Artigo de método

Quantificação de proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis conteúdo, usando o milho (Zea mays) como um Exemplar

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DOI:

10.3791/58164

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6 de agosto de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

Os protocolos descritos neste documento fornecem uma metodologia clara e acessível para medir proteína solúvel e conteúdo digeríveis (não estruturais) hidrato de carbono em tecidos vegetais. A capacidade de quantificar estes macronutrientes de duas plantas tem implicações significativas para fazer avançar os campos de Fisiologia vegetal, ecologia nutricional, interações planta-herbívoro e ecologia alimentar-web.

Resumo

Dados elementares são comumente usados para inferir a qualidade da planta como um recurso para herbívoros. No entanto, a omnipresença do carbono em biomoléculas, a presença de compostos contendo nitrogênio de plantas defensivas e variação na espécie-específicas correlações entre nitrogênio e planta proteica todos limitar a precisão dessas inferências. Além disso, pesquisa focada na planta e/ou fisiologia herbívoro exigem um nível de precisão que não é conseguido usando generalizada de correlações. Os métodos apresentados aqui oferecem pesquisadores um protocolo claro e rápido para medir diretamente proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis, os macronutrientes de duas plantas mais intimamente ligados ao desempenho fisiológico animal. Os protocolos combinam bem caracterizados ensaios colorimétricos com passos de digestão otimizada de plantas específicas para fornecer resultados precisos e reprodutíveis. Nossas análises de milho de diferente tecidos mostram que estes ensaios têm a sensibilidade para detectar a variação na planta proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível através de múltiplas escalas espaciais. Estas incluem diferenças entre plantas em crescimento de regiões e variedades ou espécies de plantas, bem como dentro-planta diferenças no tipo de tecido e até mesmo posicional dentro do mesmo tecido. Combinar proteínas solúveis e teor de carboidrato digerível com dados elementares também tem o potencial de proporcionar novas oportunidades em biologia vegetal para conectar a nutrição mineral de plantas com processos fisiológicos de planta. Essas análises também ajudam a gerar os dados de carboidrato digerível preciso estudar ecologia nutricional, interações planta-herbívoro e dinâmica de comida-web, que por sua vez irá melhorar a fisiologia e a pesquisa ecológica e proteína solúvel.

Introdução

Biomassa vegetal constitui a base de praticamente todos os alimentos terrestres-teias. Plantas adquirem elementos nutritivos do solo através de seus sistemas de raízes e utilizam a luz solar em seus tecidos foliares para sintetizar biomoléculas. Em particular, carbono e nitrogênio são usados para criar os carboidratos, proteínas (compostos de aminoácidos) e lipídios que são necessários para construir a biomassa de planta (Note-se que em plantas fisiologia "macronutrientes" o termo muitas vezes refere-se aos elementos do solo, tais como N, P, K e S, no entanto, ao longo deste trabalho este termo referiremos de biomoléculas, tais como proteínas, hidratos de carbono e lípidos). Quando herbívoros consomem material vegetal, os macronutrientes contidos nos tecidos da planta são discriminados em suas partes constituintes e usados para conduzir os processos fisiológicos do consumidor. Desta forma, macronutrientes de planta tem uma forte influência sobre a fisiologia do consumidor juntamente com implicações importantes para interações ecológicas de maior ordem e comida-web dinâmica.

Por todo o reino animal, a proteína solúvel e carboidratos digeríveis são os macronutrientes mais intimamente ligados à sobrevivência, reprodução e desempenho1. Além disso, a maioria dos animais regula ativamente sua ingestão destes dois macronutrientes para atender suas demandas fisiológicas1,2. Isto é particularmente verdadeiro para insetos herbívoros que detectar as concentrações de açúcares e aminoácidos em tecidos vegetais, que por sua vez direciona o comportamento alimentar. Como resultado, planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível tem desempenhado um papel forte na evolução das interações inseto-planta.

Enquanto dados na planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidratos digeríveis são relativamente raros (mas veja6,7,8,9,10,11), há uma preponderância de dados disponíveis sobre conteúdo elementar de planta (carbono, nitrogênio e fósforo). Em grande parte, isso ocorre porque elementos desempenham um papel primordial na nutrição mineral de plantas a3,4,5. Onde os elementos são medidos, correlações têm sido utilizadas para extrapolar a quantidade de proteína solúvel e carboidratos de fácil digestão, mas cálculos precisos são frequentemente difíceis de obter. Por exemplo, é impossível usar o carbono como um indicador do teor de carboidrato digerível planta porque carbono ubiquitously presente em todos os compostos orgânicos. Existe uma forte relação entre nitrogênio elemental e teor de proteínas solúveis de planta, e factores de conversão de nitrogênio-para-proteína generalizadas são frequentemente utilizados. No entanto, há fortes evidências de que as conversões de nitrogênio-para-proteína são altamente específicas12,13,14,15, fazendo o uso de conversão generalizada provável imprecisas. Devido a isso, fatores de conversão de nitrogênio para proteína muitas vezes falta precisão, particularmente para a medida em que é necessária para estudos nutricionais em herbívoros. Além disso, a presença de N-contendo planta aleloquímicos, tais como alcaloides e Glicosinolatos que muitas vezes são tóxicos para herbívoros, pode confundir estas conversões.

Aqui, oferecemos dois ensaios químicos para medir a concentração de proteínas solúveis e carboidratos digeríveis em tecidos vegetais. Estes ensaios são apresentados separadamente, mas sugere-se que eles ser usados simultaneamente para analisar as mesmas amostras da planta para realizar uma análise mais abrangente de macronutrientes da planta. Ambos utilizam metodologias semelhantes, consistindo de uma etapa de extração, seguida de quantificação através de absorvância. Preparação de amostra de planta também é idêntica para ambos os protocolos, tornando mais fácil para executar ambas as análises em tandem. O utilitário destes ensaios não derivam de sua novidade, como eles dependem mais velhos, (Bradford, Jones, Dubois) ensaios colorimétricos bem-estabelecida16,17,18, mas aqui nós organizaram uma clara e fácil de seguir protocolo que combina esses métodos com extração vegetal específico mais obscuras técnicas17,19 a fim de fazer a aplicação destes ensaios mais acessível para aqueles em domínios relevantes para a planta.

Para ambos os ensaios, a planta macronutrientes primeiro são extraídos fisicamente pelo congelamento, liofilização, o material de planta de moagem. Para o ensaio de proteína solúvel, mais extração química é feita de17,19 através de várias rodadas de utilização do Vortex e aquecimento de amostras em solução de NaOH. O bem conhecido ensaio de Bradford, utilizando G-250 azul brilhante de Coomassie, é usado para quantificar proteínas solúveis e polipeptídeos entre 3.000-5.000 Daltons16,17. Este ensaio tem um alcance de deteção entre 1-20 µ g de proteínas totais por microplaca bem ou < 25 µ g/mL, mas não faz não medida ácidos amino livres. A etapa de extração do ensaio do carboidrato digerível é baseada no método de ácido diluído de Smith et al 20 e permite o isolamento de açúcares solúveis, amido e fructosan – mas os carboidratos não estruturais. Um método de quantificação de ácido sulfúrico de fenol é tirado de Dubois et al . 18 e mede todos os mono-, oligo- e polissacarídeos (bem como derivados metil). Este ensaio é capaz de quantificar os açúcares específicos, mas aqui nós usá-lo como um indicador do teor de carboidrato digerível total (ver Smith et al. 20 para análise mais detalhada). Juntos, estes ensaios medem os dois macronutrientes que são fortemente amarrados para plantar desempenho ecofisiologia e herbívoro, fornecendo dados importantes sobre a qualidade de recurso na base de teias de alimento terrestres. Apresentar estes protocolos promove a geração de datasets de macronutrientes de planta, a fim de obter uma compreensão mais profunda de Fisiologia vegetal, ecologia nutricional herbívoro e interações planta-herbívoro.

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Protocolo

1. coleta e processamento de plantas

  1. Coletar e processar amostras de planta
    1. Depois de coletar amostras de plantas, congelam amostras mergulhando material vegetal em nitrogênio líquido com fórceps e loja a-80 ° C. Se as amostras de plantas coletadas são grandes demais para congelar, esfriar rapidamente as amostras usando gelo seco e a transferência para um freezer-80 ° C, logo que possível. O conteúdo de macronutrientes de material vegetal pode alterar depois tecidos são separados da planta, por isso é importante congelar amostras de planta logo que possível após a coleta.
      Atenção: Nitrogênio líquido pode causar graves queimaduras quando em contacto com a pele. Por favor, certifique-se de transporte de nitrogênio líquido em recipientes aprovados e usar EPI adequado durante sua manipulação, incluindo cryo-luvas, olho googles, protetor facial, avental e um jaleco.
    2. Lyophilize material de planta usando um Liofilizador para garantir que os tecidos são metabolicamente inativos, enquanto a água está sendo removida. Estabiliza a seco até que a massa da amostra para assegurar que toda a água foi removida.
    3. Uma vez que as amostras estão secas, Triture em um pó fino usando um moedor ou moinho. Armazenar as amostras em um armário de dessecantes até análise.

2. ensaio da proteína solúvel

  1. Preparação da amostra
    1. Amostras de cada tecido, cerca de 20 mg cada, pesar em rótulo tubos e tubos de poliestireno microcentrifuga de 1,5 mL. Estas amostras serão posteriormente referidas como amostras desconhecidas. Grave a massa exata de cada amostra, como essa informação será necessário para calcular a % de proteína solúvel em cada amostra desconhecida. Use microcentrifuga tubos com tampas de bloqueio, como tampas sem bloqueio podem abrir durante a etapa de aquecimento subsequente, resultando em perda da solução de amostra.
  2. Solubilizar e isolar proteínas da amostra desconhecida
    1. Usando uma micropipeta, adicione 500 µ l de 0.1 M NaOH para cada tubo. Feche as tampas firmemente e proceda à sonicação durante 30 minutos. Pré-aqueça a água quente do banho 90 ° C.
      Atenção: Hidróxido de sódio é uma base forte e pode causar queimaduras quando em contacto com a pele. Apesar de 0.1 M NaOH representa uma baixa concentração, use luvas protetoras para evitar irritação da pele.
    2. Colocar os tubos em um rack no banho de água quente durante 15 minutos.
    3. Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Pipete o sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga rotulado, usando uma ponta de pipeta nova para cada amostra. Adicione 300 µ l de 0.1 M NaOH ao tubo contendo o pellet e centrifugar novamente a 15.000 x g durante 10 minutos. Mais uma vez, recolher o líquido sobrenadante e combiná-lo com o sobrenadante da mesma amostra. Este é um potencial ponto de parar, e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite se necessário.
  3. Precipitar proteínas vegetais
    1. Neutralize o pH da solução sobrenadante adicionando 11 µ l de 5.8 M HCl. confirmar um pH de 7 ~ por mergulhando cada solução de amostra de papel de tornassol.
      Atenção: Ácido clorídrico é um ácido forte e corrosivo que pode causar queimaduras quando em contacto com a pele (aplicação de pele ou por inalação). Por favor, use luvas para evitar irritações na pele durante a manipulação de HCl.
    2. Adicione 90 µ l de 100% o ácido tricloroacético (TCA) a cada tubo e incubar os tubos em gelo por 30 minutos. A precipitação de proteínas vai virar a solução da claro opaco. Se isso não ocorrer após 30 minutos, refrigere os tubos por 1 hora. Este é um potencial ponto de parar, e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite se necessário.
      Atenção: Ácido tricloroacético é corrosivo. Por favor use luvas quando manusear para evitar o contacto com a pele e evitar a inalação.
    3. Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remova cuidadosamente o TCA sobrenadante por aspiração-lo usando uma linha de vácuo ligada a uma ponta de micropipeta de vidro fino (a mesma dica pode ser usada em amostras). Não perturbe a pelota de proteína, evitando a sucção pesada e mantendo uma distância adequada entre a ponta da pipeta e o pellet.
    4. Lave o pellet rapidamente com 100 µ l de acetona de-20 ° C. Nesta etapa remove qualquer restante TCA a pelota, o que pode interferir com o ensaio de Bradford subsequente; no entanto, a acetona vai começar a dissolver o sedimento de proteína se deixado em contato muito tempo, então a acetona deve ser adicionada depois rapidamente extraído a pelota dentro de 5 segundos.
    5. Permitir que a acetona evaporar colocando tubos em uma coifa ou frigorífico. Em seguida, dissolva a pelota de proteína, adicionando 1 mL de 0.1 M NaOH para cada tubo. Dissolver totalmente a pelota pode exigir várias rodadas de aquecimento em água quente banho, num Vortex e sonicating.
      Nota: Quanto mais tempo os tubos de sentar-se na coifa ou frigorífico e o secador as pelotas obter, o mais difícil será re-solubilizar. Sugere-se secar o sedimento durante 30 minutos, e então verificar a presença de acetona cada 10-15 minutos até que esteja claro que a acetona evaporou-se (sem acetona fumos são detectáveis).
  4. Mistura de soluções-padrão, amostra desconhecida soluções diluídas e quantificar o conteúdo de proteína total das amostras desconhecidas usando o ensaio de Bradford.
    1. Imunoglobulina bovina se prepare soluções-padrão G (IgG) de acordo com as concentrações listadas na tabela 1 (liofilizado ou solução-mãe de IgG pode ser misturado com água desionizada para alcançar cada concentração). Normas de armazenamento a 4 ° C. Em uma placa de 96 poços, adicione 160 µ l de cada solução-padrão de IgG em triplicado, começando na posição A1 da placa bem (0 µ g / µ l em A1, A2, A3 posição, 0,0125 µ g / µ l em B1, B2, B3 posições, etc.).
    2. Prepare uma solução de NaOH diluída pela adição de 50 µ l de 0.1 M NaOH a 950 µ l de água destilada. Como um controle negativo em branco, adicione 60 µ l desta solução na placa bem em triplicado (G1, G2, G3 posições).
    3. Prepare diluições de amostras desconhecidas pela adição de 50 µ l de cada solução de amostra a 950 µ l de água destilada em um tubo de microcentrifugadora novo 1,5 mL. Em seguida, adicione 60 µ l de cada amostra diluída a placa bem em triplicado, começando na posição de H1. Uma placa de 96 poços deverá permitir a análise dos 6 padrões, 1 e 25 amostras desconhecidas quando lido em triplicado. Cada placa bem analisada deve conter suas próprias amostras de IgG padrão e em branco.
    4. Adicione 100 µ l de água destilada a todos os poços de amostras em branco e desconhecido. Agora cada um bem deve conter um total de 160 µ l. com uma pipeta multicanal (8 canais), adicionar 40 µ l da proteína de G-250 azul brilhante de Coomassie tingir a cada bem na primeira coluna da placa bem. Misture o corante com as amostras por mergulhar várias vezes. Repita para todas as outras colunas, substituindo pontas de pipetas para evitar contaminação.
      Atenção: G-250 azul brilhante de Coomassie é um irritante e contacto com a pele, olhos, ou os pulmões devem ser evitados. Por favor, use luvas para evitar o contacto com a pele. Se ocorrer contato com a pele, este produto vai manchar.
    5. Use uma agulha para pop as bolhas presentes nos poços, como eles podem interferir com a leitura de Espectrofotômetro de microplacas. Limpe a agulha para evitar contaminações entre poços. Deixe o microplate incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
    6. Usando um Espectrofotômetro de microplacas, gravar os valores de absorvância para cada poço em 595 nm.
    7. Gravar a absorvância média para os três poços em branco e subtrair este valor de cada uma das leituras a amostra padrão e desconhecido. Em seguida, grave a absorvância média para cada amostra padrão e desconhecida.
      Nota: Para calcular a quantidade de proteína presente em cada amostra desconhecida usando a curva-padrão, é mais fácil regredir a absorvância média de cada norma contra as microgramas de proteína presente em cada norma, mas um pode traçar a concentração de proteína (µ µ g/l) de cada norma se desejável. Os seguintes cálculos, no entanto, se referir a uma curva-padrão com base em microgramas, não as concentrações (µ g / µ l).
    8. Traça a absorvância média de cada norma contra a quantidade total de proteínas presentes em cada norma bem (tabela 1). Coloque uma linha de regressão linear para estes dados e usar a equação para calcular a quantidade de proteína (µ g) em cada amostra desconhecida bem baseada a absorvância média (Figura 1a).
      Nota: O coeficiente de correlação (r -valor) desta linha deve ser superior a 0,98 e rotineiramente perto de 0,99. O regressão padrão serão específico para cada prato, daí os poços da amostra desconhecida em cada placa devem ser analisados separadamente.
    9. Uma vez que a quantidade média de proteína é calculada para cada poço de amostra desconhecida, use a seguinte equação para calcular a quantidade total de proteína (µ g) em cada amostra original:
      Mp = (((W.p60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp = µ g de proteína na amostra original
      Wp = µ g de proteína na amostra desconhecida bem
      1. Em seguida, use a seguinte equação para determinar a porcentagem de proteína em cada amostra:
        Pp = ((Mp/1000) / mi) * 100
        Pp = % de proteína na amostra
        Meu = massa inicial da amostra (mg)
        Nota: Em alguns casos, a amostra pode ultrapassar o limite superior de absorvância. Em caso afirmativo, soluções de amostra podem requerer novas diluição no passo 2.4.3.
        Diluições adicionais devem então ser contabilizadas nos cálculos subsequentes. Algumas marcas de leitor de microplacas também fornecem o software de computador que irá automaticamente calcular a concentração de proteína média de cada amostra desconhecida, com base nos dados da curva padrão.

3. digestão de carboidratos ensaio

  1. Preparação da amostra
    1. Pesar amostras de cada tecido, cerca de 20 mg cada, em vidro, tubos de 15 mL com tampas de rosca de borracha revestidas (100 mm de comprimento). Estas amostra será posteriormente referido como amostras desconhecidas. Rotule os tubos com um marcador à prova d'água ou fluidos com fita nas tampas e gravar a massa exata de cada amostra, como essa informação será necessário para calcular a % de carboidratos em cada amostra desconhecida.
  2. Extrato de carboidratos digeríveis de cada amostra desconhecida.
    1. Adicione 1 mL de 0.1 M H2para que4 a cada tubo e tampas de rosca para tubos firmemente. Coloque em um banho de água a ferver durante 1 hora.
      Atenção: O ácido sulfúrico é muito corrosivo. Por favor, use luvas, googles de olho e um avental ao manusear H2então4 e execute esta etapa em uma coifa.
    2. Refresque-se os tubos em banho de água morna. Despeje o conteúdo do tubo rotulado 1,5 mL microcentrifuge tubos (não se preocupe se alguns restos de material da planta em tubos de vidro).
    3. Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Remova o sobrenadante com uma pipeta de micro e lugar para novos tubos de microcentrifuga rotulado 1,5 mL. Os tubos podem ser refrigerados durante a noite neste ponto. Se continuar com o ensaio, consulte a etapa 3.3.2.
  3. Mistura de soluções-padrão e quantificar o conteúdo de carboidrato digerível total de amostras desconhecidas.
    1. Prepare a Difco glicose soluções padrão com concentrações listadas na tabela 2. Prepare-se seis tubos de ensaio de vidro com 400 µ l de cada solução-padrão.
    2. Pipetar 15 µ l de cada amostra desconhecida para seu próprio tubo de ensaio e adicionar 385 µ l de água destilada a cada um para um volume total de 400 µ l em cada tubo de ensaio. Em uma coifa, adicionar 400 µ l de fenol 5% para cada tubo de ensaio de amostra padrão e desconhecido, e então rapidamente Pipetar 2 mL de concentrado de H2SO4 para cada tubo. Não toque o conteúdo do tubo de ensaio com a ponta da pipeta, basta adicionar à superfície de solução (uma pipeta repetidora funciona melhor para isso).
    3. Deixe os tubos incubar durante 10 minutos e depois cuidadosamente vórtice do tubo para misturar o conteúdo. Incube por um período adicional de 30 minutos.
      Atenção: Fenol e ácido sulfúrico são irritantes corrosivos. Para proteger contra exposição à pele, olhos e inalação, esta etapa deve ser executada em uma coifa química usando o EPI adequado, que inclui: enfrentar o escudo ou olho óculos de proteção, luvas de borracha, avental de laboratório e botas. Mistura de fenol com ácido sulfúrico também resulta em uma reação exotérmica, que resultará em tubos de tornar-se quente.
    4. Pipete 800 µ l da amostra de cada tubo para cada um dos 3 cubetas semi micro de poliestireno 1,5 mL (3 técnicas Replica por amostra). Definir o espectrofotômetro para ler em 490 nm. Calibre a uma célula em branco contendo água destilada antes de ler as normas ou amostras desconhecidas e intermitentemente durante as leituras de amostra. Executar cada cubeta através de um espectrofotômetro e gravar a absorvância. Média do outro lado técnico repetições para cada amostra desconhecida.
      Nota: Em alguns casos, as amostras podem superar o limite superior de absorvância. Se assim for, as amostras devem ser diluídas em etapa 3.2.3. Diluições também devem ser contabilizadas nos cálculos subsequentes.
    5. Calcule a absorbância média para cada norma.
      Nota: Para calcular a quantidade de carboidratos digestíveis totais presentes em cada amostra desconhecida usando a curva-padrão, é mais fácil regredir a absorvância média de cada norma contra as microgramas de glicose D (+) presente em cada padrão, mas pode-se também traça a concentração de glicose D (+) (µ g / µ l) de cada padrão se desejável. Os seguintes cálculos, no entanto, se referir a uma curva-padrão com base em microgramas, não as concentrações (µ g / µ l).
    6. Calcule a curva de calibração plotando a absorvância média contra a quantidade total de glicose D (+) (µ g) em cada solução-padrão. Caber uma linha de regressão linear para estes dados e em seguida, use a seguinte equação para calcular a quantidade total de carboidratos (µ g) em cada amostra desconhecida:
      Mc = (((umx -b)/m)/(15)) * 1000
      Mc = µ g de hidratos de carbono na amostra
      Umx = absorvância média da amostra desconhecida
      b = intercepção de y (linha de regressão padrão)
      m = inclinação (linha de regressão padrão)
      O coeficiente de correlação desta linha deve ser superior a 0,98 e rotineiramente perto de 0,99. Em seguida, use a seguinte equação para determinar a porcentagem de carboidratos em cada amostra:
      Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100
      Pc = % de carboidratos
      Meu = massa inicial da amostra (mg)

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Resultados

Para mostrar a utilidade desses métodos, foram analisados a proteína solúvel e o conteúdo de carboidrato digerível de quatro diferente campo e milho doce tecidos que servem como distintos potenciais recursos nutricionais para insetos herbívoros. Coletamos espigas de milho de três regiões agrícolas dos Estados Unidos (Minnesota, Carolina do Norte e Texas), englobando cinco variedades diferentes de milho doce (ou seja, genótipos) e uma variedade de milho de campo como um externo. <...

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Discussão

Combinando ensaios colorimétricos bem estabelecidos com protocolos de extração de planta específica eficaz, os ensaios demonstrados aqui fornecem um método razoável e preciso para medição de planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível. Nossos resultados usando o milho como um exemplo ilustra como estes protocolos podem ser usados para obter medições precisas em diferentes escalas espaciais biologicamente relevantes. Por exemplo, fomos capazes de detectar diferenças na planta de proteína solúvel e conte...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Graças a todos os nossos colaboradores que têm assistido com coleções de campo de milho doce, incluindo Dominic Reisig e Dan Mott na North Carolina State University e Pat Porter na Texas A & M University em Lubbock, TX. Agradecimentos a Fiona Clissold para ajudar a otimizar os protocolos e para fornecer as edições para este manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo Texas A & M C. Everette Salyer Fellowship (departamento de entomologia) e a biotecnologia risco Grant programa avaliação competitiva concedem n º 2015-33522-24099 do departamento E.U. da agricultura (concedido a gás e STB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
leitor de microplacas (espectrofotômetro)Bio-RadModelo 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Concentrado de reagente de coranteBio-Rad5000006450mL
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Referências

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