Artigo de método

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

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DOI:

10.3791/58145

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19 de agosto de 2018

 , 
1Department of Surgery, Houston Methodist Hospital Research Institute, 2Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, Weill Cornell Medical College, Houston Methodist Hospital

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para um ex vivo pulmão câncer modelo que imita as etapas de progressão do tumor e ajuda a isolar um tumor primário, circulam células tumorais e lesões metastáticas.

Resumo

É difícil isolar células tumorais em diferentes pontos da progressão do tumor. Criamos um ex vivo modelo de pulmão que pode mostrar a interação de células tumorais com uma matriz natural e contínuo fluxo de nutrientes, bem como um modelo que mostra a interação de células tumorais com componentes celulares normais e uma matriz natural. O modelo de pulmão acelular ex vivo é criado, isolando um bloco de coração-pulmão de rato e removendo todas as células usando o processo de decellularization. O brônquio principal direito é amarrado e células tumorais são colocadas na traqueia por uma seringa. As células se mover e preenchem o pulmão esquerdo. O pulmão é então colocado em um bioreator onde a artéria pulmonar recebe um fluxo contínuo de mídia em circuito fechado. O tumor crescido no pulmão esquerdo é o tumor primário. As células do tumor que são isoladas nos meios circulantes circulam células tumorais e as células do tumor no pulmão direito são lesões metastáticas. O modelo de pulmão celular ex vivo é criado por ignorar o processo de decellularization. Cada modelo pode ser usado para responder a perguntas de pesquisa diferente.

Introdução

Metástase do cancro é o culpado por trás da maioria das mortes relacionadas ao câncer e representa o desafio final no esforço para combater o câncer. O objetivo geral deste método é desenhar um protocolo para uma cultura de quadridimensional (4D) de celular que tem uma dimensão de fluxo, além do crescimento tridimensional (3D) celular. Ele representa as três fases distintas do processo de metástase [isto é, o tumor primário, circulam células tumorais (CTC) e lesões metastáticas].

Nas últimas três décadas, os cientistas ao redor do mundo gerou uma riqueza incomparável de informações para entender os mecanismos subjacentes a progressão metastática em diferentes tipos de câncer que melhorou a perspectiva de uma cura ou sobrevivência livre de progressão. O manejo clínico de alguns tipos de câncer, como câncer de mama, melhorou significativamente a1; no entanto, alguns tipos de câncer, como câncer de pulmão, ainda têm uma sobrevivência pobre2. Modelos animais in vitro e in vivo têm sido fundamentais para gerar novos insights sobre os mecanismos que sustentam o desenvolvimento da doença. Nos últimos anos, linha-derivado xenografts (CDX) de célula e paciente-derivado xenografts (PDX) tem sido de mais interesse como preservam muitas características relevantes do tumor primário humano3, tais como a cinética de crescimento, características histológicas, comportamentais características e a resposta à terapia. No entanto, cada modelo tem suas limitações para entender o mecanismo de formação do CTC e metástases de um órgão distante4,5,6.

Recentemente, desenvolvemos um modelo de câncer de pulmão 4-D, ex vivo , utilizando o conceito de reengenharia de órgão e cultura de células com base em perfusão. Ele imita o crescimento do câncer de pulmão humano através da formação de nódulos de tumor perfusable que crescem ao longo do tempo com um semelhante humano câncer-secretada proteína produção7. Ele representa a assinatura de expressão do gene que prevê pobre sobrevida em pacientes com câncer e também mostra uma resposta terapêutica pela regressão do tumor com cisplatina tratamento8,9. O modelo de pulmão mais foi modificado para que ele possa formar lesões metastáticas. O CTC desenvolver a partir de um tumor primário e intravasate na vasculatura e extravasate para o pulmão contralateral para formar lesões metastáticas10. Estudos de expressão do gene sugerem um perfil de expressão distintas do tumor primário, o CTC e as lesões metastáticas e o upregulation do subconjunto de genes necessários para o fenótipo10. Este processo metastático ocorre devido à presença de condições biológicas, visto em pacientes com câncer. A vantagem desse modelo é a presença de uma matriz natural e arquitetura e uma perfusão de nutrientes que leva à formação de nódulos de tumor. Além disso, ele também fornece uma oportunidade para estudar os efeitos dos diferentes componentes do microambiente do tumor ou drogas na progressão do tumor ao longo do tempo. Este modelo pode ser usado para crescer um intervalo de células de câncer (câncer de pulmão, câncer de mama, sarcoma, etc.) em uma configuração de laboratório.

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Protocolo

Protocolos para experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Instituto de pesquisa de Metodista de Houston e institucional Cuidado Animal e efectuados em conformidade com todos os regulamentos, leis, diretrizes e políticas.

1. colheita de pulmão do rato

  1. Anestesia um rato Sprague-Dawley masculino de 4 a 6 semanas de idade por uma injeção intraperitoneal de (IP) da cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em seu flanco. Certifique-se de anestesia, verificando-se uma ausência de movimento quando o dedo do pé do membro posterior é comprimido com fórceps.
  2. Depois de 10 min, depilar o peito e abdômen e limpe a pele com um cotonete de clorexidina.
  3. Retire a pele por pegá-la com a pinça e por isso incisão com um bisturi descartável. Após a abertura da cavidade torácica por incisão com bisturi, realizar uma toracotomia bilateral por um corte do lado anterior da caixa torácica à esquerda e à direita do diafragma com uma tesoura.
    Nota: Esta é uma cirurgia não-sobrevivência.
  4. Sustenha a caixa torácica e injetar 2 mL de heparina (1 000 unidades/mL) no ventrículo direito do coração batendo usando uma agulha 27G.
    Nota: Isto impedirá qualquer formação de coágulos de sangue no pulmão.
  5. Completamente, retire a caixa torácica com uma tesoura e coloque uma agulha de 18 G no ventrículo esquerdo como um respiradouro, até que o sangue sai. Em seguida, injete 15 mL de tampão fosfato soro fisiológico heparinizado (12,5 unidades/mL; heparinizada PBS) do ventrículo direito, usando uma agulha de 25 G.
  6. Corte o superior e inferior veia cava, duas grandes veias do lado direito do coração e liberar os pulmões com um adicional de 10 mL de PBS heparinizado no ventrículo direito, usando uma agulha 27G.
    Nota: A veia cava inferior é visualizada sob o fundo do coração como um grande navio cheio de sangue vermelho. Da mesma forma, a veia cava superior é visualizado na parte superior do coração como um grande navio.
  7. Corte da traqueia na base da tireoide. Remova cuidadosamente a aorta descendente, ao nível da veia hemiazygos e ramificações da aorta no arco.
  8. Retire o bloco de coração-pulmão da cavidade torácica e o resto do corpo do rato.
  9. Executar ventriculostomia cortando metade dos ventrículos direito e esquerdos e coloque uma cânula de agulha de aço inoxidável sob medida pré-carregadas 18g através do ventrículo direito para a artéria pulmonar (PA).
  10. Fixar a cânula com uma gravata de seda 2-0 e expor cuidadosamente o ventrículo direito e o átrio.
  11. Coloque um anteparo Luer fêmea no ventrículo esquerdo e fixe-a com um laço de seda 2-0.
  12. Liberar o bloco de coração-pulmão com 20 mL de PBS heparinizada através da cânula de PA e colocá-lo em um tubo de 50 mL contendo meios de cultura ou PBS heparinizada.
    Nota: Para um modelo de celular, vá para o passo 3.1 para configurar o biorreator. Para um modelo acelular, siga para o passo 2.1 para o decellularization.

2. pulmão Decellularization

  1. Preparação da unidade de decellularization
    1. Prepare cada câmara decellularization/bottle, piercing dois furos na tampa de garrafa e encaixe um Luer fêmea nos furos (figura 1A e 1B). Fixe-a com um anel de nylon preto do outro lado. Da mesma forma, faça um único furo na outra tampa de garrafa para o acessório de conjunto por via venosa (Figura 1).
      Nota: Figura 1A e 1B têm as tampas de garrafa mesmo dos dois lados diferentes. Figura 1 é de um tampão diferente com um único furo, como dito acima, na etapa 2.1.1.
    2. Anexe um tubo de 0,5 polegadas (na artéria pulmonar ou final do PA) e tubos de 6 polegadas (Figura 1J) para um fêmea Luer de dentro as tampas dos frascos (figura 1A e 1B) e anexar um conector Luer-lock macho nas extremidades. Defina o bloqueio com uma garrafa de 500 mL como a câmara de decellularization/garrafa.
    3. Conecte uma extremidade de dois tubos de 2 ft (que são conectados com um conector Luer-lock macho) ou extremidades do tubo da bomba (Figura 1-H), que é anexado a cabeça da bomba (Figura 1E e 1F) por um cartucho (Figura 1), com um conector Luer fêmea bloqueio (Figura 1I).
    4. Ligue as outras extremidades dos pés 2 tubos (da etapa 2.1.3) cada para uma cabeça de bloqueio Luer fêmea na tampa da câmara/frasco de decellularization (Figura 1 L).
    5. Configurar um 250ml heparinizado garrafa de PBS (com 200 mL de PBS) pendurando um frasco invertido em um carrinho com a extremidade proximal de um conjunto por via venosa (Figura 1) inserido na tampa da garrafa e a extremidade distal, substituir o tubo de 2ft ligado ao c decellularization HAMBER/garrafa no final PA (figura 1B). Este tubo de 2ft Conecte o frasco de descarte.
      Nota: As garrafas são definidas no cartão, como mostrado na Figura 1 K. Os tubos intravenosos saem as garrafas de suspensão para dispensar os reagentes o andaime do pulmão.
  2. Processo de decellularization de pulmão
    1. Executar a PBS heparinizada sob uma pressão de perfusão fisiológica de 30 mm Hg (Figura 1 K) até que flui livremente na câmara decellularization/garrafa e, em seguida, coloque o coração-pulmão de final através da cânula de PA PA.
    2. Continua a correr a bomba continuamente, para que qualquer excesso/solução-tampão no interior da câmara de decellularization/garrafa fica descartada.
    3. Execute a PBS heparinizada através do PA por 15 min a uma pressão de perfusão de 30 mm Hg para a lavagem inicial (Figura 1 K).
    4. Substitua a garrafa de PBS heparinizada 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água desionizada e perfundir o pulmão para 2h para o decellularization.
    5. Após o decellularization, perfundir deionizada esterilizada através do andaime de pulmão por 15 min.
    6. Em seguida, perfundir 1% de detergente não-iônico em água desionizada para 10 min.
    7. Substitua a câmara de decellularization/garrafa com 500 mL de PBS autoclavado suplementadas com antibióticos de x 1 (penicilina-estreptomicina anfotericina), mantendo o pulmão de suspensão intacta com a tampa no interior da garrafa.
    8. Descarte a intravenosa definido, colocar o tubo de 2ft anexado ao contêiner descartando volta para o final de artéria pulmonar da câmara de decellularization e ligar a bomba em 6 mL/min (Figura 1 L).
    9. Perfundir os pulmões para 72 h e muda a PBS com antibióticos cada 12 h.
      Nota: O pulmão acelular está pronto para uso imediato. Pode ser armazenado no-80 ˚ c Membros até que seja necessário. Se manchas rosa ou coágulos de sangue pode ser visualizados claramente dos lóbulos pulmonares, descarte o pulmão. É possível testar aleatoriamente para DNA ou histopatologia. Um pulmão completo acelular não mostrará as células e 99,9% do DNA lavagem.
      Nota: Quando estiver trabalhando com um modelo de celular do pulmão, ignore a decellularization. O pulmão colhido (etapa 1) pode ser definido diretamente no bioreator.

3. biorreator set-up

  1. Prepare a garrafa de biorreator e os itens necessários para a instalação.
    1. Faça três furos em uma tampa de garrafa de 500 mL, a uma distância igual e corrigir um Luer fêmea em todos os três furos, usando anéis de nylon preto (Figura 2A e 2B).
      Nota: Em dois furos, conector Luer lock termina cara fora, enquanto uma extremidade faces dentro da garrafa.
    2. Corte um 6 no tubo da bomba, de 2 em tubo, um 6 no tubo, um tubo de 1,5 ft, um tubo de 2 ft e um tubo de oxigenador de 10 pés por biorreator.
    3. Uma agulha de aço inoxidável de 18 G e, novamente, ligar as extremidades com tubos biocompatíveis para uma cânula traqueal.
    4. Enrole o tubo oxigenador, com conectores Luer lock nas extremidades, em um engranzamento de fio do solenoide usando fitas de autoclave (Figura 2).
    5. Autoclave a acima mencionado itens e mantê-los em UV luz por 10 min.
  2. Configurar a bomba dentro da incubadora de cultura de célula normal (37 ° C, 5% CO2), com espaçamento adequado entre as bandejas para caber facilmente uma garrafa de 500 mL.
  3. Pulverizar o etanol a 70% no cartucho da bomba e conecte o tubo da bomba com conectores de fêmea Luer lock em ambas as extremidades da bomba.
  4. Configure o oxigenador enrolado o engranzamento de fio do solenoide dentro da incubadora de cultura celular, conectando-se uma extremidade (vazão) do oxigenador para o tubo da bomba e a outra extremidade com o tubo de 1,5 ft em bioreator.
  5. Configure a garrafa de biorreator em Biossegurança uma armário com condições assépticas.
    1. Anexar uma torneira de 3 vias (amarela) à cabeça de um do Luers feminino para controlar o fluxo através de PA.
    2. Conecte a uma torneira de passagem só de ida (azul) para outro anteparo de bloqueio Luer fêmea para célula propagação através da traqueia (Figura 2F).
    3. Ligue 2 na tubulação do lado de fora (branco) e 6 na tubagem no interior da garrafa para circular com a mídia para fora. Encaixar um conector Luer-lock macho para um tubo de 2 ft e anexar um estilo de talão Luer fêmea Tee para fornecer acessibilidade para adicionar ou remover qualquer coisa.
    4. Anexe uma torneira de passagem só de ida para uma das aberturas do conector de três vias (feminino estilo Luer talão Tee).
    5. Anexe um conector Luer-lock macho e uma fêmea Luer-lock para tubos de 2 ft.
    6. Adicionar 200 mL de RPMI1640 com 10% FBS e 1% antibióticos meio de cultura celular (varia como pela exigência de célula) e transferir o biorreator para a incubadora. Conecte o tubo oxigenador para as duas extremidades abertas (válvula unidirecional e conector Tee) para torná-lo um biorreator de loop fechado.
  6. Pre-funcionar a bomba em 6 mL/min dentro da incubadora de cultura celular com meio de cultura celular para preencher o oxigenador e tubos, para que nenhuma bolha de ar existe no tubo.
  7. Uma vez que os tubos são preenchidos com mídia, fechar a torneira e retire a garrafa de biorreator a incubadora desconectando os oxigenadores de ambos os lados da garrafa biorreator.
  8. Coloque a garrafa de biorreator na biossegurança do armário, passar de meios de cultura através da torneira e anexar a cânula de PA de cadafalso pulmão (acelular ou celular) para a válvula de passagem através do conector Luer macho.
    Nota: Aqui é possível usar o modelo acelular (após o processo de decellularization) ou um bloco de coração-pulmão recém-colhidas (ou seja, o modelo de celular, que mantém as células de rato nativo).
  9. Passe de meios de cultura, através de uma torneira de passagem só de ida para remover todo o ar e amarre a cânula traqueal por um fio de seda para a traqueia.
  10. Certifique-se de evitar qualquer torção do PA e traqueia. Fechar a tampa do frasco de biorreator com o pulmão andaime dentro e, novamente, assepticamente transferir o biorreator para a incubadora e ligue a bomba a uma velocidade de 6 mL/min.
  11. Meios de cultura para 10-15 min certificar-se de executar todos os lóbulos se inflado e o pulmão parece em boa forma (Figura 2).

4. metástase modelo e propagação de células

Nota: Proceda à semeadura com o modelo de pulmão acima para um estudo de crescimento de tumor primário de célula. Modifica o andaime de pulmão (acelular ou celular) da seguinte forma para o modelo metastático.

  1. Retire o biorreator com o andaime de pulmão da incubadora e colocá-lo na biossegurança do armário.
  2. Use uma seringa de Luer lock para passar 5 mL de meios de cultura através da traqueia e abra a tampa do biorreator com o enforcamento andaime de pulmão (Figura 2F).
  3. Neste passo, mais uma pessoa é necessário para ajudar na modificação do pulmão para um modelo metastático.
  4. Obter seda 2-0 pronto e usar fórceps angular para fazer um passe através da traqueia no ponto de bifurcação.
  5. Amarre a traqueia para o pulmão direito no ponto de bifurcação e verificar o livre fluxo de mídia através da traqueia para o pulmão esquerdo, passando de meios de cultura.
    Nota: Uma vez que a traqueia está ligada no ponto de bifurcação, células semeadas através da traqueia serão automaticamente direcionadas para semente para o lóbulo esquerdo. Ele possa ser testado antes da semeadura das células por meios de cultura empurrando através da traqueia. No modelo metastático, a mídia irá mover para os lobos esquerdos apenas, que inflará, e não os lóbulos certo10.
  6. Definir uma seringa de lock 20ml Luer em cima da cânula traqueal e adicionar células de câncer de pulmão ATCC (A549, H1299) em 50 mL de meios de cultura RPMI1640 completo (Figura 2F).
  7. Execute a célula semeadura no armário a biossegurança. Adicionar 15 mL de células na seringa e deixá-lo passar os lóbulos pulmonares pela gravidade. Adicione o restante das células antes que quaisquer bolhas de ar passam.
  8. No pulmão acelular semeadura, recolher a mídia perfundida escorrendo da garrafa de biorreator e deixá-la passar através da traqueia novamente 3x.
    Nota: A mídia perfundida, às vezes, tem as células cancerosas semeadas. Portanto, para a propagação eficiente, recolocada a mídia na traqueia através da seringa.
  9. Uma vez semeado, remova a seringa, esperar 15 min, adicionar mídia fresca e retornar o biorreator volta para uma incubadora. Remova quaisquer bolhas de ar na tubulação.
  10. Ligue a bomba para perfundir os meios de comunicação em 6 mL/min.

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Resultados

O pulmão de rato colhido mantém intacta vasculatura e alvéolos11 (Figura 3A e 3B). Sobre decellularization, os componentes de matriz extracelular de um pulmão acelular, tais como a fibronectina, colágeno e elastina, conservam-se11 (Figura 3, 3D, 3Ee 3F). O decellularization leva a uma completa remoção das células de...

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Discussão

O pulmão ex vivo 4-D fornece uma oportunidade para estudar o crescimento do tumor e metástases em uma configuração de laboratório. Uma matriz de pulmão nativo é um sistema complexo que oferece suporte ao tecido normal e mantém interações célula-célula, interações célula-matriz, diferenciação celular e organização do tecido. Ele fornece uma oportunidade para adicionar quaisquer componentes de microambiente do tumor para estudar seus efeitos sobre o crescimento do tumor e a interação com outras células.

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Min P. Kim recebeu apoio de concessão o segundo John W. Kirklin bolsa de pesquisa, associação americana para torácica cirurgia, Graham Research Foundation, Houston Metodista especialidade médico grupo Grant e Michael M. e Joann H. Cone Research Award. Agradecemos a Ann Saikin para o idioma de edição do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sprague Dowley ratHarlan206MMacho
Cotonete de clorexidinaPrevantics, NY, EUANDC 10819-1080-1
HeparinaSagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, EUANDC 25021-400-10
Agulha de calibre 18McMaster Carr, EUA75165A249
Gravata de seda 2-0Ethicon, San Angelo, TX, EUAA305H
Bomba Masterflex L/SCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUAEW-07554-80
Cabeça da bomba Masterflex L/SCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUAEW-07519-05
Cartucho da bomba Masterflex L/SCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUAEW-07519-70
Tygon TubeCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUA14171211
Tubo da bomba MasterFlexCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA06598-16
Conectores de trava luer fêmeaCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45508-3475165A249
Conectores de trava luer machoCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA45513-04
anel de nylon pretoCole-Parmer, Vernon Hills, IL, USAEW-45509-04
Conjunto intravenosoCareFusion41134E
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)Fisher ScientificCAS151-21-3
Triton X-100Sigma-AldrichX100-1L
AntibióticosGibco15240-062
Oxigenador de siliconeCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUAABW00011Saint-GoBain-Malha de
arame1164610105LowesNew York Fio
Fêmea Luer Lug Estilo TEECole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUA45508-56
Macho luer anel de bloqueio integral para 200series BarbCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUA45518-08
Acoplador de estilo de rosca luer fêmeaCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUA45508-22
Conector de claveICU Medical11956
Hi-Flo ™ Torneira de 4 vias com chave giratória masculina luer locksmith MedicalMX9341L
MasterFlex Tubo de bombaCole-Parmer, Vernon Hills, IL, EUA06598-13para cânula

Referências

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