Artigo de método

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

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DOI:

10.3791/58149

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18 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Neste artigo

Resumo

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Resumo

Estudar o Regulamento de efferocytosis requer métodos que são capazes de quantificar com precisão a absorção de pilhas apoptotic e sondar os processos de sinalização e celulares que controlam o efferocytosis. Esta quantificação pode ser difícil de executar como pilhas apoptotic são frequentemente efferocytosed fragmentada, necessitando de métodos que podem delinear com precisão entre a parte de efferocytosed de um alvo de apoptotic contra residual celular unengulfed fragmentos. A abordagem descrita neste documento utiliza abordagens dual-rotulagem para quantificar com precisão a dinâmica da capacidade de efferocytosis e efferocytic de efferocytes tais como macrófagos. O citoplasma da célula apoptótica é rotulado com uma tintura de seguimento-celular para habilitar o monitoramento de todos os materiais derivado de células apoptóticas, enquanto biotinylation superfície da célula apoptótica permite a diferenciação entre interiorizado e não-internalizada fracções de células apoptóticas. A capacidade de efferocytic de efferocytes é determinada pela tomada de imagens fluorescentes de células vivas ou fixas e quantificar a quantidade de limite contra alvos interiorizados, como diferenciados pela coloração de estreptavidina. Essa abordagem oferece diversas vantagens sobre os métodos tais como citometria de fluxo, ou seja a delimitação exata de não-efferocytosed contra efferocytosed apoptotic fracções de célula, a capacidade de medir efferocytic dinâmica por microscopia de viver-pilha e o capacidade para realizar estudos de sinalização celular em células expressando transgenes fluorescente-etiquetadas. Os métodos descritos neste protocolo combinado, servem como base para uma abordagem experimental flexível que pode ser usada para quantificar com precisão a atividade efferocytic e interrogar as vias de sinalização celulares ativas durante efferocytosis.

Introdução

Apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico que ocorre na maioria dos organismos multicelulares e é crucial para seu desenvolvimento e homeostase1altamente regulamentados. Além de estar envolvido na renovação celular normal e o desenvolvimento embrionário, apoptose permite a eliminação de células infectadas ou danificadas de tecidos e pode ser acionado em resposta à infecção, inflamação, câncer e também por intervenções médicas como a radioterapia ou esteroides1. Células apoptóticas expõem "coma-me" sinais em sua superfície celular, que são reconhecidos pelos receptores em um intervalo de fagócitos profissionais e não profissionais, referidos coletivamente como "efferocytes". Engajamento desses receptores induz a absorção e a degradação da célula apoptótica pelo efferocyte através de um processo conhecido como efferocytosis2,3. A fosfatidilserina é o melhor caracterizadas comer-me sinal de condução efferocytosis. Normalmente é pequeno para o folheto interno da membrana plasmática, com apoptose ativando um scramblase de lipídios que interrompe esta assimetria da membrana, expondo assim a fosfatidilserina na superfície celular4. A fosfatidilserina é encontrada na superfície de algumas células não-apoptotic, tais como os macrófagos maduros extracelular e ativado plaquetas. No entanto, estas células não são efferocytosed devido à presença de sinais "não me coma", tais como CD47, na sua célula superfície5,6,7. Exposta a fosfatidilserina é reconhecida por uma matriz de receptores efferocytic expressado por efferocytes. Vinculação destes receptores de fosfatidilserina, directamente ou através da ajuda de opsoninas, ativa vias de sinalização que promovem a absorção da célula apoptótica em um vacuole membrana-limite denominado o efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. o efferosome funde-se sequencialmente com endossomos e lisossomos, que entregam a maquinaria molecular necessária acidificar o efferosome e degradar a apoptose de células carga13,14. Uma vez degradados, os materiais de derivado de células apoptóticas são traficados para o endossomo reciclagem — um processo que limita a respostas imunes aos antígenos de apoptotic derivado de células, e que podem permitir recuperação de nutrientes do apoptose celular13, 15. Uma falha no efferocytosis resulta em prejudicada afastamento de pilhas apoptotic; Estas células não compensadas eventualmente sofrem necrose secundária. Necróticas células versão pro-inflamatórios conteúdo citosólico, patógenos e auto-antigénios para o meio extracelular, assim, conduzir a uma gama de doenças infecciosas, inflamatórias e auto-imunes16,17. Juntos, apoptose e efferocytosis facilitar a remoção de células moribundos e mortas e permitir a manutenção da homeostase do tecido.

Investigar os mecanismos moleculares subjacentes efferocytosis requer métodos que fornecem uma clara quantificação da captação de células apoptóticas. Esta quantificação é complicada pelo fato de que, ao contrário de outra absorção mecanismos como endocitose e fagocitose18,19, efferocytosis não podem resultar no engulfment da célula-alvo intacta, tendo por resultado a absorção por etapas da célula apoptótica pelo efferocyte20. O protocolo descrito neste documento descreve um em vitro ensaio de efferocytosis que fornece a delimitação exata do interiorizado versus não-internalizada porções de pilhas apoptotic individuais e pode ser combinado com uma variedade de células fixas e abordagens de microscopia de viver-pilha. Ensaios de fagocitose tradicional Acrescente os anticorpos específicos para o destino fagocitária ao final do experimento para rotular alvos não-internalizada, onde, como nosso método diferem pela rotulagem o alvo de apoptotic com biotina covalentemente ligados21 , 22. enquanto os anticorpos específicos de apoptose celular podem ser usados neste ensaio, a abordagem biotinylation permite qualquer alvo de proteína-rolamento a ser rotulados e evita possíveis problemas com reactividade cruzada do anticorpo secundário se immunostaining é executada . Especificamente, descrevem a preparação de pilhas apoptotic Jurkat que foram dual-manchada com uma tintura de seguimento de célula e biotina. A célula de tintura de rastreamento permite apoptotic materiais derivados de célula a ser controlados durante a efferocytosis, Considerando que a superfície biotinylation permite a discriminação de internalizada de partes não-internalizada de pilhas apoptotic de efferocytosed. Também descrevemos a cultura e a preparação das linhas de células J774.2 e THP-1 para uso como efferocytes murino e humano, derivados de monócitos os macrófagos M2 como um exemplo de célula primária efferocytosis e células Jurkat para uso como alvos de efferocytic. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para outras linhas de célula ou células primárias, submetidos a qualquer forma de morte celular (por exemplo, apoptose, necrose e necroptosis) nas células-alvo e imita micro-empresas que simulam células apoptóticas através de revestimentos de lipídios ou revestimento com ligantes específicos a um receptor de efferocytic de interesse.

O método descrito neste protocolo tem várias vantagens sobre os métodos de fluxo cytometry baseado comumente usados no campo23,24. Por imagem diretamente a interação da célula de fagócito-apoptotic, combinada com rotulagem clara de ambos material de célula apoptótica total e não-internalizada, medidas quantitativas de efferocytosis podem ser feitas. Além disso, o uso de pH-insensível fluorophores limita confundimento fatores tais como a supressão da fluorescência FITC e GFP no pH dos lisossomos que confunde alguns métodos alternativos de25. Por último, embora não descrito em detalhe, esses métodos podem ser empregados usando efferocytes expressar transgenes fluorescente-etiquetadas, ou com pós-fixação imunocoloração, para permitir a quantificação da atividade da molécula de sinalização e controlo da processos celulares durante efferocytosis.

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Protocolo

Coleta de sangue de voluntários saudáveis foi aprovada pelo Conselho de ética de saúde ciência pesquisa da Universidade de Western Ontario. Foi realizada punção venosa em conformidade com as orientações da instrução de diretiva Tri-Conselho na pesquisa humana.

1. cultura e preparação da linha celular THP-1 monócito

  1. Monócitos THP-1 de cultura como uma cultura de suspensão em frascos T25 em 37 ° C + 5% de CO2. Células devem ser cultivadas em 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% de soro Fetal bovino (FBS).
  2. Células de suspend cada dia uniformemente em toda a mídia de crescimento, agitando suavemente o frasco, então imediatamente contar células com um hemocytometer. As células devem ser passadas uma vez que a densidade de pilha atinge 1 x 106 células/mL:
    1. Pré-aquecer o RPMI 1640 + 10% FBS em banho maria a 37 ° C.
    2. Transferência de 2 x 105 células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL ou um tubo cônico de 15 mL e pelota células por centrifugação a 500 x g, à temperatura ambiente por 5 min.
    3. Remover o sobrenadante sem perturbar o centrifugado e resuspenda o pellet em 1 mL (tubo de microcentrifuga de 1,5 mL) ou 5 mL (tubo cônico de 15 mL) de tampão fosfato salino (PBS).
    4. Centrifugar o tubo a 500 x g, à temperatura ambiente por 5 min. Retire a PBS sem perturbar o centrifugado.
    5. Ressuspender pelota em 1 mL de fresco RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. Em um novo lugar de balão T25 4 mL de mídia aquecida e para isso adicione as células ressuspensa de 1.2.5. Até que as células necessitam de passagem (geralmente 3 dias), ou até que as células são necessárias para uma experiência de cultura numa incubadora 37 ° C + 5% de CO2 .
  3. Para um experimento com THP-1-derivada de macrófagos, remova o número necessário de células do balão e placa antes da passagem:
    1. Coloque o número necessário de lamelas de vidro circular de 18 mm (espessura de 1.5 #) em poços de uma placa de 12 — normalmente 1 lamela por condição e/ou Commit. Em cada bem alíquota 5 x 104 THP-1 monócitos. O número de células adicionado a cada poço pode ser alterado, se necessário.
    2. Trazer o volume total de cada célula contendo bem a 1 mL usando RPMI + 10% FBS aquecido a 37 ° C.
    3. Adicionar 100 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) a cada poço e cultura por 3 dias para induzir a diferenciação de monócitos THP-1 em células semelhantes a macrófagos.

2. cultura e preparação da linha de celular de macrófagos J774.2

  1. Células de cultura J774.2 em frascos T25 em 37 ° C + 5% de CO2. As células devem ser cultivadas em 5 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) + 10% FBS e passadas uma vez que a cultura chegue a confluência de 80-90%. Para as células de passagem:
    1. Remova toda a mídia do balão e ascensão uma vez com 5 mL de PBS.
    2. Retire o balão de PBS e substituir com 5 mL de fresco DMEM + 10% FBS.
    3. Com uma espátula de célula, raspe o fundo do balão para suspender as células nos meios de comunicação. Pipete vigorosamente as células várias vezes para quebrar qualquer agregados celulares.
    4. Dilua as células 1:5 retirar o frasco 4 mL da suspensão celular e substituindo-o com 4 mL de mídia fresca. A suspensão de células restantes pode ser descartada, usada para iniciar uma nova cultura de células em balão T25 fresco ou usada para um experimento.
  2. Para configurar para um ensaio de efferocytosis usando células J774.2:
    1. Um dia antes do início do experimento, suspenda as células J774.2 em 5 mL de mídia fresca, conforme passos 2.1.1–2.1.3. Contar as células usando um hemocytometer e preparar o volume necessário de células em uma concentração de 5 x 104 células/mL.
    2. Coloque o número necessário de lamelas de vidro circular de 18 mm (espessura de 1.5 #) nos poços de uma placa de 12. Em cada bem alíquota 1 mL de suspensão de células de 5 x 104 células/mL.
    3. Cultura durante a noite para permitir que as células de aderir a lamela e recuperar-se de passagem.

3. cultura de macrófagos primários humanos M2

  1. Colete 10 mL de sangue heparinizado para cada placa de 12 dos macrófagos M2 necessários.
  2. Em um tubo de centrífuga de 15 mL, 5 mL de sangue humano em cima de 5 mL de meio de separação pré-aquecido poli-Lympholyte celular da camada. Preparar tubos múltiplos se processando > 5 mL de sangue, ao invés de usar tubos de volume maiores.
  3. Centrifugar a 300 x g, durante 35 minutos, usando aceleração média e sem interrupção.
  4. Remova cuidadosamente a banda rica de células mononucleares superior utilizando uma pipeta plástica e transfira para um tubo de centrífuga de 50 mL. Se vários tubos foram preparados na etapa 3.2, as bandas podem ser agrupadas em um tubo único 50 mL. Trazer o volume do tubo até 50 mL com PBS.
  5. Centrifugar a 300 x g por 8 min e retirar o sobrenadante. Durante esta etapa Coloque autoclavado 18 mm diâmetro circular lamelas (#1.5 espessura) em cada poço de uma placa de 12.
  6. Ressuspender as células em 300 µ l de soro livre RPMI 1640 por número desejado de poços; por exemplo, se 10 mL de sangue foi processada para preparar um prato bem completo 12, suspender centrifugado em 3,6 mL de mídia.
  7. Adicione 300 µ l de suspensão de célula para cada lamela contendo bem na placa de 12. Incube durante 1 h a 37 ° C + 5% de CO2.
  8. Lave delicadamente lamela 3 x com 1 mL de PBS aquecido para remover todas as células não-aderentes.
  9. Adicionar 1 mL de RPMI 1640 + 10% FBS + 10 recombinante ng/mL humana M-CSF + celular cultura antibiótico/antimicótico. Incube a 37 ° C + 5% de CO2 por 5 dias.
  10. Substituir a mídia com RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL recombinante humana M-CSF + 10 ng/mL humano recombinante IL-4 + celular cultura antibiótico/antimicótico. Incube a 37 ° C + 5% de CO2 por 2 dias completar a polarização M2.
  11. Os macrófagos polarizados devem ser usados dentro dos próximos 3 dias.

4. preparação das pilhas Apoptotic Jurkat

  1. Cultura de células Jurkat em 5 mL de RPMI 1640 + 10% FBS em 37 ° C + 5% de CO2. Jurkats são uma linha de celular de suspensão e pode ser mantidas por passagem 1:5 em mídia fresca, previamente aquecida a cada 3-5 dias.
  2. Para preparar células apoptóticas, permitir que a cultura Jurkat crescer de alta densidade (4-5 dias após a passagem). Alíquota 1,5 mL em um 1,5 mL microcentrifuga tubo e aglomerados de células por centrifugação a 500 x g durante 5 min.
  3. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 1 mL de soro livre médio de RPMI 1640 contendo 1 µM staurosporine.
  4. Incube a 16 h a 37 ° C + 5% de CO2 para processar as células apoptóticas.
  5. Se desejado, confirmar a indução de apoptose pela coloração com anexina v:
    1. Alíquota de 100 µ l de staurosporine-tratada cultura de células Jurkat num tubo microcentrifuga 1,5 mL. Células de pelotas por centrifugação a 500 x g durante 5 min, descartar o sobrenadante e ressuspender centrifugado em 100 µ l de soro livre médio de RPMI 1640.
    2. Adicione 1 µ l de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugados anexina V e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.
    3. Adicionar 900 µ l de PBS e transferir todo o volume para um único poço de uma placa de 12 contendo uma lamela de vidro circular de 18 mm (espessura de 1.5 #). Spin para baixo em uma centrífuga, equipada com um adaptador de placa a 200 x g por 1 min forçar as células a aderir a lamela. Alternativamente, as células podem ser colocadas em uma corrediça septada para a imagem latente.
    4. Imagem usando um microscópio de fluorescência.

5. quantificação da captação de Efferocytic e dinâmica usando um ensaio de Efferocytosis de células fixas e coloração de dentro para fora

  1. Prepare os macrófagos humanos THP-1, J774.2 ou M2 conforme descrito nas seções 1-3, respectivamente.
  2. À noite, antes do início do experimento prepare apoptotic células Jurkat conforme descrito na seção 4.
  3. Imediatamente antes do experimento, conte células apoptóticas usando um hemocytometer. Transferir um número suficiente de células apoptóticas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL – geralmente acrescentamos 5 x 105 células/poço, proporcionando uma relação de alvo: efferocyte de 10:1.
  4. Células Jurkat de pelotas por centrifugação a 500 x g durante 5 min e Resuspenda em 500 µ l de PBS.
  5. Durante a centrifugação, alíquota 10 µ l de DMSO em um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Dissolva-se o DMSO uma quantidade mínima de N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-biotina). 5-10 cristais (~0.005 mg) é suficiente.
  6. Transferi a suspensão de célula/PBS apoptotic μL 500 para o DMSO/NHS-biotina contendo tubo. Em seguida Dilua uma célula tintura de rastreamento a concentração recomendada pelo fabricante para a suspensão de células apoptóticas. Certifique-se selecionar uma célula de rastreamento tintura que não se sobreponha espectralmente com FITC-Streptavidin (por exemplo, vermelho ou far-red celular rastreamento tintura).
  7. Incube a suspensão por 20 min em temperatura ambiente no escuro. Adicionar um volume igual de RPMI 1640 + 10% FBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente no escuro para saciar qualquer corante não tenha reagido.
  8. Células de pelotas por centrifugação a 500 x g durante 5 min, descartar o sobrenadante e ressuspender as células apoptóticas manchada em 100 µ l de RPMI 1640 + 10% FBS por alvéolo de macrófagos.
  9. Adicione 100 µ l de suspensão de células apoptóticas manchada gota a gota a cada poço de macrófagos. Centrifugue 200 x g por 1 min em uma centrífuga, equipada com um adaptador de placa para forçar o contato entre os macrófagos e células apoptóticas.
  10. Incube a placa para o período desejado de tempo em 37 ° C + 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos. Para macrófagos, efferocytosed material é geralmente primeiro detectáveis após 20-30 min e é concluída após 120 – 180 min.
  11. No momento desejado ponto (s) remove células de incubadora. Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS para parar efferocytosis e remova as pilhas apoptotic de non-efferocytosed temperatura ambiente.
  12. Adicionar estreptavidina conjugada com FITC numa diluição de 1:1,000 a cada poço e incube por 20 min no escuro. Isto rotulará a biotina exposta em qualquer material de células apoptóticas não-efferocytosed.
    Nota: Se desejar, do núcleo de células pode ser manchado durante esta etapa pela adição de diluição de 1: 20.000 de Hoechst 33342 ou 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI).
  13. Lave as células 3 vezes com 1 mL de PBS, agitando-o suavemente ou balançando as amostras por 5 min por enxágue. Fixe as células com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS por 20 min em temperatura ambiente. Enxague as células uma vez com PBS para remover o excesso PFA.
  14. Lamelas de montagem em um slide de imagens e transferência de um microscópio de fluorescência. Capturar o z-pilhas de um número suficiente de células para quantificação exacta — normalmente de 10 a 30 células por condição. Material de células apoptóticas non-internalizada será aparente na imagem resultante como tintura rotulada material envelopado por FITC-streptavidin coloração, enquanto que o material efferocytosed forma discreta celular rastreamento tintura partitura grátis de qualquer streptavidin de rastreamento de celular a coloração.
  15. Quantificar efferocytosis em imagens resultantes através de uma variedade de medidas:
    1. Calcule o índice de efferocytic, determinando o número médio de efferosomes discreta (celular rastreamento tintura+/streptavidin– partitura) por macrófagos. Quantificar apenas macrófagos vinculado a uma célula apoptótica ou contendo visível efferosomes ≥ 1. Os macrófagos registros vinculado a uma célula apoptótica, mas falta efferosomes discreta, como tendo um índice de efferocytic de 0.
    2. Calcule a eficiência efferocytic medindo-se a fração de macrófagos que contêm efferosome ≥ 1.
    3. Calcule a taxa de efferocytosis pelas células de imagem fixa e manchado em vários pontos de tempo. Macrófagos de imagem única vinculada para pilhas apoptotic ou contendo efferosomes visível, com z-pilhas capturados de cada célula. Depois de fotografada, determine a taxa de efferocytosis:
      1. Usando o streptavidin coloração como um guia e a ferramenta de seleção à mão livre ou polígono em FIJI/ImageJ26 (ou outro pacote de software de análise de imagem), círculo todos da célula de rastreamento tintura+/streptavidin– (por exemplo, internalizada) material em um avião da z-pilha. Medir a intensidade integrada da célula tintura de rastreamento nesta região. Medidas individuais para cada efferosome (por exemplo, diâmetro, posicionamento em relação a borda da célula ou núcleo, etc.)15,27 podem facilmente ser adquiridas simultaneamente com as medições, grandemente aumentar os dados coletados durante a análise.
      2. Na mesma z-seção, usando o streptavidin coloração como um guia e a ferramenta de seleção à mão livre ou polígono, círculo todos da célula de rastreamento /streptavidin corante++ (por exemplo, não-internalizada) material em um avião da z-pilha . Inclua apenas coloração de células apoptóticas em contacto com os fagócitos. Medir a intensidade integrada desta região.
      3. Repita as etapas para 4.2.3.1 4.2.3.2 para as z-seções restantes da imagem. Resumir a intensidade integrada do efferocytosed (ΣFEP) e materiais não-efferocytosed (Σne). A fração da célula apoptótica que tem sido efferocytosed pode ser calculada para a célula como:
        figure-protocol-1
      4. Quantificar a fração efferocytosed para todas as células em todos os pontos do tempo. Observe que a intensidade fluorescente de apoptotic células/efferosomes pode variar entre imagens devido a variações na captação de célula tracking corantes por pilhas apoptotic individuais e devido a mudanças nos parâmetros de aquisição de imagem tais como tempo de exposição. Como tal, só comparar normalizado valores como fração Efferocytosed, ou valores de intensidade independente como índice de efferocytic e efferocytic eficiência, entre imagens, entre as condições experimentais e entre repetir experimentos.
    4. Para garantir que o conjunto de dados resultante reflete com precisão a variação de efferocytosis entre as células, realizar estas análises sobre o número máximo de células possíveis em cada experimento.
      Nota: Índice de eficiência e efferocytic de Efferocytic pode ser rapidamente calculado (alguns segundos/célula), e normalmente pretendemos analisar pelo menos 100 células por experimento, repetindo cada experimento de pelo menos 3 vezes. Cálculo da fração de efferocytosed material e medidas específicas de efferosome são mais trabalhoso, tendo normalmente 2-3 min/cell por um analista experiente. Para esses cálculos, podemos quantificar um mínimo de 15 células por condição, por experiência.
    5. Índice de registro efferocytic, fração efferocytosed e efferosome individuais de dados em uma base por células.
      Nota: Isto permite análise de dados, usando abordagens de célula única, permitindo variações inter celulares ser quantificada. Análises de nível populacional podem ainda efectuar-se esses conjuntos de dados por uma média de célula única dados adquiridos em experiências individuais. Medições específicas do Efferosome podem ser analisadas a nível de população, nível de célula única e como conjuntos (por exemplo, como as populações de efferosomes independente das células que contêm essas)15.

6. ensaio de Efferocytosis de pilha usando pilhas Apoptotic ao vivo

  1. Prepare-se macrófagos THP-1, J774.2 ou M2 conforme descrito nas etapas 1-3, respectivamente. Se necessário, as células devem ser transfected com transgenes ou outros genética constrói pelo menos 18 h antes de realizar quaisquer experiências.
  2. À noite, antes do início do experimento, prepare apoptotic células Jurkat conforme descrito nas seções 4 e 5 com as seguintes modificações:
    1. Diluir as células e induzir apoptose conforme 4.1 – 4.3 e coletar o número necessário de pilhas apoptotic conforme 5.3 – 5.4.
    2. Adicione uma célula controle de corante na concentração recomendada pelo fabricante para a suspensão de células apoptóticas. Incube a suspensão por 20 min em temperatura ambiente no escuro. Adicionar um volume igual de RPMI 1640 + 10% FBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente no escuro para saciar qualquer corante não tenha reagido. Não adicione NHS-biotina para estas experiências.
    3. Células de pelotas por centrifugação a 500 x g durante 5 min, descartar o sobrenadante e ressuspender células apoptóticas manchada em 100 µ l de RPMI 1640 + 10% FBS por alvéolo de macrófagos.
  3. Se necessário, rótulo os macrófagos remoção de meios de cultura de cada poço e adicionando 500 µ l de PBS contendo os fabricantes recomendado de diluição de uma célula de rastreamento tintura que não se sobreponha espectralmente com a célula de rastreamento corante adicionado para as células apoptóticas ou qualquer transgenes fluorescente expressado pelos macrófagos. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro e, em seguida, adicionar um volume igual de DMEM + 10% FBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente no escuro para saciar qualquer corante não tenha reagido.
  4. Transferi a lamela contendo macrófagos para uma câmara de Leiden. Adicionar 400 µ l de DMEM + 10% FBS, seguido por 100 µ l de suspensão de célula apoptótica rotulada. Misture suavemente pipetando mídia que 2-3 vezes.
  5. Transferir a câmara de Leiden para uma aquecida e CO2-câmara perfundido de um microscópio fluorescente de células vivas.
    Nota: Para configurações de microscópio que falta recursos de perfusão CO2 , use tecido meio de cultura tamponada com 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) ao invés de bicarbonato de sódio para manter o pH fisiológico, enquanto a cultura é exposta ao ar.
  6. Capture uma série de lapso de tempo que contém uma imagem de luz branca (contraste de fase ou DIC) e imagens de todas as etiquetas fluorescentes:
    1. Use uma lente de objetiva X 100 para experiências onde resolver detalhes é necessária (por exemplo, dinâmica de membrana do fagócito-apoptotic interações de células). Entretanto, medidas mais gerais (taxa de absorção de células apoptóticas, tempo de interação entre macrófagos e células apoptóticas, etc.) são melhor fotografada usando um 60 X ou objectivo de X 63.
    2. Se estiver disponível, use ponto-visita a vários campos de visualização de imagem durante uma aquisição única, aumentando assim o número de eventos de efferocytic, capturado em uma única experiência
    3. Porque efferocytes muitas vezes apoderar-se de pequenos fragmentos de células apoptóticas, ao invés de células intactas, é melhor capturar z-pilhas. Para minimizar a fototoxicidade, capturar z-seções separadas pela profundidade focal de seu objetivo de microscópios (normalmente 0,5 m a 1,0 µm), através da espessura da célula (normalmente de 8-10 µm para macrófagos, por exemplo, 8-20 fatias/célula). Isso garante que todas as incorporações e eventos de tráfico será visíveis pelo menos um plano z. Como alternativa, use grandes (1 – 5 µm de diâmetro) apoptose celular imita ou células apoptóticas que passam por fragmentação mínima durante efferocytosis (por exemplo, aquecer chocados neutrófilos) em vez sem z-empilhamento. Descrevemos a preparação de ambos imita e neutrófilos apoptotic anteriormente28.
    4. Para minimizar o fotobranqueamento, use fluorophores brilhante e capturar imagens usando as configurações de aquisição que minimizam o fotobranqueamento — por exemplo, excitação de baixa intensidade combinada com câmera de alto ganho e curta exposição vezes29. Recomendamos vivamente que usando um microscópio equipado com uma câmera de alta sensibilidade eletromagnética dispositivo de carga acoplada (CCD) EM- ou confocal-disco giratório e um estágio mecânico piezoelétrico de alta velocidade, para esta forma de geração de imagens.
  7. O número possível de métodos de análise que podem ser aplicados a esses vídeos de lapso de tempo é extensa e além de nossa capacidade de rever aqui. Como alguns exemplos, use manual ou automatizada de software de rastreamento para acompanhar a fusão, cisão e movimento de efferosomes dentro de células15, quantificar a dinâmica de fusão efferosome com endolysosomes por análise colocalization em macrófagos expressando compartimento específico fluorescente transgenes13, monitorar processos de absorção tais como sondagem e Copa formação30, determinar a dinâmica do recrutamento de sinalização e tráfico de proteínas para o efferosome13, e/ou quantificar a atividade degradativos de efferosomes usando pilhas apoptotic rotuladas com fluorophores sensíveis ao pH, oxidante sensíveis ou ativado protease31.

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Resultados

Uma noite de cultura de células Jurkat com resultados de staurosporine de 1 µM em apoptose de > 95% das células, que podem ser confirmadas com anexina V coloração (Figura 1). Outros tipos de células podem ser usados para estas experiências, embora a concentração de staurosporine e a duração do tratamento staurosporine precisará ser otimizado para cada linha de celular. Para detecção confiável e quantificação de efferocytosis, > 80% das células deve ser ...

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Discussão

Os métodos descritos neste protocolo permitem que a imagem e a quantificação do processo de efferocytic dinâmico, com abordagens tanto fixo-célula e célula viver. Essas abordagens oferecem diversas vantagens sobre os métodos baseados em citometria de fluxo comumente empregados23,24. O uso de coloração de dentro para fora com amostras fixas fornece uma quantificação mais robusta e precisa da taxa e a extensão da efferocytosis — de fato, muitos métodos baseados em ...

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Divulgações

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelos institutos canadenses de saúde (CIHR) de pesquisa operacional Grant MOP-123419, ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá Discovery Grant 418194 e um Ontario Ministério da investigação e inovação início Research Award para BH. DGW contribuiu com algumas das imagens apresentadas, para a otimização dos protocolos e a escrita do manuscrito; Ele foi financiado por um subsídio de escorva da bomba da Universidade de Liverpool. CY é financiado por uma bolsa de pós-graduação de Vanier e CIHR MD/PhD Studentship. Agências de fomento não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI 1640 MídiaWisent3500-000-EL
DMEM MídiaWisent319-005-CL
Soro Bovino Fetal (FBS)Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 mm lamínulas de vidro circular # 1,5 espessuraMicroscopia Eletrônica Ciências72290-08O tamanho e a forma da lamínula não são críticos, mas 18 mm se encaixam nos poços de uma placa padrão de 12 poços que simplifica a cultura de células
StaurosporineCayman Chemical81590Dissolva em DMSO a 1 mM (solução estoque 1.000x)
Anexina V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinaThermoFisher20217Armazene em um dessecador. Não prepare uma solução padrão.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Meio de separação de células linfólitas-poliCedarlane LabsCL5071
M-CSF humano recombinantePeprotech200-04
IL-4 humano recombinantePeprotech300-25
J774.2 Linha celular de macrófagosSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 Linha celular de monócitos humanosATCCTIB-202
Jurkat T Linha celularATCCTIB-152

Referências

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