Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

Resumo

Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.

Resumo

Este estudo apresenta métodos de laboratório para a quantificação de hipopigmentação atividade in vitro. Melanina, o pigmento principal em melanócitos, é sintetizada em resposta a múltiplos fatores celulares e ambientais. A melanina protege as células da pele de dano ultravioleta, mas também tem funções biofísicas e bioquímicas. Produção excessiva ou acúmulo de melanina nos melanócitos pode causar problemas dermatológicos, como sardas, manchas, melasma e moles. Portanto, o controle da melanogênese com hipopigmentação agentes é importante em indivíduos com necessidades clínicas ou cosméticos. Melanina é sintetizada principalmente nas melanossomas dos melanócitos em um complexo processo bioquímico chamado melanogênese, que é influenciado por extrínsecos e fatores intrínsecos, como hormônios, inflamação, idade e exposição à luz ultravioleta. Nós descrevemos três métodos para determinar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos ou substâncias naturais em melanócitos: medição da atividade de tirosinase 1) celular e conteúdo de melanina 2) e 3) coloração e quantificação celular melanina com imagem análise.

Na melanogênese, tirosinase catalisa a etapa limitante que converte a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (l-dopa) e depois em dopaquinone. Portanto, a inibição da tirosinase é um mecanismo primário hipopigmentação. Em melanócitos cultivados, atividade de tirosinase pode ser quantificada pela adição de l-dopa como substrato e produção de dopaquinone de medição por espectrofotometria. Melanogênese também pode ser medido através da quantificação do conteúdo de melanina. A fração celular contendo melanina é extraída com NaOH e melanina é quantificada espectrofotometricamente. Finalmente, o conteúdo de melanina pode ser quantificado por análise de imagem após coloração de Fontana-Masson de melanina. Embora os resultados desses ensaios in vitro não podem sempre ser reproduzidos na pele humana, estes métodos são amplamente utilizados na pesquisa da melanogênese, especialmente como o passo inicial para identificar potenciais hipopigmentação atividade. Esses métodos também podem ser usados para avaliar a atividade dos melanócitos, crescimento e diferenciação. Resultados consistentes com os três diferentes métodos garantir a validade dos efeitos.

Introdução

A melanina desempenha um papel crítico na fisiologia, patologia e toxicologia de vários órgãos, incluindo a pele, olhos e cérebro¹. As principais funções de melanina são efeitos foto-triagem e bioquímicos. A melanina absorve a luz infravermelha e visível, bem como a radiação ultravioleta (UV), com taxas de aumento de absorção em comprimentos de onda mais curtos de luz; assim, a melanina protege tecidos dos danos causados pela luz visível ou UV radiação². A melanina é um antioxidante e tem uma afinidade com metais e outros produtos químicos tóxicos; Portanto, pode proteger os tecidos de estresse oxidativo e químicas

Protocolo

1. preparação de reagentes, compostos e médio

1. Prepare B16F10 meio completo de crescimento. Suplemento Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (PEST).
   1. Para fazer 500 mL de meio completo, misture 445 mL do meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 50 mL de FBS e 5 mL de pragas em um frasco de vidro esterilizado de 1 L. Após a mistura suavemente, filtrar o meio através de um filtro de garrafa-top 0,2 µm para um novo frasco de vidro esterilizado e então loja a 4 ° C.
      Atenção: Todas as técnicas de cultura de célula devem ser realizadas utilizando a técnica asséptica para garanti....

Resultados

Resultados representativos para a atividade de hipopigmentação de arbutin, um antifato composto, em B16F10 melanócitos são mostrados abaixo. A figura 1A mostra que o arbutin suprimida significativamente a atividade de tirosinase celular comparada com o controle do veículo-tratados. Da mesma forma, o conteúdo de melanina de células estimuladas com arbutin foi significativamente reduzido em comparação com os controles (figura 1B). .......

Discussão

Apresentamos os protocolos para avaliar a atividade de hipopigmentação de compostos de teste usando melanócitos cultivados. Os resultados representativos mostraram o efeito de hipopigmentação de arbutin, um inibidor da tirosinase que inibiu o conteúdo de melanina de celular e atividade de tirosinase. Estes métodos são amplamente utilizados na investigação de actividade antifato. Usando estes ensaios, nós identificamos também com êxito vários compostos bioativos que possuem efeitos inibitórios melanogênese em células B16F.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3,4-Dihidroxi-l-fenilalanina	Sigma	D9628
Solução de hidróxido de amônio	Sigma	# 320145
Arbutin	Fluka	# 10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalina	Yakuri Pure Chemicals	# 16223	37%
Cloreto de ouro	American MasterTech	AHG0226	0,10%
HCl	Samchun químico	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear vermelho rápido	Merck	100121	Nuclear vermelho rápido 0,1% em 5% de alumínio sulfato.
Solução de penicilina e estreptomicina	HyClone	SV30010
Nitrato de prata	Duksan Pure Chemicals	#900
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Fosfato de sódio monobásico (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Tiossulfato de sódio pentahidratado	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris (hidroximetil) aminometano	Bio Basic Canadá	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tirosinase do cogumelo	Sigma	T3824	25 KU