparação dos fêmures e tíbias
- Eutanásia em ratos usando o protocolo aprovado pelo Comitê institucional cuidados com animais.
- Desinfecte os membros traseiros pulverizando a superfície animal com etanol a 70%.
- Uso de bisturis, pinças e tesoura esterilizada. Com um bisturi, fazer um corte na pele e remover a pele da parte distal do mouse incluindo a pele que cobre as extremidades posteriores. Tirar a pele ao redor do músculo da panturrilha inferior e retire a pele das pernas totalmente (Figura 2A, 2B).
- Separe o músculo quadríceps do fémur utilizando um bisturi. Desarticular a articulação do quadril sem quebrar a cabeça do fêmur. Remova os músculos da tíbia usando um bisturi (Figura 2, 2D). Separe o fêmur a tíbia sem quebrar as extremidades do osso.
- Manter os ossos em uma placa de Petri contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x gelada.
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Isolamento de célula
Nota: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas sob uma capa de cultura e com material estéril para evitar contaminação.- Em uma placa de Petri estéril, cuidadosamente, corte fora as extremidades proximais e distais de cada osso com um bisturi.
- Lave os ossos repetidamente com um volume total de 10 mL de quente meio RPMI completo (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicilina/estreptomicina, 20 mM HEPES, 55 µM 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e 2 mM L-glutamina). Limpe os ossos de ambas as extremidades, usando uma agulha 25g anexada a uma seringa de 1 mL.
- Transferi o effluate para um tubo cônico de 50 mL, equipado com um filtro de web de nylon 70 do µm. Cuidadosamente, desalojar conglomerados de detritos e célula por agitação suave e pipetagem.
- Centrifugar a suspensão de célula 250 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise de eritrócitos-sangue frio (0,15 M NH4Cl + 1mm KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH ajustado a 7.2 com 1 N HCl, 0,4 µm estéril, filtrada e armazenadas a 4 ° C). Manter-se no gelo por 5 min com agitação manual.
- Adicione 10 mL de tampão frio (1 x salina tamponada fosfato (PBS) + 2 mM EDTA + 2% albumina de soro bovino (BSA)) para inativar e desbotar a Lise-glóbulos vermelhos.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Lavam-se células com 25 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo. Mix 50 µ l de suspensão de célula 1:1 com trypan azul. Determine o número de células em uma câmara de contagem ao microscópio. Calcular o número de células usando a fórmula: células/mL = [(célula não manchadas de contagem/4) x 2 x 10.000]12.
Nota: Este método produz 40 x 106 a 60 x 106 óssea de células de medula por 8 não infectados ao rato de C57BL/6 12 semanas de idade. - Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
2. DC diferenciação, maturação e carregamento de antígeno
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Célula de BM colheita
- As sementes da cultura completa em placas de superfície 6-poços ultra-low-fixação em 106 células por mL de meio, normalmente em 5 mL por bem. Os macrófagos diferenciados irão anexar para as placas de cultura. Depois de 12 h, transferi o sobrenadante, que contém principalmente monócitos, para limpar as placas 6-poço, descartando as placas 6-poços antigas com os macrófagos aderidas.
- Para promover a diferenciação celular, cultura das células não-aderentes em 5 x 105 células por mL em tipicamente 5 mL por alvéolo de meio RPMI completo contendo 20 ng/mL obtidos comercialmente recombinante murino GM-CSF em 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2) e Observe-se diariamente.
- Cada 3 dias, spin para baixo de células suspensas e coletar as células aderentes com 5 mM de EDTA em PBS e spin para baixo. Combinar e ressuspender em 5 x 105 células/mL de meio fresco contendo 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- No dia 8, coletar células aderentes e destacadas como acima e ressuspender em 5 x 105 células/mL em média com 20 ng/mL GM-CSF e 20 lipopolissacarídeo ng/mL (LPS) para 24 h em uma cultura de tecidos não-tratados Petri estéril, para induzir a alta MHC-II , Expressão de CD80 e CD86.
- Diferenciação de seleção DC por citometria de fluxo, conforme indicado no passo 2.2.
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Diferenciação de citometria de fluxo e análise de maturação.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C. Repita duas vezes.
- Receptores Fc bloco incubando o centrifugado ressuspensão em rato Fc receptor bloqueador (purificada anti anticorpo de2b CD16/CD32 IgG de rato) por 15 min a 4 ° C, de acordo com as instruções do fabricante.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Para cada teste, resuspenda 250.000 células em 300 µ l de tampão de citometria de fluxo (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) a 4 ° C.
- Transferi 30 µ l de solução de célula por alvéolo para uma 96--placa.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e adicionar 30 µ l de contendo anticorpos buffer para cada bem seguindo as indicações do fabricante. Incubar as células com anticorpos por 20 min a 4 ° C.
Nota: Normalmente utilizados marcadores para DCs, monócitos e macrófagos são CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 e CD86 (Figura 3). - Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e Resuspenda em 200 µ l por alvéolo do buffer de citometria de fluxo frio contendo um marcador para excluir células mortas (por exemplo, o iodeto de propidium, ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou um corante reativo-amina ) no concentração recomendada13 do fabricante.
- Monitorar a diferenciação celular, transferindo as amostras para tubos de citometria de fluxo e realizar a análise de citometria de fluxo excluindo células mortas nos dias 0, 3, 6 e 9.
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Carregamento de antígeno de DC.
- No dia 8, Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as bolinhas no meio de 200 µ l (RPMI + 10% FBS sem antibióticos). Repita duas vezes.
- Incubar as DCs com 10 µ g/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) por 1 x 107 DCs em 1 mL de meio (RMPI + 1% FBS) em um tubo de plástico pelo menos 30 min a 37 ° C. Use o DCs OVAp não-carregado como uma condição de controle negativo.
- Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e Resuspenda as pelotas em 200 µ l RPMI o meio completo. Repita duas vezes.
- Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as bolinhas no meio de 200 µ l (RPMI + 10% FBS) 2 x 106 células/ml.
3. isolamento de células T Naïve CD4 OTII ratos
Nota: Este método produz aproximadamente 100 x 106 spleenocytes por 8 não infectados ao rato de C57BL/6 12 semanas de idade. Machos e fêmeas podem ser usadas. Células T CD4 podem ser isoladas de baço ou gânglios linfáticos; Células T CD4 representam cerca de 25% e 50% das células nesses órgãos, respectivamente. Execute as seguintes etapas em condições estéreis.
- Isolar o inguinais, axilares, braquiais, cervicais e mesentéricos linfonodos e baço de ratos transgénicos OTII (Figura 4) e transferi-los para uma placa de Petri contendo 10 mL de meio RPMI completo de plástico.
- Lave o filtro de célula com 2 mL de meio RPMI completo e retire o tubo de 50 mL. Transferência de linfonodos e baço de um coador de célula de 70 µm colocados em um tubo de 50 mL. Homogeneizar usando um êmbolo da seringa (Figura 5) e adicionar médio de 15 mL.
- Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet em 15 mL de meio RPMI completo. Repita duas vezes.
- Para suspensão de células de baço, resuspenda o pellet de células e lisar os glóbulos vermelhos, como indicado no passo 1.2.5.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Lavam-se células com 25 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min à RT
- Ressuspender as células em 5 mL de meio. Mix 50 µ l de suspensão de célula 1:1 com Trypan azul. Determine o número de células utilizando uma câmara de contagem ao microscópio. Calcular o número de células usando a fórmula: células/mL = [(célula não manchadas de contagem/4) x 2 x 10.000]12.
- Repita a etapa 2.2.2.
- Seguindo as instruções do fabricante, Incube as celulas com diluições de 1:800 de anticorpos biotinilado CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 e DX5 para 30 min no gelo para mais tarde uma seleção negativa de linfócitos T CD4.
- Seguindo as instruções do fabricante e com base no número de células e a capacidade dos grânulos, calcular a quantidade necessária de microbeads magnéticos streptavidin-revestido e isolar as células T CD4, usando um separador magnético da célula e o adequado colunas de separação.
- Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo e mantê-los no gelo durante a contagem de células vivas como descrito na etapa 3.7.
- Extrair a 2 x 105 células e verificar a pureza das células coletadas usando anti-CD4 e CD8 CD3, B220 anticorpos fluorescentes em um citômetro de fluxo usando diluições de anticorpo fabricante-recomendando.
- Para manchar as pilhas de T de CD4/OTII isolado ingênuo, resuspenda 106 células no buffer de 500 µ l (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Preparar 500 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) contendo duas vezes a concentração final de fabricante-recomendado de corante marcador de célula vital. Misture as duas soluções adicionando lentamente a solução de rastreamento de celular para a suspensão de eritrócitos. Incube as celulas por 5 min a 37 ° C.
- Lavar as células com 5 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C. Repita duas vezes. Ressuspender as células em 1 mL de meio RPMI completo a 1 x 107células/mL.
4. in Vivo a ativação, proliferação e ensaio de diferenciação de células Th1
Nota: O célula vital traçador corante carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e outros succinimidil éster-baseado corantes, que são excitados e emitem fluorescência em diferentes comprimentos de onda, são amplamente utilizados para avaliar a proliferação de linfócitos pelo fluxo citometria devido a sua intensidade de fluorescência de alta, longa vida, baixa variabilidade e baixa toxicidade14.
- Enviaram transferi por via intravenosa (i.v.) 1 x 106 célula viva vital traçador ingênuo manchadas de tinta CD4/OTII as células T em 100 µ l de PBS por rato. Rotulado de células T podem ser transferidas enviaram pela veia da cauda ou injeção retro-orbital15; em ambos os casos, as células vão em casa para órgãos linfoides (figura 6A).
- Desafie os ratos destinatários um dia mais tarde enviaram Transferindo 100.000 LPS envelhecido carregado OVAp DCs por via subcutânea (s.i.) dos footpads (Figura 6B).
- Colheita de linfonodos poplíteos de ratos destinatários e processá-los até a obtenção de suspensões de célula única, seguindo as mesmas etapas, conforme descritas em 3.1 e 3.2. Fazer isso no pós-imunização de dia 2 para medir a ativação de células T CD4/OTII e no dia 5 para medir a proliferação e diferenciação de células Th1.
- Para analisar a ativação de células T no dia 2, mancha células com anticorpos fluorescentes contra CD4, CD25 e CD69 (opcionalmente, CD45.1 e CD45.2) e determinar a porcentagem de C69+CD25+ T células na população CD4. Análise por citometria de fluxo (Figura 7).
- Para verificar a proliferação de células T no dia 5, mancha de células usando anticorpos fluorescentes apropriados contra CD4 e, opcionalmente, CD45.1 e CD45.2. Analise a decadência do sinal vital célula traçador corante na população CD4 por citometria de fluxo (Figura 8). Vários parâmetros podem ser determinados nestes estudos, tais como o número de divisões celulares sofrido pelas células marcadas com o corante marcador de célula vital, a percentagem de células divisórias em cada pico de fluorescência e a percentagem de células divisórias na célula total população.
- Para determinar a diferenciação de células Th1 no dia 5, 400.000 células de placa por alvéolo de uma placa de 96 poços em 200 µ l de meio RPMI completo contendo 1 ionomycin µM e 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acetato (PMA) para 6 h a 37 ° C na incubadora. Para a última 4 h, adicione 3 – 10 µ g/mL brefeldin A para bloquear a secreção de citocinas ao meio.
- Centrifugar as placas durante 5 min à 250 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por inversão rápida da placa de 96 poços.
- Repita a etapa 2.2.2.
- Manche as membranas celulares incubando por 15 min a 4 ° C em 30 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) que contém os anticorpos para CD4 e, opcionalmente, CD45.1 e CD45.2 em diluições recomendadas fabricante. Lavar as células adicionando 150 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) e centrifugar as placas durante 5 min à 250 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Corrigir as células adicionando-se 100 µ l de paraformaldehyde/1% 2% sacarose por 20 min no centrifugador do RT. as placas por 5 min a 1.000 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Permeabilize as células pela adição de 50 µ l de tampão de permeabilização intracelular (1X PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponina) e incube por 30 min a 4 ° C.
- Adicione 150 µ l de PBS e centrifugar por 5 min a 1.000 x g em RT. descartar o sobrenadante.
- Mancha de citocinas intracelulares adicionando 30 µ l de conjugado anti anticorpo relato fluoróforo no buffer (PBS + 0,1% saponina) e incube por 30 min em RT
- Lave as células adicionando 150 µ l de tampão (PBS + 0,1% saponina). Centrifugar as placas durante 5 min à 1.000 x g em RT e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes.
- Analise as populações de células por citometria de fluxo (Figura 8).
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Resultados
A Figura 1 ilustra as etapas descritas neste protocolo. A Figura 2 ilustra o isolamento e a cultura de células de rato BM. A adição de GM-CSF e LPS para essas culturas permite a geração em vitro e maturação de DCs. a Figura 3 ilustra a análise de citometria de fluxo da diferenciação e maturação de obtidos DCs DCs. OVAp-carregado derivado de GM-CSF BM e célula vital isolado rastreamento manch...
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Discussão
Este protocolo permite a caracterização da capacidade de DCs BM-derivado de modular a ativação, proliferação e diferenciação das células T CD4 de ingênuo. Além disso, ele pode também ser usado para avaliar a suscetibilidade de células T CD4 a modulação por DCs BM-derivado. Com este protocolo, mudanças nestes eventos podem ser medidos em vivo.
Dependendo da hipótese sob investigação, várias combinações de células T e DCs podem ser usadas. Por exemplo, um pode analisar as consequências ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Simon Bartlett para edição inglesa. Este estudo foi suportado por concessões do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), o programa de Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; com o co-financiamento do Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). A CNIC é suportado pelo Ministério da economia, da indústria e competitividade (MEIC) e Fundação Pro CNIC e é um Severo Ochoa centro de excelência (SEV-2015-0505). RTF é fundada pela Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG por ISCIII, BHF pelo Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G pelo ISCIII Miguel Servet programa e imas12.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Etanol | VWR Chemicals | 20.824.365 | 5 L |
| Tesoura | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Fórceps | Fine Science Tools (FST) | 11000-13 | |
| Pinça Fina | Ferramentas de Ciências Finas (FST) | 11253-20 | |
| Bisturi | (FST) | 10020-00 | Caixa de 100 lâminas |
| Soro Fetal Bovino | SIGMA | F7524 | |
| Penicilina/estreptomicina | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Placas de Petri estéreis | Falcon | 353003 | |
| agulha de calibre 25 | BD Microlance 3 | 300600 | |
| Seringa de 1 ml | Novico | N15663 | |
| Tubos cônicos de 15 ml | Falcon | 352096 | |
| Tubos cônicos de 50 ml | Falcon | 352098 | |
| 70 μ m filtro de nylon BD | Falcon | 352350 | |
| Tampão de lise do sangue vermelho | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Albumina de soro bovino | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Placas de cultura | Falcon | 353003 | |
| Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoetanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Piruvato de sódio | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamina | LONZA | BE17-605E | |
| Fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos murinos recombinantes (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolissacarídeo (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| de 96 poços | Costar | 3799 | |
| v450 anticorpo CD11b anti-camundongo | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anticorpo CD64 anti-camundongo | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-camundongo CD115 | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse Anticorpo CD11c | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-camundongo MHCII | BioLegend | 125507 | |
| APC anticorpo CD86 anti-camundongo | BioLegend | 105011 | |
| APC anticorpo CD80 de camundongo | BioLegend | Tubos de | |
| Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL | |
| OTII Peptídeo | de ovoalbuminaInvivoGen | 323-339 | |
| anti-camundongo biotinilado CD8&alfa; anticorpo | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-camundongo biotinilado anticorpo IgM biotinilado | BioLegend 406503 | ||
| anti-camundongo biotinilado anticorpo B220 | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-camundongo biotinilado CD19 anticorpo | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anticorpo anti-camundongo biotinilado MHCII (I-Ab) | BioLegend | 115302 | |
| anti-camundongo biotinilado anti-camundongo | |||
| 103003 | |||
| 117303 | anti-camundongo anti-camundongo biotinilado anti-camundongo | ||
| Anticorpo CD25 | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anticorpo DX5 biotinilado de camundongo | BioLegend | 108903 | |
| microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Separador de células magnéticas | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separador |
| Colunas de separação | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anticorpo CD4 anti-rato | BioLegend | 100408 | |
| APC anticorpo CD3 anti-rato | BioLegend | 100235 | |
| FITC anticorpo CD8 anti-rato | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anticorpo CD25 anti-rato | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anticorpo CD69 anti-rato | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-rato CD45.1 anticorpo | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-rato CD45.1 anticorpo | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-rato CD45.1 anticorpo | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-rato CD45.2 anticorpo | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomicina | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Miristato 13 (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldeído | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Tampão de permeabilização intracelular | eBioscience | 00-8333 | |
| Anticorpo IFNg anti-camundongo APC | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Bloco FC (anti-camundongo CD16 / CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6. Camundongos SJL CD45.1 | O Laboratório Jackson | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Analisador de Células | BD Biosciences | 649225 | |
| Solução DAPI | Thermofisher | 62248 |
Referências
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
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