Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a técnica de oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa (ECMO) em um não-intubado, espontaneamente respiração mouse. Este modelo murino de ECMO pode ser efetivamente implementado em estudos experimentais de aguda e doenças pulmonares de estágio final.
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Artigo de método
Oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa em um rato
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso de oxigenação de membrana extracorpórea (ECMO) tem aumentado substancialmente nos últimos anos. ECMO tornou-se uma terapia eficaz e confiável para aguda, bem como doenças de pulmão estágio final. Com o aumento da demanda de clínica e uso prolongado de ECMO, otimização processual e prevenção de danos em vários órgãos são de importância crucial. O objectivo do presente protocolo é apresentar uma técnica detalhada de ECMO veno-venosa em um não-entubada, respirando espontaneamente do mouse. Este protocolo demonstra o desenho técnico do ECMO e etapas cirúrgicas. Este modelo murino de ECMO facilitará o estudo da fisiopatologia relacionada com ECMO (por exemplo, inflamação, eventos tromboembólicos e sangramento). Devido à abundância de ratos geneticamente modificados, os mecanismos moleculares envolvidos nas complicações relacionadas com o ECMO podem também ser dissecados.
Introdução
Oxigenação de membrana extracorpórea (ECMO) é um sistema de suporte de vida temporária que assume as funções dos pulmões e coração para permitir que a perfusão e a troca gasosa adequada. Hill et al1 descreveu o primeiro uso do ECMO em pacientes em 1972; no entanto, só se tornou amplamente utilizada após a sua aplicação bem sucedida durante o H1N1 da gripe pandêmica em 20092. Hoje, o ECMO rotineiramente é usada como um procedimento de salva-vidas em estágio final coração e pulmão doenças3. ECMO veno-venosa é cada vez mais empregado como uma alternativa para a ventilação mecânica invasiva em acordada, não-entubada, respirando espontaneamente a pacientes com insuficiência respiratória refratários4.
Apesar da sua adopção generalizada, diversas complicações têm sido relatadas para o ECMO5,6,7. Complicações que podem ser experienciadas por pacientes em ECMO incluem hemorragia, trombose, sepse, trombocitopenia, disfunções relacionadas ao dispositivo e embolia gasosa. Além disso, uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), resultando em danos nos órgãos multi é bem descrita clinicamente e em estudos experimentais8,9. Complicações neurológicas como infarto cerebral são também frequentemente relatadas em pacientes submetidos a terapia a longo prazo do ECMO. Para confundir matérias, muitas vezes é difícil distinguir se as complicações são causadas pelo ECMO em si ou surgem os distúrbios subjacentes que acompanha aguda e doenças da fase final.
Para estudar especificamente os efeitos do ECMO em um organismo saudável, deve ser estabelecido um modelo animal experimental confiável. Há muito poucos relatórios sobre o desempenho do ECMO em pequenos animais e são todos limitados aos ratos. Até à data, nenhum modelo do rato do ECMO tem sido descrito na literatura. Devido à disponibilidade de um grande número de estirpes de rato geneticamente modificado, estabelecimento de um modelo de ECMO mouse permitiria mais investigação dos mecanismos moleculares envolvidos em complicações relacionadas à ECMO10,11.
Com base no nosso modelo murino descrito anteriormente de extracorpórea (CEC)12, nós desenvolvemos um método estável de ECMO veno-venosa em não-entubada, respirando espontaneamente ratos. O circuito ECMO (Figura 1), que contém o efluxo e cânulas de afluência, uma bomba peristáltica, oxigenador e retêm o ar reservatório, é semelhante ao nosso modelo descrito anteriormente de murino CPB12 com exceção de ter uma menor escorva volume (0,5 mL). Este protocolo demonstra as técnicas detalhadas, monitorização fisiológica e gasometria arterial envolvida em um processo bem sucedido de ECMO.
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Protocolo
Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 machos, com idade de 12 semanas. Este estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes da lei alemã Animal sob protocolo TSA 16/2250.
1. materiais preparação
Nota: Todas as etapas são executadas em condições limpas, não estéril. Condições estéreis seria necessárias se o animal é para ser sobreviveu no pós-operatório.
- Introduza um tubo de poliuretano 2-Fr usando uma lâmina cirúrgica sob um microscópio com ampliação de 16 X 3 fenestrações.
Nota: Todas as fenestrações devem estar localizadas no terço distal da cânula para garantir a drenagem de sangue ideal. - Prepare a solução de escorva (Tabela de materiais). Incluem 30 UI/mL heparina e 2,5% v/v de uma solução de 8,4% do NaHCO3. Leve à geladeira esta solução a 4 ° C até que esteja pronto para usar. Prime do circuito com 500 uL de solução de escorva.
- Coloque a cânula de saída para a solução de escorva e encher a máquina ECMO por ligar a bomba peristáltica. Continuam a circular a solução de escorva através da máquina para o próximo 30 min a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
- Dê 0,5 L/min de oxigênio a 100% para o oxigenador.
2. anestesia
- Lugar do animal em uma câmara de indução preenchido com uma mistura de oxigênio/isoflurano 2,5% v/v. Fornece 0,5 L/min de oxigênio a 100% para o vaporizador. Antes da cirurgia, verificar que a anestesia completa é alcançada através do teste de pedais reflexos de retirada e dor. Aplica o gel de olho para evitar danos de secagem.
- Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo em 37 ° C.
- Realizar a anestesia de máscara de inalação usando um vaporizador de isoflurano e injetar carprofeno 5 mg/kg por via subcutânea.
- Regularmente, observar a respiração espontânea e ajustar a concentração de isoflurano, de modo que é entre 1,3 e 2,5%.
3. cirurgia
- Expor a veia jugular esquerda, usando uma incisão de pele lateral de 4 mm, com a ajuda de uma tesoura bem no lado esquerdo do pescoço. Juntamente com a preparação afiada e contundente, usando cotonetes de algodão e microfórceps, use bipolar coagulação dos pequenos vasos.
- Uma vez que a veia jugular esquerda é exposta, ligate a parte distal, usando uma sutura de seda de 8-0, com a ajuda de microfórceps.
- Coloque um nó de deslizamento na extremidade proximal da veia. Incise a parede anterior da veia utilizando microtesoura.
- Para atingir a heparinização plena, injete heparina de 2,5 UI/g em veia jugular através de um braunula de 26 G.
- Levante o lado da cabeça do animal pad 30 ° para evitar a perda excessiva de sangue da veia durante a inserção da cânula.
- Introduza uma cânula de (PU) poliuretano 2-Fr a parte proximal da veia jugular, gire-o levemente enquanto empurra-lo a uma profundidade de 4 cm; Enquanto isso, se alcançará a bifurcação ilíaca da veia cava inferior (VCI).
- Fixe a cânula com nodos seda 8-0, usando um microfórceps.
- Expor a veia jugular direita, usando as etapas descritas em 3.1, 3.2 e 3.3.
- Canule a veia jugular direita com uma cânula de PU 1-Fr e movê-lo suavemente 5 mm na direção do átrio direito.
- Repita a etapa 3.7.
- Cateterismo da artéria femoral esquerda com outra cânula de PU 1-Fr e usá-lo para pressão invasiva, monitorização, bem como a amostra de sangue para gasometria arterial (BGA).
- Inserir agulhas de eletrocardiograma (ECG) conectadas a um dispositivo de aquisição de dados por via subcutânea, em ambas as patas dianteiras e na parede torácica esquerda.
- Inserir um termômetro retal, conectado a um dispositivo de aquisição de dados.
4. oxigenação de membrana extracorpórea Veno-venosa e arterial
Nota: Para um diagrama esquemático do circuito de ECMO completo, veja a Figura 1.
- Inicie o ECMO do animal ao ligar a bomba com uma taxa de fluxo inicial de 0,1 mL/min. Ajuste a taxa de fluxo da bomba dentro o próximo 2 min para 3-5 mL/min.
- No caso de sucção de ar na cânula de saída através de cânulas, reduzir o fluxo e adicionar 0,1 mL de solução de escorva ao circuito através de um reservatório de ar-caça com armadilhas.
- Sob fluxo estável, continue a monitorar o modo em tempo real todos os parâmetros vitais através do dispositivo de aquisição de dados.
- Observar o refluxo da drenagem venosa e constantemente monitorar o nível de sangue no reservatório de ar-caçador.
- Colete sangue vazando de feridas em uma 1 cc seringa com a ponta de um 24 G branula andreturn-para o circuito ECMO através do reservatório de ar retêm.
- Para BGA, use um cartucho de recolha de amostras de sangue para coletar aproximadamente 75 µ l de sangue arterial para os seguintes pontos de tempo e nos seguintes locais:
- 10 min após o início do ECMO, coletar sangue da veia cava inferior através de um tubo extra construído em antes o oxigenador, através do tubo extra semelhante após oxigenador (controle) e diretamente da artéria femoral.
- 30 min após o início do ECMO, coletar sangue da artéria femoral.
- Dar um extra 0,1 mL da solução de escorva para compensar a perda de líquido intravasal cada 45 min através do ar-caçador ou cateter da artéria femoral ou sugando as bolhas de ar através da cânula de drenagem do sangue.
- Para BGA, use um cartucho de recolha de amostras de sangue para coletar aproximadamente 75 µ l de sangue arterial:
- 1 h após o início do ECMO da artéria femoral.
- 2 h após o início do ECMO, coletar sangue da veia cava inferior através de um tubo extra construído em antes o oxigenador, através do tubo extra semelhante após oxigenador (controle) e diretamente da artéria femoral.
- Após 2 h, reduza a taxa de fluxo da bomba gradualmente (ao longo de 5 min), assim parando ECMO.
- Continue a gravar parâmetros vitais por mais 10 minutos.
- Termine o experimento por corrermos o animal e colheita de sangue e órgãos.
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Resultados
Este protocolo descreve o método de ECMO veno-venosa em um rato. Este modelo é confiável e reprodutível e em relação ao nosso modelo descrito anteriormente de CEC com detenção respiratória e circulatória12,13, é tecnicamente menos exigente estabelecer.
Fluxo ECMO no sistema venoso foi mantido entre 1,5 e 5 mL/min. A pressão arterial média foi mantida entre 70 e 85 mmHg, ...
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Discussão
Anteriormente, nós descrevemos um modelo bem sucedido de CEC em um rato12,13. Para implementar esse modelo para aguda ou doenças de pulmão estágio final desenvolvemos um circuito ECMO veno-venosa easy-to-use para ratos. Diferente para o modelo do CPB, veno-venosa ECMO não requer procedimentos cirúrgicos complicados como esternotomia e aperto da aorta, reduzindo assim o risco de sangramento de ferimento em um animal totalmente heparinizado. Para evitar a embolizaç...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este projecto foi apoiado por concessão de 311 KFC do Deutsche Forschungsgemeinschaft.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | em 1:1 com Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | em 1:1 com Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 UI por ml de solução de primer |
| NaHCO3 8,4% | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% em solução de priming |
| Carprofeno | Zoetis Inc., EUA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Cateter | Instechlabs INC., EUA | C10PU-MCA1301 | artéria carótida |
| 2 Fr PU Cateter | Instechlabs INC., EUA | C20PU-MJV1302 | veia jugular |
| 8-0 Sutura de seda trançada | Ashaway Line & Twine Co., EUA | 75290 | ligadura |
| Isoflurano | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcose |
| Tesoura de mola - lâminas de 6 mm | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instrumentos |
| Tesoura de mola - lâminas de 2 mm | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instrumentos |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | Instrumentos |
| Dumont #55 Fórceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instrumentos |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instrumentos |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instrumentos |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instrumentos |
| Isoflurano Vaporizador Drager 19.1 | Drä gerwerk AG & Co. KGaA | anestesia 1,3 -2,5% | |
| Dispositivo de aquisição de dados multicanal com software ISOHEART | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Alemanha | pressão invasiva, ECG, t ° Dispositivo | |
| portátil C i-STAT | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, EUA | gasometria | |
| Cartuchos i-STAT CG4+ e CG8+ | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, EUA | gasometria | |
| C57Bl/6 camundongos, macho, 30 g, 14 semanas de idade | Charles River Laboratories | alojado 1 semana antes |
Referências
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- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
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Reimpressões e permissões
