Lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de Gold(III)

Resumo

Os protocolos para estudar a ligação de ouro cátions (Au(III)) para várias conformações de albumina de soro bovino (BSA), bem como para caracterizar a fluorescência de BSA-Au única dependente conformacional são apresentadas.

Resumo

O objetivo dos protocolos apresentados é estudar o processo de ligação de Au(III) a BSA, rendendo fluorescência vermelha induzida pela mudança de conformação (λ_em = 640 nm) de complexos de BSA-Au(III). O método ajusta o pH para mostrar que o surgimento da fluorescência vermelha está correlacionado com as transições de equilíbrio de pH-induzida de conformações da BSA. Fluorescente vermelha BSA-Au(III) complexos só podem ser formados com um ajuste de pH igual ou superior a 9,7, que corresponde a conformação de "Uma-forma" da BSA. O protocolo para ajustar a BSA a razão molar de Au e para monitorar o tempo-curso do processo de vinculação de Au(III) é descrito. O número mínimo de Au(III) por BSA, para produzir a fluorescência vermelha, tem menos de sete anos. Descrevemos o protocolo em etapas para ilustrar a presença de vários sites de ligação Au(III) em BSA. Primeiro, pela adição de cobre (Cu(II)) ou níquel (Ni(II)) cações seguidas por Au(III), este método revela um sítio de ligação para Au(III) que não é o fluoróforo vermelho. Em segundo lugar, modificando BSA tiol tampando agentes, outro sítio de ligação de Au(III) nonfluorophore-formando é revelado. Em terceiro lugar, alterando a conformação de BSA por clivagem e nivelamento das ligações de bissulfeto, Au(III) possível ligação site é ilustrado. O protocolo descrito, para controlar as conformações de BSA e Au(III) ligação, pode ser aplicado geralmente para estudar as interações de outras proteínas e cátions metálicos.

Introdução

Um composto de BSA-Au exibindo uma radiação ultravioleta (UV)-fluorescência vermelha excitável, com notável stokes turno, tem sido sintetizado originalmente por Xie et al. ¹. a fluorescência vermelha única e estável pode encontrar várias aplicações em campos como a detecção de^3,2,4, imagem^5,6,7ou nanomedicina^{8 ,9,10,11....}

Protocolo

1. síntese do complexo de BSA-Au(III)

1. Dissolva 25 mg de BSA em 1 mL de água de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em um frasco de reação de 5 mL.
   Nota: A solução deve aparecer claramente.
2. Dissolva o ouro (III) cloreto trihidrato (ácido chloroauric) a uma concentração de 5 mM em água de grau HPLC.
   Nota: A solução deve aparecer amarela. Solução de Ácido cloroáurico preparada nessa concentração resultará em uma BSA, à relação entre Au 01:13.
   1. Em alternativa, preparar uma solução de Ácido cloroáurico com uma concentração de em qualquer lugar entre 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) de 20 mM (BSA:Au = 01:50) em HPLC grau água.
      N....

Resultados

De fluorescência do complexo BSA-Au(III), tem sido observado que a conversão da fluorescência azul intrínseca de BSA (λ_em = 400 nm) para fluorescência vermelha (λ_em = 640 nm) ocorre no sobre pH 9,7 através de um equilíbrio transição (Figura 1). EEM de BSA-Au(III) no BSA diferente rácios molar Au é mostrado na Figura 2, e esses dados mostram como alterar as proporções molares produz o mesmo .......

Discussão

Os compostos de BSA-Au(III) preparados em pH 12 apresentam fluorescência vermelha em um comprimento de onda de emissão de λ_em= 640 nm quando excitadas com ultravioleta (UV) luz λ_ex= 365 nm (figura 1A). O aparecimento de fluorescência vermelha é um processo lento e levará alguns dias à temperatura ambiente para aumentar a uma intensidade máxima. Executando a reação a 37 ° C irá produzir os melhores resultados, apesar de temperatura mais elevada pode ser usada pa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino (BSA), 96%	Sigma-Aldrich	A5611
cloreto de ouro (III) tri-hidratado, 99,9%	Sigma-Aldrich	520918
cloreto de cobre (II) di-hidratado, 99,999%	Sigma-Aldrich	459097
cloreto de níquel (II) hexahidratado, 99,9%	Sigma-Aldrich	654507
N-etilmaleimida (NEM), >99,0%	Cloridrato de Tris	4259
(TCEP), >98,0%	Sigma-Aldrich	C4706
Hidróxido de sódio, > 98,0%	Sigma-Aldrich	S8045
Uréia, 99,5%	Chem-Implex Int'l	30142
Solução salina tamponada com fospato (PBS)	Corning	MT21040CV
Bicarbonato de amônio, 99,5%	Sigma-Aldrich	9830

(2-carboxietil) fosfina Sigma-Aldrich