Artigo de método

O protocolo de estresse suave crônico imprevisível para induzir Anhedonia em ratos

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DOI:

10.3791/58184

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24 de outubro de 2018

 , 
1School of Behavioral Science, The Academic College Tel-Aviv-Yaffo, 2Department of Education and Psychology, Open University

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos o protocolo imprevisíveis stress leve crônica em ratos. Este protocolo induz um fenótipo de depressivo, como a longo prazo e permite avaliar a eficácia dos antidepressivos putativos em reverter os défices de depressiva como comportamentais e neuromolecular.

Resumo

Depressão é uma doença altamente prevalente e debilitante, apenas parcialmente dirigida pelo atuais farmacoterapias. A falta de resposta ao tratamento por muitos pacientes solicita a necessidade de desenvolver novas alternativas terapêuticas e para melhor compreender a etiologia da doença. Modelos pré-clínicos com translação méritos são rudimentares para esta tarefa. Aqui nós apresentamos um protocolo para o método de estresse suave crônico imprevisível (UCMS) em camundongos. Neste protocolo, ratos adolescentes estão cronicamente expostos a intercambiando imprevisíveis estressores suaves. Assemelhando-se a patogênese da depressão nos seres humanos, exposição de estresse durante o período sensível da adolescência ratos instiga um fenótipo depressiva, como evidente na idade adulta. UCMS pode ser usado para as sessões dos antidepressivos na variedade de comportamentos como depressiva e índices de neuromolecular. Entre os mais proeminentes testes para avaliar o comportamento depressivo nos roedores é o teste de preferência de sacarose (SPT), que reflecte a anedonia (sintoma de núcleo da depressão). O SPT será também apresentado no presente protocolo. A capacidade de UCMS para induzir anedonia, instigar os défices comportamentais a longo prazo e permitir a reversão destes défices através de tratamento crônico (mas não agudo) com antidepressivos reforça a validade do protocolo, em comparação com outros protocolos de animal para indução de comportamentos depressivos, como.

Introdução

Transtorno depressivo maior (MDD) é uma condição debilitante, que tem sido indicada como a 11th causa da carga global de doença1, com uma prevalência de vida de 11 a 16%2,3. MDD tem sido associada com deficiências graves dos pacientes funcionamento social e ocupacional, diminuição de qualidade de vida, inúmeros transtornos mentais e físicos e risco aumentado para mortalidade4,5,6 , 7. existem diversas farmacoterapias eficazes e intervenções psicológicas para MDD; no entanto, mais do que o terço dos pacientes não alcançar remissão com o existente opções terapêuticas8,9,10,11. Portanto, é melhor mapeamento da fisiopatologia da MDD e desenvolvimento de novos medicamentos são ainda de maior importância. Para atender estas necessidades de modelos animais de tarefas cientificamente validadas para ser utilizado.

Estresse leve crônico imprevisível (UCMS) é um paradigma de roedor renomado usado para induzir comportamentos depressivos e ansiedade-como12,13,14,de15. O principal objectivo do UCMS é gerar déficits comportamentais (tais como anedonia e desespero comportamental12,15) em camundongos e ratos e promover sessões para potenciais terapêuticos agentes farmacológicos. O procedimento foi introduzido pela primeira vez por Katz16 e posteriormente desenvolvido por Willner participam17,18, produzindo resultados comportamentais e neurobiológicos vastos, relembrando a sintomatologia depressiva12. Foi inicialmente concebido para ratos e mais tarde acomodado para ratos13,19. No procedimento, adolescentes animais estão cronicamente expostos a diferentes estressores suaves imprevisíveis. Posteriormente, agentes farmacológicos são administrados. Índices comportamentais e biológicos são obtidos após o término do tratamento. Um dos mais proeminentes testes realizados seguindo UCMS é o teste de preferência de sacarose (SPT). O SPT é baseado em preferência inata dos roedores para a solução adoçada ao invés de água e é amplamente reconhecida como um modelo de translação essencial para avaliar anedonia12,18,20, 21 (que é um sintoma de núcleo em depressão humana22,.23).

Ao inserir a quarta década desde a sua introdução, UCMS foi aplicada em camundongos e ratos em estudos inumeráveis. A maioria destes estudos empregado UCMS como um método para induzir comportamentos depressivos, como12,13,21,24. Estudos também têm utilizado o modelo para gerar anxiogenic efeitos25,26,,27,28,29. Preferências de sacarose e sacarina são os principais exames utilizados para avaliar a anedonia UCMS12,18,30,31,32,33a seguir. Outras medidas de resultados notáveis que são altamente integradas de literatura UCMS são: a suspensão da cauda (TST)28,34,35de teste, teste de natação forçada (FST)28,34 , 36 , 37 (ambos medição stress enfrentamento/comportamental desespero), o teste de campo aberto (OFT; medindo o comportamento exploratório, comportamento de ansiedade e atividade locomotora)25,28,38, a elevada Além de labirinto (EPM; comportamento de ansiedade medição)25,39,40 e testes adicionais de medição comportamentos depressivos, como, comportamentos como ansiedade, funcionamento cognitivo e comportamento social12 . Administração crônica dos antidepressivos tricíclicos (TCAs; imipramina35,41,42,43, desipramina18,44,45 ), antidepressivos tetracíclicos (TeCAs; maprotilina46,47, Mianserina,48), inibidores seletivos da recaptação da serotonina (SSRIs; fluoxetine46,47,49 , escitalopram30,50,51,de paroxetina52), melatonina43,49, agomelatine53, o inibidor de hidrolase (FAAH) de amida de ácido graxo URB59754 e vários compostos naturais30,37,50,55,56,57,58 foram demonstrado para reverter os induzida por UCMS depressivo e ansiedade-como sintomas. Em geral, estes efeitos terapêuticos não foram obtidos através de tratamentos aguda12 (por exemplo, paroxetine51,52, imipramina53,54,59 ,,60, fluoxetine53, agomelatine53, URB59754, Brofaromina60).

Exposição de stress durante a infância e adolescência é um importante factor de risco para a formação anterior de MDD (entre vários outros transtornos psiquiátricos) na idade adulta61,,62,63. Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) é um sistema neuroendócrino importante regulando a bio-comportamental resposta ao estresse de64. Stress a longo prazo durante os períodos sensíveis de desenvolvimento neurológico da infância e adolescência prejudica o equilíbrio do eixo HPA. Isso pode provocar um estado de maior ativação simpática, reatividade desequilibrada e hipercortisolemia duradoura através do estado de repouso; tornando assim, os indivíduos vulneráveis à depressão ou ansiedade relacionados a psicopatologias65,,66,67,68. UCMS traduz adequadamente esta patogenia: estresse aplicação durante os ratos ' adolescência induz uma susceptibilidade de depressivo, como a longo prazo. Além disso, os défices comportamentais induzidos por UCMS, é constituída por alterações significativas em HPA eixo funcional (por exemplo, causando uma redução no fator neurotrófico derivado do cérebro hipocampo [BDNF; uma proteína altamente envolvidos no equilíbrio do HPA eixo69,70]30, ou alterando a regulação da secreção de corticosterona para o sangue71,72), em semelhança com a fisiopatologia em seres humanos12, 50,73.

UCMS tem várias características tocam como um modelo para a depressão: por exemplo, (i) o levantamento de anedonia (que é considerado um endophenotype de MDD23,74); (ii) UCMS permite avaliar a grande variedade de comportamentos depressivos, como como desespero comportamental, comportamento social reduzido, deterioração no estado de pele e mais34; e (iii) Crônicas (2-4 semanas), mas não aguda, administração de antidepressivos seguinte exposição de estresse poderia produzir um efeito terapêutico prolongado paralelo ao efeito Obtido em pacientes humanos pelos mesmos agentes30,75 ,76,,77.

Estas características reforçam a validade das UCMS em comparação com outros modelos animais de depressão. O FST78 e o TST79 são dois modelos que são usados para induzir ou para avaliar o comportamento depressivo. Como modelos para induzir comportamentos depressivos, como eles têm claras deficiências em relação ao UCMS; Não solicitar alterações comportamentais a longo prazo e podem meramente refletem um ajustamento de estresse agudo em vez de produzir um durável depressiva, como manifestação de76.

Um modelo alternativo de animal da depressão é o modelo de derrota social. Ao contrário do FST e o TST este modelo (como UCMS) exigem a aplicação de estresse crônico (id est [ou seja], a recorrente sujeição do animal ao contrário social encontros com contrapartes dominantes)76,,77 , 80 , 81 , 82. a principal vantagem do modelo social derrota é que emprega estímulos sociais como estressores, refletindo o papel do estresse psicossocial na patogênese da depressão humana. Semelhante ao UCMS, o modelo social derrota provoca alterações neuroendócrinas e comportamentos de depressivo, como a longo prazo. Novo paralelo UCMS, os défices sociais induzida a derrota podem ser revertidos através da crônica, mas não aguda, a administração de antidepressivos. Em geral, há um grande apoio para a utilização de ambos UCMS e derrota social como aparelhos pre-clínicos para investigar a fisiopatologia da depressão76,77,81,82 . No entanto, um grande défice de modelo a derrota social é que ele só poderia ser aplicado em roedores do sexo masculinos, como as fêmeas não apresentam comportamento agressivo suficiente para os outros83. Por outro lado, estima, UCMS foi mostrado para produzir vários efeitos depressivos em ambos os ratos masculinos e femininos34.

Estresse leve crônico previsível (PCMS) é outro modelo de roedor que impõe um regime de exposição recorrente diária a retenção tensão28,84,85,86,87. Vários estudos têm mostrado que o PCMS maior ansiedade-como comportamentos28,87; embora, há contraditório relatórios capacidade PCMS vis-à-vis para induzir comportamentos de depressivo, como a longo prazo. Ao contrário de UCMS, PCMS produziu resultados menos satisfatórios, referindo-se a sua capacidade de induzir um estado pertubado28,84,86. Isto é consistente com a fenomenologia humana, em que imprevisível estressores são mais prejudiciais do que previsíveis os88.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso do acadêmico faculdade Tel-Aviv-Yaffo e institucional Cuidado Animal.

1. os animais

  1. Uso pré-adolescente (ou seja, 3 semanas de idade) Instituto de câncer Research (ICR) consanguíneo ratos masculinos.
  2. Randomize ratos para dois grupos de igual tamanho stress (UCMS vs ingênuo). Use 15 ratos por grupo de tratamento (por exemplo: se existem 3 farmacológico tratamento grupos usam 90 ratos gerais; 2 × [UCMS vs ingênuo] 3 [tratamentos] × 15 [ratos] = 90)
  3. Ratos de casa, de acordo com o grupo de stress; ou seja, casa ingênuo ratos com ingênuo só ratos e ratos de grupo UCMS casa com ratos do grupo UCMS apenas.
  4. Animais em gaiolas casa padrão (30 × 15 × 14 cm; 5 ratos por gaiola; cada gaiola contendo ratos de todos os grupos de tratamento [isto é, grupos de tratamento farmacológico]; manter ratos na mesma jaula durante todo o experimento, exceto quando indicado de outra forma) .
  5. Encher a casa gaiolas com serragem fresca (substituída duas vezes por semana) e adicionar um pedaço de algodão para enriquecimento.
  6. Animais de casa na gaiola em casa por um período de aclimatação de uma semana. Permitir o acesso ad libitum para roedor chow e água (exceto durante aplicações de estressor UCMS).
  7. Manter um ciclo de luz/escuridão consistente 12h (exceto quando indicado de outra forma). Durante os procedimentos UCMS manter ratos ingênuos em sua gaiola em casa.

2. UCMS

  1. Designe uma sala separada no laboratório, para o uso exclusivo do protocolo UCMS.
  2. Desenha um regime estressor de 4 semanas em que cada um dos sete estressores (i.e., gaiola molhada, serragem umedecida, inclinado a gaiola, gaiola vazia, estresse social, ratos contenção e interrupção do ciclo claro/escuro) é utilizado uma vez por semana, em um dia diferente a cada semana (para um projeto possível ver suplementar tabela 1).
  3. Após 1 semana de aclimatação (ver 1.6) iniciar a aplicação de estressores (certifique-se de que os ratos são cerca de 4 semanas de idade).
  4. Todos os dias, antes da aplicação do estressor, transferi as gaiolas do grupo UCMS da sala de habitação para o quarto UCMS.
  5. Durante aplicações de estressor, bloquear o acesso para o chow roedor e água para o grupo UCMS (exceto durante a reversão de claro/escuro ciclo).
    Nota: Isto pode ser obtido pela substituição da original gaiola tampa (que contém água e comida), uma tampa de gaiola vazia.
  6. Aplicar as estressores seguintes de acordo com o regime concebido anteriormente (ver 2.2):
    1. Gaiola molhada
      1. Coloque os ratos juntamente com suas contrapartes de gaiola em casa em uma gaiola vazia (ou seja, gaiola sem serragem).
      2. Encha a gaiola vazia com água mantida a 24 ± 1 ° C a uma profundidade de 1 cm (despeje com cuidado para evitar derramamento de água direto em ratos). Manter os ratos na gaiola molhada para 4 h.
      3. Transferi cada rato para um transeunte individual separado secagem gaiola com uma lâmpada de calor acima, uma almofada de aquecimento sob ele e fundamento de toalha de papel. Coloque um termómetro na gaiola transitória para verificar que a temperatura não ultrapasse os 37 ° C.
      4. Mantenha cada rato na gaiola transitória até que esteja seco e parece revigorado (aproximadamente 10-15 min). Ratos de retorno para casa gaiola com contrapartes mesmos.
    2. Serragem umedecida
      1. Despeje água mantida a 24 ± 1 ° C para a gaiola em casa até que a serragem é moderadamente úmida (despeje com cuidado para evitar derramamento de água direto em ratos).
        Nota: Não é necessário usar serragem fresca antes de derramar a água.
      2. Após 4 h, seca ratos em gaiolas transitórias, conforme descrito em 2.6.1.3. Coloque ratos com homólogos de gaiola em casa em uma gaiola estéril com serragem fresca.
    3. Gaiola inclinada
      1. Incline gaiolas a 45°, contra a parede para 4 h.
        Nota: Durante este período, os ratos estressor permanecem em sua gaiola em casa com os seus homólogos.
    4. Gaiola vazia
      1. Transferência de ratos, juntamente com suas contrapartes de gaiola casa específica, da gaiola em casa para uma gaiola vazia para 4 h.
    5. Estresse social
      1. Transferência de ratos, juntamente com suas contrapartes de gaiola casa específica, da gaiola em casa para uma gaiola que foi abrigada por um grupo diferente de ratos durante um período de pelo menos 3 d antes da aplicação do fator de estresse. Manter os ratos na gaiola desconhecida para 4 h.
        Nota: Para evitar a incerteza colocar um adesivo em cada gaiola para indicar a gaiola de origem de ratos.
    6. Contenção de camundongos
      1. Coloque cada rato separadamente em uma retenção de rato limpo para os ratos de retorno de 4 h. de gaiola em casa com os homólogos mesmos.
    7. Interrupção do ciclo claro/escuro
      1. Transferência de ratos, em sua gaiola em casa com os seus homólogos específicos, para a sala de UCMS. Deixa a luz acesa, por 24 horas consecutivas.
        Nota: Somente durante esse estressor ratos serão permitidos acesso chow roedor e água ad libitum .
  7. Após aplicação do estressor, retorne gaiolas do grupo UCMS da sala UCMS para a sala de habitação.
  8. Durante as 4 semanas de exposição de estresse, manter o grupo ingênuo em suas gaiolas casa localizadas na sala de habitação.
    Nota: Ingênuo ratos não são transferidos para os quartos UCMS porque a exposição a outros ratos submetidos a procedimento de estresse poderia induzir um efeito stressogenic, mesmo sem exposição direta para o estressor89,90.
  9. Acompanhamento dos animais durante UCMS
    1. Durante estressor aplicações (exceto durante interrupções de luz/escuro ciclo) monitoram os ratos todos 30 min por um experimentador experiente. Se for observada uma aflição atípica (por exemplo, tremor, letargia, falta de movimento) (cuidado especial deve ser colocado em potencial hipotermia durante 'gaiola molhada' e 'umedecido serragem') aliviar o mouse do estressor imediatamente.
    2. Inspecione cada rato diariamente para feridas ou outras anomalias físicas ou comportamentais. Se tais são inspecionados consulte com o veterinário do laboratório para decidir se o mouse deve ser excluído do experimento.
    3. Pese cada rato a cada 3 dias. Robusta redução no peso corporal (i.e., > redução de 10% do peso inicial ou > 15% redução da última medida peso) devem ser comunicados ao veterinário do laboratório e o mouse deve ser excluído do experimento.

3. rastreio de antidepressivos

  1. No dia seguinte a cessação do protocolo UCMS, iniciar a administração de agentes farmacológicos terapêuticos putativos (ou seja, escitalopram [15 mg/kg; i.p.; 3 semanas; na administração diária]30,50, ou romance herbal tratamento [NHT; 30 mg/kg; i.p.; 3 semanas; uma administração por dia]30,50).
    Nota: Para doses de outros medicamentos não incluídos no presente protocolo, consulte: flouxetine46, 47, 49, 89, 90, paroxetine51, imipramina,35,41,42,43, desipramina,18,44,45, maprotilina,46,47, Mianserina,48, Melatonina43,49, URB59754 e outros naturais compostos37,55,56,57,58.
    Nota: NHT é uma fórmula herbal que foi desenvolvida em nosso laboratório. É composto por 4 componentes:
    Crataegus Pinnatifida, Triticum Aestivum, Lilium Brownie e Fructus Zizyphi jujuba. A fórmula é preparada dissolvendo os constituintes (adquiridos como grânulos liofilizados) juntos em solução salina contendo 1% DMSO para dar uma concentração final de 0,47 mg/ml (cada)27,50.
  2. Incluem um grupo de tratamento de controle e administrar soro fisiológico (3 semanas, i.p.; uma injeção por dia) para este grupo.
  3. Calcular a dose de drogas de acordo com ratos ' de peso, como obtido na pesagem anterior.
  4. Administre drogas cronicamente (administração de drogas geralmente uma por dia através da injeção intraperitoneal [IP] por 3 semanas).
    Nota: Não há nenhuma necessidade de anestesiar os ratos antes da injeção i.p..
  5. Continuam a pesar ratos cada 3 d; a última pesagem deve ser 3-d antes da última administração de drogas.

4. avaliação da tonalidade hedónica no SPT

  1. Após a fase de tratamento, remover cada rato da gaiola em casa e colocá-lo individualmente em uma gaiola cheia de serragem fresca e um pedaço de algodão para enriquecimento.
  2. Preparar duas garrafas, uma com água destilada e outra com solução de 2% de sacarose (outra substância poderia ser usada: por exemplo, a sacarina91, etanol30).
    Nota: Cada garrafa deve conter o mesmo volume de líquido. Fases de habituação nem prévia aclimatação são necessários antes da introdução de fluidos.
  3. Pesar as duas garrafas e configurá-los para a tampa da gaiola para permitir que os ratos ad libitum acesso a ambas as soluções para um período de (um dos seguintes): 24/48/72/144 h.
  4. Coloque as duas garrafas em ambas as extremidades da tampa da gaiola. Coloque comida roedor entre as duas garrafas para permitir o acesso ad libitum para comida.
  5. Substitua garrafas cada 24 h, usando frascos estéreis com líquido fresco.
    Nota: como os ratos são alojados individualmente não há nenhuma necessidade de mudar a serragem mesmo após 144 h92.
  6. Alterne as posições dos bicos cada 12 h (quando a duração do teste é de 24 h) ou uma vez por dia (quando o teste de duração excede 24 h) para contrabalançar a possibilidade de que os resultados foram confundidos por preferência de posição.
  7. Pese cada dia de garrafas para estimar o consumo de cada garrafa.
  8. Calcule a preferência de sacarose como theratio da ingestão de sacarose de ingestão total de líquidos (ou seja, sacarose/sacarose + água).

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Resultados

A fim de confirmar a eficácia do procedimento de indução depressiva, como déficits UCMS, realizou-se uma verificação de manipulação. Camundongos machos ICR consanguíneo foram aleatoriamente para condições UCMS ou ingênuo (4 semanas, conforme descrito no protocolo 2.2). Posteriormente, o SPT (6 dias, conforme descrito no protocolo 4) foi administrada para avaliar se os ratos depois de submetidos a UCMS demonstraram déficits hedônico. Pouco depois, os ratos foram sacrificados e o hipocampo ...

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Discussão

Na medida em que MDD é uma doença altamente debilitante generalizada, apenas parcialmente dirigida pelo atuais opções terapêuticas, a busca científica para melhores tratamentos ainda é um assunto urgente. Juntamente com as inovações em técnicas psicológicas, farmacoterapias adicionais são necessárias para a grande parte dos pacientes que não respondem às drogas existentes. Modelos animais meticulosos para a depressão são o elemento-chave nesta tarefa. Tais modelos seleções para antidepressivos inovadoras de facilitar e e...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer Gali Breuer pela sua assistência na produção vídeo. Esta pesquisa foi apoiada pela Israel Ministério da ciência, tecnologia & espaço (concessão n. º 313552), pelo Instituto Nacional de Psicobiologia em Israel (NIPEU-208-16-17b) e pela Fundação da Universidade aberta.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lâmpada de aquecimentoIkeaAA-19025-3
Almofada de aquecimentoSachsEF-188B
Limitador
Balança eletrônica portátil (*.** g)
Rolha de borracha padrão, tamanho 5Ancare#5.5RPara evitar derramamento durante o SPT
Tubo de beber aberto reto (2,5")AncareOT-100Para evitar derramamento durante o SPT (insira o tubo de bebida na rolha de borracha)
sacarose a 2%
TuboPara o SPT
Camundongos pré-adolescentes (aproximadamente 20 dias de idade) ICREnvigoHsd:ICR (CD-1)
de ratosSolução de de centrífuga cônico de 50 mL

Referências

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