Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

Resumo

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

Resumo

Um protocolo é apresentado para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) que expressam endógenas proteínas fundidas para etiquetas fluorescentes N - ou C-terminal em-frame. O sistema CRISPR/Cas9 procariótico (regularmente intercalado curto clusterizado palíndromo 9 repetições/CRISPR-associado) pode ser usado para introduzir grandes sequências exógenas em Genômica loci através de reparação homologia dirigida (HDR). Para alcançar o desejado bater-em, este protocolo emprega o ribonucleoprotein (RNP)-onde selvagem tipo Streptococcus pyogenes Cas9 proteína, sintético-parte 2 guia RNA (gRNA) e um plasmídeo de modelo do doador são entregues para as células através de abordagem baseada na eletroporação. Presumidamente editadas celulas que expressam as proteínas fluorescente etiquetadas são enriquecidas pela célula de fluorescência ativada classificação (FACS). Clonais linhas então são geradas e podem ser analisadas para resultados precisos de edição. Introduzindo a tag fluorescente no locus genômico do gene de interesse, a Localização subcellular resultante e a dinâmica da proteína de fusão pode ser estudada sob controlo regulamentar endógeno, uma melhoria fundamental sobre superexpressão convencional sistemas. O uso de hiPSCs como um sistema modelo para gene tagging oferece a oportunidade de estudar as proteínas etiquetadas em células diploides, nontransformed. Desde que o hiPSCs pode ser diferenciada em vários tipos de células, essa abordagem oferece a oportunidade de criar e estudar proteínas etiquetadas em uma variedade de contextos isogénicas de celulares.

Introdução

O uso de estratégias de edição de genoma, especialmente CRISPR/Cas9, para estudar processos celulares está se tornando cada vez mais acessível e valioso^{1,2,3,4,5, 6 , 7}. uma das muitas aplicações de CRISPR/Cas9 é a introdução (através de reparação de homologia dirigida (HDR)) de grandes sequências exógenas como GFP em específico loci genômicos que então serve como repórteres para a atividade de um gene ou a proteína produto⁸ . Esta técnica pode ser usada para associar uma sequência da proteína fluorescente a um frame de leitura aberto endógeno onde a proteína de fusão endogenamente regulada a resultante pode ser usada para visualizar a Localização subcellular e a dinâmica da proteína de interesse^{5 ,6,9,10,11}. Enquanto proteínas endogenamente etiquetadas oferecem muitos benefícios em comparação com sistemas de superexpressão, inserindo grandes sequências do genoma humano é um processo ineficiente, normalmente exigindo uma seleção ou estratégia de enriquecimento para obter uma população de células que podem ser facilmente estudados^5,12.

Este protocolo descreve a inserção de uma sequência de DNA, a codificação de uma proteína fluorescente (FP) em um locus genômico desejado. O protocolo inclui design e entrega de plasmídeo de modelo o doador e o ribonucleoprotein (RNP) complexo (proteína selvagem tipo S. pyogenes Cas9 combinada com sintético CRISPR RNA (crRNA) e ativando o trans crRNA (tracrRNA)). Também descrito é o enriquecimento das células presumidamente editados via celular de fluorescência ativada (FACS) de classificação e o processo de geração de linha celular clonal. Até à data, este método tem sido usado para gerar linhas de hiPSC com monoallelic ou etiquetas (raramente) bi-alélico proteína verde fluorescente (GFP) rotulagem 25 proteínas representando as principais estruturas celulares. As células editadas resultantes destes esforços foram confirmadas para ter a inserção genética esperada, expressar uma proteína de fusão localização corretamente e manter pluripotência e um cariótipo estável¹² (e dados não publicados). Esse método também tem sido usado para gerar vários outros single e dual (duas proteínas diferentes, marcadas na mesma célula) edição de populações de hiPSCs (dados não publicados).

IPSCs humanas derivadas de um doador saudável foram escolhidos para estes esforços de genoma-edição porque, ao contrário de muitas linhas de celulares convencionais, são diploides, dos estável, não-transformadas e proliferativa. Essas propriedades fornecem um modelo atraente para estudar Biologia celular fundamentais e modelagem de doença. Além disso, o potencial de diferenciação de hiPSCs fornece a oportunidade de estudar vários estádios de desenvolvimento em paralelo em várias linhagens e tipos de célula usando células isogénicas, incluindo organoids, tecidos e modelos de "doença em um prato"¹³ de^{14, ,15}. Enquanto este protocolo foi desenvolvido para hiPSCs (linha do WTC), pode ser informativo para o desenvolvimento de protocolos utilizando outras linhas de células de mamíferos.

Protocolo

1. Design in Silico de crRNA e doador modelo plasmídeo para FP Knock-em

1. Obter a sequência de referência anotada de NCBI¹⁶ ou do UCSC Genome Browser¹⁷ (por exemplo, formato de GenBank) do gene de interesse e importá-lo para um software de bioinformática da escolha. Se a sequência do genoma do hospedeiro é conhecida por conter variações em relação a referência, incluem aqueles agora por ajustar a sequência de referência do software de Bioinformática (ver discussão).
2. Localize o local de inserção do FP desejado. Para tags do C-terminal, a sequência para a tag FP será introduzida entre a última base de códon a última e a primeira base do códon de parada. Para N-terminal de marcação, a sequência para a tag FP tipicamente será introduzida entre a última base do códon de início e a primeira base do próximo códon. Em alguns casos, como quando o códon de início é um exão único códon, ou onde uma sequência de sinal existe perto do terminal da proteína, o local de inserção do FP desejado pode estar situado em posição mais 3ʹ, enquanto continua a ser no quadro.
3. Uso 50 bp em cada lado do local de inserção desejada como a sequência de entrada para qualquer ferramenta de design de crRNA publicamente disponível. Uma vez 2-4 crRNA alvos identificados perto do local de inserção, anote os locais obrigatórios de crRNA e motivo protospacer adjacentes (PAM) sequências (NGG) do software de Bioinformática. Estes crRNAs serão usados para induzir quebras de encalhado dobro (veja a discussão para mais orientações sobre crRNA design).
   Nota: Sequências de crRNA personalizado podem ser enviadas para a síntese com um fornecedor comercial (recomendado), ou a sequência pode ser usada como ponto de partida para a concepção de uma estratégia de síntese de clonagem ou em vitro , que está além do escopo do presente protocolo (ver discussão ).
4. Para iniciar o plasmídeo de modelo do doador, usar 1KB de sequência rio acima do local de inserção desejado como o braço de homologia de 5ʹ (inclua o códon de início para inserções de N-terminal) e usar 1 kb de sequência a jusante do local de inserção desejado como o 3ʹ braço de homologia (inclua o codão stop para inserções do C-terminal). Bases entre os dois ramos de homologia não normalmente são omitidas. Incluindo as variantes específicas de linha de celular nos braços homologia preservará essas variantes genéticas nas células editadas resultantes.
5. Entre os dois ramos de homologia, inserir a sequência para o FP (ou outra batida-em sequência) e a sequência de vinculador (veja a discussão para mais orientações sobre linkers). Para tags do N-terminal, a sequência de vinculador deve ser diretamente 3ʹ do FP; para tags do C-terminal, a sequência de vinculador deve ser diretamente 5ʹ de FP.
6. Interromper o crRNA locais obrigatórios em plasmídeo de modelo o doador para evitar corte Cas9 de sequência de doador (veja a discussão para considerações quando alterar locais obrigatórios de crRNA). Se possível, perturbação do PAM para uma sequência diferente NGG ou NAG é preferencial. Alternativamente, introdução de mutações pontuais para três bases na região da semente da crRNA (10 bases proximais para o PAM) prevê-se que para suficientemente interromper a ligação crRNA. Alguns sites de ligação crRNA são perturbados pela introdução da sequência de FP no plasmídeo de modelo do doador; Certifique-se de que nenhum PAM ou região intacta ligação ainda existe nesses casos.
   Nota: In silico plasmídeo modelo de doador pode ser enviado para síntese do gene por um fornecedor comercial, ou pode ser usada como ponto de partida para a concepção de uma estratégia de clonagem, que está além do escopo do presente protocolo. Uma simples espinha dorsal como pUC19 ou pUC57 é suficiente.

2. ribonucleoprotein (RNP) de Transfeccao para CRISPR/Cas9 mediada Knock-em hiPSCs

Nota: No presente protocolo, o termo 'gRNA' descreve crRNA sintético e tracrRNA devidamente re-suspenso, quantificado e pre-complexado as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Completar todas as mídias com 1% penicilina estreptomicina. Orientações gerais de cultivo da linha de hiPSC do WTC são descritas mais detalhadamente em Allen célula Explorer^18,19. HiPSCs do WTC são utilizados no presente protocolo, mas com otimização adequada transfeccao, electroporation da RNP e plasmídeo de modelo do doador pode ser adaptado com sucesso para outros tipos de células.

1. Prepare-se 10 ações de trabalho µM de gRNA e selvagem tipo S. pyogenes Cas9 proteína^2,20; manter-se no gelo. Prepare-se 1 µ g / µ l trabalhando ações de plasmídeo de modelo do doador; manter à temperatura ambiente (RT). Use o tampão de pH 8.0 TE para todas as diluições.
2. Prepare um prato de cultura de tecidos de 6-Poços revestidos matriz com 5 mL de meio de crescimento fresco suplementado com inibidor ROCK 10 µM (Ri), por bem. Manter placa com mídia na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ até que esteja pronto para células de placa após o procedimento de transfeccao (máximo 2 h).
   Nota: Todas as placas com revestimento em matriz usadas no presente protocolo são feitas pela adição de que um volume de gelada Matrigel diluído 01:30 em DMEM/F12 criogênicos de acordo com o Instituto Allen para protocolo da célula ciência para cultivo do WTC hiPSC linha¹⁹.
3. Usando um reagente de dissociação suave de célula única conforme recomendado na Tabela de materiais, passagem hiPSCs em células de suspensão e contagem de célula única usando um contador automatizado de células, ou hemocytometer.
   Nota: Um protocolo detalhado para a linha de hiPSC do WTC usado aqui pode ser encontrado em Allen célula Explorer¹⁹. Brevemente, lavar as células uma vez com RT DPBS e tratar com reagente de dissociação para 3-5 minutos. Depois Triture as células em suspensão de célula única por pipetagem suave e pelota por centrifugação. Resuspenda o pellet de células vivas em meios de crescimento, suplementados com 10 µM do Ri.
   1. Prepare-se uma alíquota de 1.84 x 10⁶ células para cada condição experimental a transfected em tubos separados 1,5 mL.
      Nota: Todos os volumes são calculados para um volume de reação total de 4,5 µ l em um volume de 100 µ l electroporation, vezes 2,3 reações. Contas para transfeccao duplicado e excesso por erro de pipetagem.
4. Prepare o ribonucleoprotein tubos complexos (RNP) para cada condição experimental, acrescentando 2,88 µ l de 10 µM gRNA e 2,88 µ l de 10 µM Cas9 para um tubo de 1,5 mL. Incube a RT por um mínimo de 10 min (máximo 1 h).
5. Uma célula alíquota (preparada na etapa 2.3.1) a 211 x g, durante 3 min no sobrenadante RT. aspirado de pelotas e resuspenda o pellet celular em 220 µ l de tampão de eletroporação do fabricante.
6. Adicione 220 µ l de células ressuspensa da etapa 2.5 no 1,5 mL RNP complexo tubo preparado no passo 2.4.
7. Adicione 4.60 µ l do plasmídeo de modelo de 1 µ g / µ l de doadores para o tubo de 1,5 mL preparado no passo 2.4.
8. Use a ponta nucleofection e pipeta para misturar o conteúdo do tubo 2 - 3 vezes e, em seguida, transferir 100 µ l de suspensão para o aparelho de eletroporação preparado. Evite a introdução de quaisquer bolhas na ponta. Aplica 1300 V 1 pulso de 30 ms.
9. Gentilmente transferi a suspensão para a placa de 6 preparada da etapa 2.2 com um movimento turbilhão. Disperse as células movendo suavemente a placa lado a lado e de frente para trás.
10. Usando uma nova ponta de nucleofection, repita as etapas de 2,8-2,9 com os restantes 100 µ l de suspensão e de transferência em um segundo poço da placa de 6-bem preparado.
    1. Repita as etapas 2.4 através de 2.10 para cada gRNA e doador modelo plasmídeo combinação, incluindo direcionamento-gRNA e plasmídeo de modelo do doador somente controles única reserva. Tome cuidado para mudar a pipeta e nucleofection dicas para evitar a contaminação cruzada.
11. Incube as células transfectadas em 37 ° C e 5% de CO₂. Alterar os meios de comunicação para mídia de crescimento regular (não Ri) em 24h e continuar alimentando hiPSCs cada 24h para 72-96 h, confluência de monitoramento. Quando o hiPSCs chegar a confluência de 60-80%, prossiga para a etapa 3.
    Nota: Morte de célula pesado (> 70%, estima-se) é normal 24-48 h depois do transfection.

3. FACS-enriquecimento de presumidamente edição hiPSCs

Nota: Ao classificar as células-tronco, adapte as configurações do instrumento para promover a sobrevivência da pilha como sugerido na discussão. Brevemente, use o bocal maior possível (130 µm), uma baixa taxa de fluxo (≤ 24 µ l/min), fluido de bainha de conservantes (como soro fisiológico, consulte Tabela de materiais) e amostra de baixa pressão (10 psi).

1. Antes de começar um experimento de FACS, mudar de mídia para mídia de crescimento suplementada com 10 µM Ri e incubar as células em 37 ° C e 5% CO₂ para 2-4 h para promover a sobrevivência após FACS.
2. Usando um reagente de dissociação suave de célula única conforme recomendado na Tabela de materiais, passagem hiPSCs em suspensão de célula única em meios de crescimento, suplementados com 10 µM Ri¹⁹.
3. Filtrar hiPSC suspensão através de filtro de malha 35 µm para tubos de poliestireno redondo.
4. Classificar células usando a dispersão para a frente e dispersão de lado (inclusive a altura x largura) para excluir os restos e Parelhas. Uso ao vivo, buffer de apenas controlar células para definir o portão FP-positivo, tal que < 0,1% de células única reserva cair dentro do portão.
5. Tipo, toda a população de FP-positivo células para um tubo de polipropileno 1,5-15 mL, contendo 0,5-2 mL de meio de crescimento RT suplementado com 10 µM do Ri.
   Nota: Polipropileno reduz o potencial para a aderência de célula para o plástico.
6. Centrifugar as células coletadas em 211 x g durante 3 minutos em RT
7. Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante e ressuspender células em 200 µ l de meio de crescimento, suplementado com 10 µM Ri. Transferi até 3.000 células classificadas para um único poço de uma placa de 96 poços revestidos matriz fresco¹⁹.
   Nota: Com a instalação do instrumento adequado, células podem também ser classificadas (a granel) diretamente em um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços revestidos matriz contendo 200 µ l de meio de crescimento, suplementado com 10 µM Ri em uma densidade recomendada de 1.000-3.000 células por poço para hiPSC.
8. Incube as celulas classificadas em 37 ° C e 5% de CO₂. Altere os meios de comunicação para mídia de crescimento suplementada com 5 µM Ri em 24h. A 48 h começam a alimentar a mídia de crescimento regular de células (não Ri) cada 24h para 72-96 h, confluência de monitoramento. Sobrevivência após FACS é estimado para ser superior a 50% se um mínimo de 500 células é semeado em um poço de uma placa de 96 poços.
   1. Quando hiPSCs chegar a confluência de 60-80% e mostrar madura morfologia (centros de colônia suave, bem embalado), passagem para um prato de formato maior, como uma placa de 24 e, em seguida, de uma placa de 24 em uma placa de 6.
   2. Quando os hiPSCs em uma placa de 6 alcançar confluência de 60-80% e mostrar maduras morfologia, expandir a uma placa de 100mm, re-placa para a imagem latente, cryopreserve ou sementes no clone colheita densidade (etapa 4)¹⁹.

4. gerando presumidamente edição Clonal hiPSC linhas

1. Usando um reagente de dissociação suave de célula única conforme recomendado na Tabela de materiais, passagem hiPSCs em suspensão de célula única e determinar o número de células por mL¹⁹.
2. Células de semente 10.000 da população editada de hiPSCs para um prato de cultura de tecido fresco matriz revestidos 100 mm usando a mídia de crescimento suplementada com 10 µM Ri¹⁹. Alterar os meios de comunicação para mídia de crescimento sem Ri 24 h após a semeadura e alimentar o hiPSCs com mídia de crescimento fresco cada 24h por 5-7 dias.
3. Quando hiPSCs formaram colônias que são visíveis macroscopicamente (aproximadamente 500 µm) são grandes o suficiente para ser isolado. Prepare uma placa de 96 poços revestidos matriz matriz excesso de aspiração e adicionar 100 µ l de meio de crescimento, suplementado com 10 µM Ri por bem¹⁹.
4. Em uma pipeta de uso um P-200 microscópio dissecação, ou similar, suavemente, raspar e Aspire colónias individuais da superfície da placa. Transferir o volume (~ 20-100 µ l) contendo a colônia para um único poço da placa de 96 poços, preparado no passo 4.3.
   1. Depois de todas as colônias foram transferidas, incube a placa em uma incubadora de cultura de tecido em 37˚C e 5% de CO₂. Alterar os meios de comunicação para mídia de crescimento regular (não Ri) em 24h e continuar alimentando as células cada 24h para 72-96 h até colônias aproximadamente triplicaram de tamanho (aproximadamente 1500 µm).
      Nota: Escolher colónias de 24-96 por crRNA usado no transfection é recomendado. A sobrevivência dos clones isolados é tipicamente maior que 95%.
5. Usando um reagente de dissociação suave de célula única conforme recomendado na Tabela de materiais, passagem hiPSC clones em uma nova placa de 96 poços revestidos matriz como segue¹⁹.
   1. Usando um aspirador de 8 canais, remova e descarte a mídia da primeira coluna da placa de 96 poços.
   2. Com uma pipeta multicanal P-200 adicione ~ 200 µ l de DPBS para a primeira coluna da placa de 96 poços para lavar as células. Usando um aspirador de 8 canais, remova e descarte DPBS lavagem da primeira coluna da placa de 96 poços.
   3. Usando uma pipeta multicanal P-200, adicione 40 µ l de reagente de dissociação para a primeira coluna da placa de 96 poços.
   4. Repita os passos 4.5.1-4.5.3 para até um total de seis colunas da placa de 96 poços, trocando dicas para ter a certeza para não Cruz-contaminar poços. Coloca a placa numa incubadora a 37 ° C durante 3-5 minutos desde o momento em que o reagente de dissociação foi adicionado para a primeira coluna (etapa 4.5.3).
      Nota: Recomenda-se única passagem um máximo de seis colunas (48 poços) aos poucos devido ao tempo que leva para executar essas etapas. Ao realizar este protocolo pela primeira vez, comece com passagem somente uma ou duas colunas de cada vez. Limitando o número de colunas passadas ao mesmo tempo assegura que as células não são deixadas ao reagente de dissociação por muito tempo, que poderia ser prejudicial para o hiPSCs.
   5. Quando as células na primeira coluna da placa tem começado a levantar a placa inferior, use uma pipeta multicanal de P-200 para adicionar 160 µ l de DPBS para a primeira coluna da placa de 96 poços e triture levemente as células no "12:00" , "03:00", "06:00" e "09:00" as posições de cada poço. Transferi todo o volume da suspensão de células (200 µ l) para uma placa de 96 V-fundo.
   6. Repita a etapa 4.5.5 para as restantes colunas de células com reagente de dissociação trocar dicas de poços não Cruz-contaminar.
   7. Girar a placa de V-fundo em uma centrífuga a 385 x g por 3 min em RT
   8. Usando uma pipeta multicanal P-200, remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em 200 µ l de meio de crescimento fresco suplementado com 10 µM Ri por bem. Repita para todos os poços, trocar dicas de não contaminar a Cruz.
   9. Transferi todos a suspensão de células para uma placa de 96 poços revestidos matriz fresco¹⁹. Incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 ° C e 5% de CO₂. Alterar os meios de comunicação para mídia de crescimento regular (não Ri) em 24h e continuar alimentando as células cada 24h para 72-96 h, até que a maioria dos clones alcançar confluência de 60-80%.
      Nota: Esta passagem ajuda a espalhar para fora das células e permitir maior crescimento ao longo de toda a área da placa de 96 poços.
6. Clones de observar e identificar uma relação de separação apropriadas para cada clone individual da placa de 96 poços (por exemplo, 01:10, ou 1:8). Usando um reagente de dissociação de célula única suave como sugerido na Tabela de materiais, passagem hiPSC clones em uma nova matriz-96 poços placa revestida (passos 4.5.1-4.5.8) transferir um rácio da suspensão celular apropriado para cada clone. Incube a placa em uma incubadora de cultura de tecido em 37˚C e 5% de CO₂. Alterar os meios de comunicação para mídia de crescimento regular (não Ri) em 24h e continuar alimentando as células cada 24h para 72-96 h, até que a maioria dos clones alcançar confluência de 60-80% e mostra a morfologia madura.
   Nota: Cada clone pode ter uma relação diferente de divisão por causa da taxa de crescimento ligeiramente diferente ou sobrevivência da passagem anterior, assim esta passagem ajuda a normalizar o número de células por poço de cada clone para a etapa de congelamento seguir. Devido às diferentes taxas de sobrevivência e crescimento, alguns clones podem overgrow ou deixam de crescer durante estas etapas de passagem.
   1. Salvar o restante da suspensão de células e pelota para gDNA isolamento por centrifugação de células em uma placa de 96 V-inferior a 385 x g por 3 min em RT. Remove sobrenadante e proceder ao isolamento gDNA usando um kit de 96 poços ou loja placa de células peletizadas em - 20˚C para até thr semanas de EE.

5. criopreservação de linha celular clonal no formato da placa de 96 poços

1. Usando um reagente de dissociação de célula única, passagem hiPSC clones como descrito anteriormente (passos 4.5.1-4.5.7). Aspirar o sobrenadante com uma pipeta multicanal P-200 e ressuspender em 60 µ l de meio de crescimento, suplementado com 10 µM do Ri. Repita para todos os poços; trocar dicas de não contaminar a Cruz.
2. Transferi 30 µ l de suspensão de células para uma placa de cultura de tecidos de 96 poços revestidos não-matriz. Em seguida, adicione rapidamente 170 µ l de tampão de congelamento (ver Tabela de materiais) para cada poço, sem misturar. Repito pela transferência os restantes 30 μL de suspensão para uma irmã placa e adicionando µ l 170 congelamento de buffer.
   Nota: Este processo é feito em duplicado irmã placas para que uma população de backup das pilhas existe depois de descongelar um dos pratos individuais. Colocar as células criopreservadas apenas cada coluna de uma placa de 96 poços permite mais rápido descongelar (etapa 5.6).
3. Enrole a placa com parafilm e coloque em uma caixa de isopor de RT com tampa. Coloque a caixa inteira em um freezer-80 ° C.
4. Após 24 h placas podem ser transferidas para fora da caixa de isopor e armazenadas em - 80˚C por até quatro semanas.
   Nota: Enquanto as células são armazenadas temporariamente a-80 ° C, ensaios de controle de qualidade genética podem ser realizados com o gDNA de células obtidas na etapa 4.6.1 a fim de identificar os clones para descongelar e propagar ainda mais, conforme discutido no trabalho publicado anteriormente colhida ¹². brevemente, um cópia número gotículas digital PCR ensaio pode ser usado para identificar clones que contêm um ou dois exemplares de GFP e sem integração de espinha dorsal do doador modelo do plasmídeo. Uma combinação de ensaios PCR de ponto de extremidade e Sanger sequenciamento pode então identificar clones que contêm uma inserção precisa.
5. Para descongelar, trazer o prato inteiro para 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, observando cuidadosamente para as pelotas de gelo a derreter. Poços na borda da placa tendem a descongelar primeiro.
   1. Quando o pellet de gelo do clone desejado derrete, gentilmente transferir toda 200 µ l para um tubo cônico de 15 mL contendo 3 mL de meio de crescimento RT suplementado com 10 µM Ri e centrifugar 211 x g por 3 min em RT
   2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender peletizadas células em 1 mL de meio de crescimento RT suplementado com 10 µM do Ri. Transferir para uma fresca matriz-revestido 24-placa e incubar a 37˚C e 5% de CO₂. Alterar os meios de comunicação para mídia de crescimento regular (não Ri) em 24h e continuar alimentando as células cada 24h para 72-96 h até o clone atinge 60-80% de confluência e tem morfologia maduro¹⁹.

Resultados

O objetivo deste experimento foi fundir mEGFP (GFP reforçada monomérico) à proteína nuclear de B1 lamina introduzindo a sequência de mEGFP para o fim de 5ʹ do gene LMNB1 (N-terminal da proteína). Um vinculador (sequência de aminoácidos SGLRSRAQAS) foi escolhido com base no anterior construções de cDNA da coleção de proteína fluorescente Michael Davidson²¹. Porque a região de ligação crRNA em plasmídeo de modelo o doador para crRNA cada candidato foi interrompida após a inserção no silico de mEGFP e a sequência de vinculador, sem mutações de ponto foi necessária para interromper o potencial crRNA de reconhecimento e clivagem pela Cas9 da sequência de doador (Figura 1). A sequência de doador continha armas de homologia de 1KB flanqueando a ambas as extremidades da sequência mEGFP-linker. O resultante 2.734 bp de DNA foi clonado em um backbone de pUC57, sequência verificada, e o plasmídeo de modelo doador resultante foi purificado usando um livre de endotoxinas maxi prep. O plasmídeo de modelo do doador e o complexo RNP foram transfectadas, presumidamente editadas células foram enriquecidas e a localização da proteína de fusão nuclear-mEGFP lamina B1 foi confirmada por microscopia de fluorescência (Figura 2). Apenas os resultados do transfection crRNA1 são descritos aqui, embora ambas as sequências de crRNA produziram populações presumidamente editado¹².

Quando comparado com o controle negativo, que continha sem gRNA, proteína Cas9 ou plasmídeo de modelo doador na reação de eletroporação (reserva apenas), o crRNA1 LMNB1 transfectadas células continham células de mEGFP-positivo de 0,95% representando o presumidamente editado população de B1 lamina mEGFP-nuclear (Figura 3a). Este resultado foi dentro do intervalo de batida-em eficiência observada através de muitos loci genômicos usando este método, como relatado anteriormente,¹².

As células mEGFP-positivo foram isoladas por FACS e fotografadas por microscopia ao vivo para confirmar a localização esperada da proteína de fusão de B1 lamina mEGFP nucleares para o envelope nuclear. Após o enriquecimento de FACS, aproximadamente 90% das células classificadas da população crRNA1 LMNB1 foram mEGFP-positivo (conforme determinado pela microscopia), sugerindo que algumas células de mEGFP-negativo co purificadas com as células GFP-positivo durante o procedimento de classificação. Isto foi um nível aceitável de enriquecimento que permitiu para a colheita de 96 clones que poderia então ser geneticamente selecionados para edição de sucesso. Geralmente, um recorte para o enriquecimento de sucesso é de 50% positivo GFP.

A maioria da população classificada celular exibida fluorescência para o envelope nuclear (nuclear periferia) nas células nondividing e para uma lâmina nuclear estendida no citoplasma durante a confiança fornecendo mitose na correcta genômica editar ao LMNB1 Locus. A população enriquecida continha células com sinal luminosa ou fraca. Esta diferença de intensidade de sinal pode refletir uma combinação de correto e incorreto, resultados e destaques a utilidade de gerar uma linha clonal geneticamente validada para mais estudos (ver discussão) de edição (Figura 3b)¹². Após a geração de linha clonal, validado geneticamente células mostrou intensidade uniforme de GFP em experimentos de microscopia (Figura 3C).

Figura 1 . Desenha estratégia para marcação de GFP N-terminal do gene LMNB1. A tag GFP foi projetada para 5ʹ de inserção do N-terminal do primeiro exon de LMNB1 localizado no cromossoma 5. Homologia tanto 5ʹ e 3ʹ de armas são 1 kb cada encontro entre o códon de início (ATG) e o segundo codão (braços de homologia apenas parcialmente representados na figura). Dois candidatos crRNAs foram projetados para guiar Cas9 para trilhar o mais próximo do local de inserção pretendido quanto possível, enquanto ainda está sendo exclusivo no genoma. Sequência de mEGFP e um aminoácido vinculador foram inseridas apenas 3ʹ do códon de início (sequência de mEGFP e o vinculador não está à escala). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Fluxo de trabalho para produzir endogenamente marcou linhas clonal hiPSC. Componentes de transfeccao, incluindo o complexo RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (mostrado em vermelho Cas9 proteína com crRNA de ouro e púrpura tracrRNA), o plasmídeo de modelo de doadores contendo os braços de homologia (HAs, mostrados em ouro) e FP + sequência de vinculador (mostrado em verde), foram electroporated. Após 4 dias, as células de FP-positivo presumidamente editada foram enriquecidas pela FACS e expandiu-se como uma população semeando todas as células classificadas em um único poço de uma placa de 96 poços (~ 1.000 células) e depois expandidas em cultura até uma população activa de vários milhões células podem ser analisadas como "população enriquecida" (ver protocolo passo 3.8). O rendimento das células FP-positivo difere pelo experimento devido a taxas variáveis de HDR¹²; um enriquecimento sucesso tipicamente pode incluir ~ 300-5.000 células após a transfeccao de aproximadamente 1,6 x 10⁶ quadris. Estudos de imagiologia preliminares confirmaram o sinal e a localização da proteína de fusão na população enriquecida. Colônias foram escolhidas manualmente em uma placa de 96 poços para expansão e criopreservação. Mais seleção genômica de controle de qualidade usando gotículas digital PCR (ddPCR) e outros ensaios baseados em PCR foram utilizadas para identificar corretamente editados clones, como descrito anteriormente,¹². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 . Enriquecimento de populações de células presumidamente editado. (A) parcelas de citometria de fluxo da LMNB1 edição do transfection pós de quatro dias de células. O eixo y mostra a intensidade GFP e eixo x apresenta dispersão para a frente. Classificação portões foram definidas com baseadas no controle somente reserva. Desde que hiPSCs são sensíveis à perturbação, vivo/morto mancha foi omitida e um portão muito conservadora do FSC/SSC foi usado em vez disso. (B) após o enriquecimento, a população de Cr1 LMNB1 edição células mostrou ~ 90% de células com GFP localizando no envelope nuclear (esperado LMNB1 localização). A população continha células de intensidade variável de GFP, bem como algumas células GFP-negativo. Barras de escala são 10 mícrons. (C) após a geração de linha clonal, células mostraram uma intensidade uniforme de GFP, com algumas diferenças dependentes do ciclo celular. Barra de escala é 20 mícrons.

Discussão

O método apresentado aqui para gerar endogenamente regulada fusões de proteína fluorescente em hiPSCs é uma abordagem versátil e poderosa para gerar linhas de células de gene editado com aplicações que vão desde imagens de células vivas para vários estudos funcionais e " modelos de doenças em um prato"usando linhas de paciente-derivado hiPSC^13,14,15. Enquanto este método tem sido usado para introduzir grandes etiquetas FP para N - ou C-terminal de proteínas endógenas, potencialmente poderia ser usado para apresentar outras marcas ou pequenas alterações genéticas modelo ou correto doença-causando mutações^22,23 . Para inserções menores, o tamanho do braço homologia pode ser reduzido, mas a abordagem geral da edição apresentada neste método ainda pode aplicar^24,25. Enquanto o uso de hiPSCs é fortemente incentivado por sua vasta utilidade, com otimização do cuidado, este protocolo pode ser adaptado para editar os genomas de outras linhas de células de mamíferos.

Ao identificar um gene de interesse para marcação de FP, estimativas de abundância de transcrição (a partir de dados de RNA-Seq ou microarray) é um bom ponto de partida para avaliar se um gene ou a isoforma de interesse é expresso, embora os níveis de transcrição não sempre se correlacionam com níveis de proteína. A estratégia de FACS-enriquecimento descrita aqui irá funcionar melhor para genes que são expressos pelo menos moderadamente bem no tipo de célula de interesse. Esta estratégia também foi bem sucedida na seleção para fusões que apresentam padrões de localização punctate e/ou discretos como centrin, desmoplakin e paxillin onde o sinal à relação de fundo é muito baixo^12,19. Genes que não são altamente expressas ou só são expressos em tipos de células derivadas podem exigir estratégias de seleção adicionais.

O ponto de partida para crRNA e doador projetos de plasmídeo de modelo utilizado em linhas de células humanas deve ser o genoma humano de referência (GRCh38). Porque os genomas de linhagens celulares diferentes podem variar dentro da mesma espécie, e porque CRISPR/Cas9 é específico da sequência, é extremamente útil identificar variantes de linha específica de célula (polimorfismos de nucleotídeo único ou inserções/exclusões (puntuais)) que diferem do genoma de referência e incorporar estas no projeto. Isso garante que o crRNAs será compatível com o genoma do hospedeiro e que as armas de homologia doador modelo plasmídeo irão reter quaisquer variantes específicas de linha celular. Uma estratégia sugerida é incorporar homozigotos variantes crRNAs e doador de armas de homologia de plasmídeo modelo durante o processo de design. Incorporando as variantes heterozigotas é opcional. Os reagentes específicos utilizados para grandes batida-em experimentos e outras considerações-chave para este protocolo são discutidas abaixo.

Proteína Cas9

O principal benefício do uso de proteína Cas9 é que introduzindo o Cas9 e gRNA como um complexo de RNP foi mostrado para resultar em uma duração limitada de actividade nuclease em comparação com abordagens baseadas em plasmídeo onde a expressão do Cas9 e gRNA pode continuar por dias e levar a maior em-fora-alvo e atividade^26,27. Um benefício adicional do uso de proteína Cas9 é que está prontamente disponível para clivar uma vez dentro das células. Isto contrasta com métodos mais convencionais de usando Cas9 mRNA ou Cas9/gRNA plasmídeo que necessitam de transcrição, tradução e processamento de^26,28. Sua proteína de S. pyogenes Cas9 agora está disponível de várias fontes comerciais.

Guia do RNA

Existem muitas ferramentas disponíveis publicamente para encontrar alvos de crRNA perto do local de inserção de FP desejado que têm zero ou alguns previstos fora-alvos no genoma do hospedeiro^29,30,31,32. Eficiência em HDR e a precisão do resultado HDR varia amplamente entre alvos de crRNA usados em um determinado locus¹². Por esta razão, testando vários crRNAs (2-4 e de preferência dentro de 50 bp do local de inserção desejada) por locus é recomendada, pois isto pode aumentar a probabilidade de uma experiência bem sucedida de edição. Possibilidades atuais para a entrega de gRNA incluem sintético 2-parte crRNA tracrRNA, gRNAs única sintética (sgRNAs), e em vitro transcrito sgRNAs, ou entregar um plasmídeo para células expressando o sgRNA de um promotor de U6. Este protocolo não foi otimizado para atividade de decote alto. Não modificado 2-parte crRNA e tracrRNA (ver Tabela de materiais) foram usados com o objetivo de gerar linhas de células mono-alélico FP-etiquetado enquanto causando a perturbação menos potencial para as células.

Dador modelo plasmídeo

Porque alguns da homologia braço sequência desde o dador plasmídeo modelo será incorporado o genoma do hospedeiro durante o evento HDR, mutações pontuais para os sites de reconhecimento de crRNA devem ser introduzidas para evitar a segmentação por Cas9 seguindo HDR. Muitas vezes a mais simples mudança disruptiva é transformar a sequência de PAM que. Porque algumas sequências não-canônicos do PAM ainda podem ser reconhecidas pelo tipo selvagem Cas9 S. pyogenes , é melhor evitar o uso NGG, nascimento ou NGA³³. Quando o braço de homologia a sofrer uma mutação, evite mutações não-sinónimas e a introdução de códons raros. Se uma mudança de sinônimo para a sequência de PAM não for possível, considere fazer três mutações sinónimas de ponto na região da semente (10 bp proximal à PAM) do sítio de ligação do crRNA. Extremo cuidado deve ser tomado ao fazer essas alterações na região untranslated 5ʹ (UTR), desde que estas regiões podem conter sequências reguladoras importantes. Consultar um banco de dados de conservação genética tais como faixas de genómica comparativa do UCSC Genome Browser podem fornecer orientação, nestes casos, como alterações em bases não-conservada podem ser melhor toleradas do que muda para bases altamente conservadas¹⁷. Às vezes, a simples inserção da sequência FP é suficiente para perturbar o sítio de ligação do crRNA (como na Figura 1); no entanto, a sequência recém-anexado deve ser verificada para a persistência da ligação crRNA e sequências de PAM.

Aminoácido linkers entre o FP e a proteína nativa são recomendados para conservar a função da proteína de fusão³⁴. Muitas vezes um vinculador de aminoácido pode ser escolhido para a sua carga em particular ou o tamanho. Se uma fusão de cDNA com um design semelhante do alvo endógena proteína de fusão tem sido bem estudada, que mesmo vinculador de sequência pode ser usada para o TOC-no experimento CRISPR/Cas9^12,19. Se essa informação não estiver disponível, um vinculador curto como GTSGGS também tem sido usado com sucesso¹². Outros estudos têm demonstrado sucesso com uma sequência de genérico vinculador de ácido 3-amino pequeno para uma variedade de alvos³⁵.

Transfection e enriquecimento de FACS

Muitos reagentes de transfecção disponíveis comercialmente são formulados para a entrega de certos tipos de moléculas de células, Considerando que um sistema de eletroporação pode ser usado para entregar os reagentes com uma ampla gama de tamanho, carga e composição. Além de ser um método comum de Transfeccao para células difícil-para-transfect, como hiPSCs, electroporation também traz o benefício de entregar todos os três componentes para bater-em FP CRISPR/Cas9-mediada conforme descrito neste método. Electroporation foi encontrado para produzir os melhores resultados quando comparado com outros reagentes comercialmente disponíveis ao desenvolver esse método (dados não mostrados) e também tem sido usado por outros para RNP entrega^26,28,36 .

Quando usando esse protocolo para edição hiPSCs, especial deve ter cuidado para garantir suave manipulação das células antes e após o processo para a sobrevivência da célula ideal e mínima diferenciação espontânea de edição gene. Em particular, os métodos de enriquecimento de FACS devem ser adaptados para classificação de células-tronco, usando o bico maior possível (130 µm), uma baixa taxa de fluxo (≤24 µ l/min), fluido de bainha de conservantes (como soro fisiológico, consulte Tabela de materiais) e amostra de baixa pressão (10 psi). Em vez de célula única classificação, que resulta em qualidade inferior viabilidade em células-tronco, os hiPSCs FACS-enriquecido são classificados em massa e expandiu-se como uma população para otimizar a integridade de viabilidade e células-tronco de células. No entanto, a única célula classificação pode ser apropriado para menos tipos de células sensíveis. Para promover a sobrevivência celular, células retornou a cultura não é mais do que uma hora depois da colheita para o enriquecimento de FACS e mantidas à temperatura ambiente durante todo o processo de classificação. Para alguns tipos de células, a sobrevivência da pilha também pode ser melhorada por células de incubação no gelo (4° C) durante todo o processo de classificação.

A expansão em massa de células FP-positivo fornece uma oportunidade para avaliar a população por análise de imagem para localização da proteína de fusão antes de gerar linhas clonais. Enquanto a população enriquecida resultante de células pode ser suficiente para alguns estudos, estas populações frequentemente exibem sinal FP de intensidade variável. As linhas clonais isoladas têm sinal uniforme (Figura 3), tornando-os mais adequados para experimentos funcionais¹².

Geração de linha celular clonal

Durante o processo de geração clonal e edição linha, é importante controlar a morfologia celular. hiPSC colônias crescidas em condições de livre de alimentador devem exibir bordas lisas e um centro bem embalado, mesmo^12,18,19. Células diferenciadas devem ser observadas em menos de 5% da cultura. Ao escolher colónias individuais, escolha aqueles que morfologia boa exposição. Durante a placa de 96 poços, passagem de eventos, verifique clones para morfologia e descontinuar os que têm crescido, pois isso pode levar a diferenciação ou ser uma indicação de instabilidade genética.

Permite a geração de linhas de células clonais para confirmação genética da edição precisa, que é importante porque induzida por Cas9 dupla vertente quebra no genoma são muitas vezes reparados imprecisa apesar de incorporação da marca para o local desejado. Ensaios de PCR-based descritos anteriormente mostraram que cumulativamente através de dez únicas genomic loci muitos (45%) dos clones FP-expressando sofria de integração de espinha dorsal de plasmídeo de doador para o locus alvo ou (raramente) aleatoriamente no genoma¹². Além disso, 23% de GFP-positivo clones (n = 177) através de dez únicos loci foram encontrados para abrigar mutações no ou perto do local de corte antecipado crRNA no alelo não marcado, provavelmente devido a NHEJ¹². Esta análise genética de muitas linhas clonais (~ 100 clones/editar) destacou a importância da validação genética que não é possível em uma população celular desde que FP-expressão e localização da proteína de fusão esperada sozinho não garante a edição precisa¹² . Além disso, estes ensaios baseados em PCR não podem ser executados em uma população enriquecida de células com alguma certeza, justificando a necessidade de geração clonal linha antes análise significativa pode ser concluída. Confirmação genética da marca FP inserida e verificação da integridade genética do alelo inédito (em um clone de mono-alélico editado) são necessárias para uma edição precisa no locus alvo além da expressão marca.

Uma baixa taxa de edições bi-alélica e falta de mutações fora do alvo (como analisado por Sanger e sequenciamento exome) foram observados para data usando este método (dados não publicados)¹². Isto é consistente com estudos anteriores descrevendo o uso da RNP de curta duração para CRISPR/Cas9 experimentos^26,27. A falta de linhas de células clonais com edições bi-alélica também pode ser o locus específico ou devido à incapacidade da célula de tolerar dois marcados cópias de uma proteína essencial como sugerido de experimentos publicados anteriormente onde eram células editadas bi-alélico putativos observado para um locus (LMNB1), mas não outro (TUBA1B)¹². Linha celular clonal totalmente validado bi-alélico foi gerada usando esse método para marca ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-1 sialyltransferase (ST6GAL1) e membro RAB5A família de oncogene RAS (RAB5A) com mEGFP¹⁹.

Além de confirmar a precisão do Editar no genoma, há uma variedade de ensaios de controle de qualidade que pode ser usado para mais caracterizar a linha clonal e identificar clones que cumprir todas as células-tronco, genoma, e critérios biológicos de celular para usam em futuros estudos . Ensaios biológicos e funcionais de celular podem ser usados para confirmar a expressão adequada, localização e função das proteínas fusão¹². A comparação com os controles parentais não editadas ajudará a avaliar a influência do processo de edição na localização, dinâmica e função. Outros ensaios tais como análise de crescimento e ensaios de estabilidade genômica podem também ajudar a determinam se a proteína etiquetada é perturbadora para a célula. Ao usar o hiPSC no presente protocolo, avaliação de marcadores de pluripotência e potencial de diferenciação pode ser crítica na determinação de um clone que é valioso para a jusante estuda¹². Porque estendeu a cultura de hiPSC foi mostrado para provocar instabilidade genética, a taxa de crescimento de monitoramento e cariótipo de linha celular clonal é também importante^12,,³⁷. No entanto, a final se destina uso das células editados irá determinar o nível e a amplitude de análise de controle de qualidade e irá variar com base na aplicação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Geneious R9	Biomatters, ou software de		para in silico projeto de plasmídeo doador
TE Buffer pH 8.0	IDT, ou similar	11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubadora, ou similar	ThermoFisher Scientific, ou similar	51030408
Pipetas (1000 µ L, 200 µ L, 20 µ L, 10 µ L, 2 e micro; L)	Rainin, ou pontas de
(1000 µ L, 200 µ L, 20 µ L)	Rainin, ou similar
Pipeta Multicanal (200 µ L)	Rainin ou pipetas sorológicas semelhantes
(25 mL, 10 mL, 5 mL)	Costar ou
para Quiksip,	Millipore Sigma	uso semelhante BR704526-1EA	com pontas de pipeta não filtradas, como pontas de pipeta de baixa retenção da Molecular BioProducts, Pure 10, abaixo
pontas de pipeta de baixa retenção da Molecular BioProducts, Pure 10	Thermo Fisher, ou semelhante	3501-05
XP2 Controlador de pipeta	Drummond, ou similar	4-000-501
Pipetas Pasteur descartáveis	VWR, ou similar	53300-567
Classe II, Tipo A2 Gabinete de Segurança Biológica	CELLGARD, ou similar	NU-481
Matriz Matrigel, Fator de Crescimento Reduzido	Corning	354230	lote testado antes do uso com hiPSC
DMEM/F12 (vermelho de fenol)	Gibco	11039-021	frio, para diluir Matrigel 1:30
mTeSR1 Mídia completa	StemCell Technologies	85850	mídia de crescimento recomendada para a linha WTC hiPSC
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070-063
WTC linha hiPSC	Coriell	GM25256	a linha hiPSC usada neste protocolo está disponível através da Coriell
Placa de cultura de tecidos 100 mm	Falcon	353003
Placa de cultura de células de 6 poços	CELLSTAR	657160
StemPro Accutase	Gibco	A11105-01
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190144
15 mL de poliestireno cônico	Sarstedt	62.554.100
Y-27632 ( Inibidor de ROCK)	StemCell Technologies	72308
Edit-R CRISPR-Cas9 CrRNA sintético, não modificado (sequência personalizada)	Dharmacon	Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA sintético	Dharmacon	U-002005-05
Streptococcus pyogenes Proteína purificada Cas9-NLS, 40 µ M	Universidade da Califórnia-Berkeley QB3 Macrolab
Plasmídeo doador personalizado (PriorityGENE)	Genewiz		foi sintetizado e clonado no backbone pUC57 pelo tubo Genewiz
DNA LoBind 1,5 mL	Eppendorf	22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF	Clontech	740424.50
Sistema de Transfecção de Néon	ThermoFisher Sistema de
, 100 µ Kit L	ThermoFisher Scientific	MPK10096
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com tampa do filtro de células	Falcon	352235
Tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 15 mL	Falcon	352196
FACSAriaIII Fusion	BD Biosciences	656700
FACSDiva software	BD Biosciences
versão FlowJo 10.2	TreeStar
NERL Saline	ThermoFisher Scientific	8504	usado como amortecedor FACS sem conservantes Microscópio
Estéreo Olympus SZX7, ou	similar Olympus, ou
Placa de cultura de tecidos, 96-well	Falcon	353072
96 well Placa de Cultura de Células, V-Bottom	CELLSTAR	351180
CryoStor CS10	Sigma	C2874-100ML	usado como tampão de criopreservação para células em formato de placa de 96 poços
Parafilm	Bemis	PM-996
Placa de cultura celular de 24 poços	CELLSTAR	662160