Saccharomyces cerevisiae Cinética de crescimento exponencial na cultura de lote para analisar o metabolismo respiratório e fermentação

Crescimento de Saccharomyces cerevisiae tem servido como uma valiosa ferramenta para identificar dezenas de mecanismos fisiológicos e moleculares. Crescimento é medido principalmente por três métodos: diluições em série para testes, unidades formadoras de colônia contando e curvas de crescimento. Estas técnicas podem ser usadas isoladamente ou em combinação com uma variedade de substratos, condições ambientais, mutantes e produtos químicos para investigar respostas específicas ou fenótipos.

Respiração mitocondrial é um processo biológico em que cinética de crescimento tem sido aplicada com sucesso para descobrir mecanismos desconhecidos. Neste caso, a suplementação de meios de crescimento com carbono não-açúcares fermentáveis fontes como glicerol, lactato ou etanol (que são exclusivamente metabolizada pela respiração mitocondrial), como a única fonte de carbono e energia permite avaliar o crescimento respiratório, que é importante para detectar perturbações na fosforilação oxidativa atividade¹. Por outro lado, é complicado de usar modelos de cinética de crescimento como um método para decifrar os mecanismos subjacentes a fermentação.

O estudo da fermentação e respiração mitocondrial é essencial para elucidar os mecanismos moleculares por trás de certos fenótipos como o Crabtree e Warburg efeitos^2,3. O efeito Crabtree é caracterizado por um aumento de fluxo glicolítico, repressão da respiração mitocondrial e estabelecimento de fermentação como o principal caminho para gerar ATP na presença de altas concentrações de carboidratos fermentáveis (> 0,8 mM)^4,5. O efeito Warburg é metabolicamente analógico ao efeito Crabtree, com a diferença sendo que em células de mamíferos, o principal produto da fermentação é lactato⁶. Com efeito, o efeito Warburg é exibido por uma variedade de células cancerosas, provocando a absorção de glicose e de consumo, mesmo na presença de oxigênio⁷. Desse modo, estudar a base molecular do interruptor da respiração para fermentação no efeito Crabtree tem repercussões biotecnológicas (para produção de etanol) e potenciais impactos na pesquisa do câncer.

Crescimento de S. cerevisiae pode ser uma ferramenta adequada para estudar os efeitos de Crabtree e Warburg. Essa ideia é baseada no fato de que na fase exponencial de levedura, as vias centrais usadas para produzir ATP são respiração mitocondrial e a fermentação, que são essenciais para sustentar o crescimento. Por exemplo, o crescimento de S. cerevisiae é intimamente relacionado à função de caminhos de geração de ATP. Em moléculas de S. cerevisiae, o respiração mitocondrial produz aproximadamente 18 ATP por molécula de glicose, Considerando que a fermentação gera apenas 2 moléculas de ATP, portanto, espera-se que a taxa de crescimento tem apertadas ligações com as vias metabólicas produzir ATP⁸. A este respeito, quando a fermentação é a principal rota para gerar ATP, o fermento compensa a baixa produção de ATP, aumentando a taxa de absorção de glicose. Pelo contrário, o consumo de glicose pelas células de fermento que usam a respiração mitocondrial como a principal fonte de ATP é baixo. Isto indica que é importante para o fermento para disponibilidade de carboidratos de sentido antes de determinar como ATP será gerado. Portanto, a disponibilidade de glicose desempenha um papel importante no switch entre fermentação e respiração mitocondrial em S. cerevisiae. Na presença de quantidades elevadas de glicose, a levedura prefere fermentação como a rota central para gerar ATP. Curiosamente, quando o fermento é a fermentação, a taxa de crescimento específico é mantida no seu máximo. Por outro lado, sob níveis baixos de glicose, S. cerevisiae produz ATP usando respiração mitocondrial, a manutenção de baixas taxas de crescimento. Desse modo, a variação na concentração de glicose e a utilização de outras fontes de carbono induzir mudanças na preferência da levedura entre crescimento fermentativa e respiratório. Tendo em conta este facto com a equação de crescimento exponencial, pode-se obter o significado biológico de parâmetros cinéticos como a duplicação de tempo (Dt) e a taxa de crescimento específico (µ). Por exemplo, valores mais baixos µ foram encontrados quando a levedura utiliza respiração mitocondrial como o caminho principal. Pelo contrário, sob condições que favorecem a fermentação, foram encontrados valores superiores de µ . Esta metodologia pode ser utilizada para medir os prováveis mecanismos de quaisquer produtos químicos que afetam a fermentação e a respiração mitocondrial em S. cerevisiae.

O objetivo deste trabalho é propor um método baseado na cinética de crescimento para os efeitos de um determinada substância/composto na fermentação ou respiração mitocondrial de triagem.

1. meios de cultura e preparação do inóculo

1. Preparar 100 mL de meio líquido da 2% fermento extrato-peptona-dextrose (YPD) (adicionar 1 g de levedura extrato, 2 g de peptona de caseína, e 2 g de glicose em 100 mL de água destilada). Diluir 3 mL dos meios de comunicação em esterilizáveis tubos cônico de 15 mL. Autoclave a mídia por 15 min a 121 ° C e 1,5 libras por polegada quadrada.
   Nota: A mídia pode ser armazenada por até um mês 4 – 8 ° c.
2. Inocular um tubo cónico cheio com 3 mL de cool caldo YPD 2% estéril com 250 μL de células de S. cerevisiae conservados em glicerol a-20 ° C. Incube durante uma noite em um agitador orbital, a 30 ° C, com agitação a 200 rpm.
3. Raia, uma placa de Petri (60 x 15 mm²) repleto de estéril 2% YPD ágar-ágar (adicionar extrato de 10 g de fermento, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glicose, e 20 g de ágar-ágar bacteriológico para 1.000 mL de água destilada) com as células cultivadas no tubo cónico com uma ansa estéril. Incube a placa de Petri a 30 ° C até as colônias isoladas mostram crescimento.
4. Preparar o pre-inóculo por inocular uma única colônia isolada em um tubo cônico cheio com 10 mL de cool caldo YPD 2% estéril e incubá-lo durante a noite a 30 ° C, com agitação contínua a 200 rpm.

2. meios de cultura e curvas de crescimento em microplacas

1. Prepare-se 10 mL de caldo YPD 1% (adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,1 g de glicose a 10 mL de água destilada), 10 mL de caldo YPD de 2% (adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,2 g de glicose a 10 mL de água destilada) e 10 mL de caldo YPD 10% (adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 1 g de glicose a 10 mL de água destilada). Autoclave estes meios de crescimento para 15 min a 121 ° C e 1,5 libras por polegada quadrada.
   Nota: Os meios de cultura serve como um controle do crescimento de fermentação.
2. Prepare-se 10 mL de caldo de (tipo) de etanol-peptona-extrato de fermento 2% e 10 mL de caldo de (YPG) de glicerol-peptona-extrato de levedura 2%. Para 2% tipo: Adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,2 mL de etanol a 10 mL de água destilada. Para 2% YPG: Adicionar 0,1 g de levedura extrato, 0,2 g de peptona, e 0,2 mL de glicerol a 10 mL de água destilada. Autoclave estes meios de crescimento para 15 min a 121 ° C e 1,5 libras por polegada quadrada.
   Nota: O glicerol e o etanol são fontes de carbono não-açúcares fermentáveis que são exclusivamente metabolizadas pela respiração mitocondrial. Por esta razão, eles são usados como um controles de crescimento respiratória. Nesta etapa, o tipo e a concentração da fonte de carbono nos meios de comunicação de cultura podem ser alteradas para testar os efeitos sobre o fenótipo de crescimento usando fermento extrato-peptona (YP) caldo de carne (10 g de extrato de levedura e 20 g de peptona de caseína em 1.000 mL de água destilada) como base. Para testar os efeitos de outros nutrientes além do carbono, completa sintético (SC) meio é suplementado de acordo com o objetivo do experimento. A base para o meio de SC é 1,8 g de nitrogênio levedura base sem aminoácidos, 5 g de sulfato de amônio [(NH₄)₂SO₄], 1,4 g de fosfato monossódico (NaH₂PO₄), e 2 g de abandono se misturam em 1.000 mL de água destilada. Suplemento a mídia com uma fonte de carbono e fonte de nitrogênio adicional nas concentrações necessárias.
3. Adicionar 145 μL de meios de cultura apropriados para o delineamento de cada poço de uma microplaca esterilizada (10 x 10-bem) com uma tampa e inocular-lhes 5 μL do pre inóculo.
   Nota: Se o objetivo é a tela a influência de substâncias/compostos sobre o metabolismo energético da levedura, essa substância/composto devem ser adicionado durante esta etapa. Além disso, qualquer tipo de microplacas com tampa deve ser útil.
4. Incubar a placa multi bem em um leitor de microplacas a 30 ° C, com agitação constante a 200 rpm por 48 h. medida da densidade óptica (OD) em 600 nm cada 30 ou 60 min.
   Nota: Se o leitor de microplacas não tem a opção para incubar o microplate, podem ser incubada em um agitador orbital nas mesmas condições entre cada medição do OD.

3. crescimento curvas em Matrases abalados

1. Adicione 4,8 mL dos meios de cultura apropriados para autoclave e matrases de 20 mL. Inocule cada frasco com 200 μL da cultura pré-inóculo no OD_600nm ~ 2 em caldo YPD 2% legal, estéril. Incube-os a 30 ° C, com constante agitação a 250 rpm durante 24 h.
   Nota: Se o período de incubação é superior a 24 h, adicione 12 mL dos meios de cultura apropriados para autoclave e matrases de 50 mL. Inocule-lhes com 500 μL do pre inóculo. Também é importante considerar os controles de crescimento fermentativa (mídia YP com 1%, 2% ou 10% de glicose) e controles de crescimento respiratória (mídia YP com 2% de glicerol ou etanol).
2. Levar 100 μL da cultura Erlenmayer abalada e diluí-la em 900 μL de água destilada em um fluorímetro de 1 mL e misture suavemente pipetando. Medir a D.O. a 600 nm, utilizando um espectrofotômetro cada 2 h. Para obter o real OD, multiplique o resultado por 10.

4. processamento de dados e cálculo de parâmetros cinéticos

1. Crie um novo arquivo de projeto do software pacote estatístico. Na seção de "nova tabela e gráfico", escolha a opção "XY" .
   1. Selecione a opção: "Comece com uma tabela de dados vazio" na seção "Dados de amostra" .
   2. Selecione o tipo de gráfico "Pontos e ligação" . Embora a seção de "X" desmarcada no segmento do "Subcolumns para repetições ou valores de erro" e no "Y" seção escolha a opção: "Digite (10) valores replicar em subcolumns lado a lado e plotar a média e o erro SD". Clique no botão criar.
      Nota: O formato de tabela possui uma coluna de X e várias colunas de Y, cada uma com os 10 subcolumns escolhidos anteriormente.
2. Escrever o tempo no qual OD medidas foram feitas na coluna de X (por exemplo, 0, 30, 60, 90 min ou 0, 1, 1,5, 2 h). Nas colunas de Y, escreva os valores de OD obtidos a partir das culturas.
3. Identifica a fase de crescimento exponencial, transformando os dados da coluna de Y em logaritmos. Clique no botão "Analisar" , escolher a análise de "Transformar" , selecione os valores de Y usando Y = Log(Y). Vá para a "Galeria dos resultados", selecione "Transformar" tabela de dados, clique no botão "Analisar" e escolher a análise de "Regressão Linear" . Exclua os valores de OD que não seguem um comportamento linear. Para excluir os valores, selecione-os na tabela de dados e digite "Ctrl + E".
   Nota: É importante excluir os valores que não seguem a fase exponencial, uma vez que a equação de crescimento exponencial se encaixa bem com a fase exponencial.
4. Na "Galeria de tabelas de dados", selecione a tabela de dados "dados 1". Clique no botão "Analisar" e escolher a análise de "Regressão não-linear (ajuste de curva)" entre as análises"XY".
5. Selecione os conjuntos de dados para analisar e clique no botão "Okey" . Na aba "Ajuste" escolher a seção "Equação exponencial" e selecione a "equação de crescimento exponencial" (, onde X é a concentração de células, X₀ é a concentração de células no tempo zero, μ é a taxa de crescimento específico, e t é o tempo). Use o "ajuste de mínimos quadrados" como um método de montagem e deixar desmarcado a seção interpolar. Clique no botão "Okey" .
   Nota: O guia com os resultados de forma não-lineares é na "Galeria dos resultados". O software calcula a duplicação de tempo (Dt) e específicas de taxa de crescimento (μ). O software mostra μ como K , na aba de resultados.
6. Abra um novo arquivo de projeto e na seção "nova tabela e gráfico" , selecione a opção coluna. Escolha a opção "Iniciar com uma tabela de dados vazio" e selecione o gráfico desejado. Escolha para plotar a média com o SD. Selecione o botão "Criar" .
7. Copie o μ ou Dt valores na guia resultados de forma não-linear que é na "Galeria dos resultados" e colá-los em uma coluna. Finalmente, selecione o botão "Analisar" e escolha a análise desejada na seção "Análise da coluna" para comparar os parâmetros cinéticos das diferentes condições nutrimental.
   Nota: Os parâmetros cinéticos Obtém dos controles do crescimento fermentativa (mídia YP com 1%, 2% ou 10% de glicose) e controles de crescimento respiratória (mídia YP com 2% de glicerol ou etanol) ajuda a estabelecer o limite da respiração mitocondrial e fermentativa, respectivamente. Comparando o cinético parâmetros da condição nutricional e analisada com o crescimento de respiratório e fermentativa substância/composto ajudam a identificar o possível efeito sobre o metabolismo respiratório ou fermentativa.

Curvas de crescimento podem ser usadas para preliminarmente discriminar entre fenótipos respiratórios e fermentativa em levedura S. cerevisiae . Portanto, foram realizadas culturas de lote de S. cerevisiae (BY4742) com concentrações diferentes de glicose que foram relatadas para induzir o crescimento de fermentação: 1%, 2% e 10% (p/v)9. Mostrando um fenótipo fermentativa de culturas têm uma fase de pequeno lag e uma fase exponencial com uma elevada taxa de crescimento (Figura 1). Etanol, glicerol e lactato são as fontes de carbono que podem ser metabolizadas apenas pela respiração; assim, foram realizadas culturas da levedura utilizando essas fontes de carbono. Culturas que obtêm energia principalmente através da fosforilação oxidativa mostraram uma fase mais tempo de retardo e lenta taxa de crescimento durante a fase exponencial (Figura 2).

Análise das curvas de crescimento fornece apenas informações qualitativas; Portanto, é importante calcular os parâmetros cinéticos para obter informações quantitativas. Calculamos o Dt e μ utilizando a equação de crescimento exponencial (Figura 3). Podemos definir um limite para valores de crescimento respiratória no Dt ≥11.5 h e μ ≤0.059 / h. O limite para crescimento fermentativa foi fixado em Dt ≤6.5 h e μ ≥0.149 / h (Figura 3).

Para provar a utilidade desta ferramenta de rastreio, desenhamos três experimentos, com o primeiro para avaliar os efeitos das concentrações de resveratrol diferentes (RSV) na BY4742 de S. cerevisiae células com diferentes status energético (Figura 4) em frascos de abalada. O segundo experimento teve como objetivo detectar os efeitos de concentrações diferentes de sulfato de amónio (NH4+) sobre o metabolismo de energia de BY4742 de S. cerevisiae (Figura 5) em uma microplaca. Finalmente, o terceiro visa ilustrar como alterações na fonte de carbono afetam crescimento fermentativa em duas diferentes cepas de S. cerevisiae (W303 e industrial WLP530 usado para a fermentação de cerveja) (Figura 6). No experimento usando RSV, o status energético da célula foi modificado através da variação de concentração de glicose. Em 10% de glicose, todas as concentrações de RSV testadas não alterou a fase respiro-fermentação da levedura, mas diminuir a fase respiratória (durante o turno de diauxic, S. cerevisiae metabolizado o etanol produzido durante a fase exponencial de fosforilação oxidativa). Os valores μ confirmaram que todas as condições testadas, S. cerevisiae mostraram comportamento fermentativa, ao contrário do seu fenótipo, quando cultivado em 2% de glicerol (condição usada como um controle respiratório) (figura 4a). Quando as células foram energizadas com 1% de glicose apenas, os valores μ confirmaram que em 0.1, 1, 10 e 100 µM RSV, fermentativa comportamento na fase de fermentação-respiro não foi afectado. No entanto, foi observada uma diminuição na fase respiratória durante o turno de diauxic. Além disso, em uma concentração de 1.000 µM, RSV completamente inibida do crescimento celular.

No segundo experimento, as células foram suplementadas com 10% de glicose, uma concentração considerada suficiente para induzir o efeito Crabtree em S. cerevisiae. Daí, observamos o efeito promovido pela suplementação de diferentes concentrações de NH4+ no metabolismo da fermentação. Dt valores sugeriram que 0.13, 0,66 e 1,99% NH4+ favor fermentativa metabolismo, e pode-se observar em curvas de crescimento que essas concentrações alargada fase exponencial da cultura. Não obstante, em 3,31% mM NH4+, um incremento no valor Dt mostrou que esta concentração induz um respiro-fermentativa metabolismo. Este fenótipo mostrou uma fase de retardo estendida nas curvas de crescimento e taxa de crescimento mais lenta na fase exponencial (Figura 5).

No terceiro experimento, células de dois diferentes cepas de S. cerevisiae (W303 e WLP530) foram cultivadas em diferentes concentrações de sacarose ou galactose para testar se os efeitos da fonte de carbono em valores Dt foram tensão-dependente. Como um controle de fermentação, ambas as cepas foram cultivadas em 2% de glicose, e Dt valores foram calculados para definir um limite para crescimento fermentativa. A fermentação Dt valores para as cepas foram diferentes, com ≤3.25 h para a estirpe W303 e h para o WLP530 ≤6.84 Coe. Portanto, é importante destacar a necessidade de validar o limite Dt para as diferentes estirpes usadas. Além disso, quando sacarose foi usado como fonte de carbono, um fenótipo fermentativa foi observado em 2% e 10% em ambas as linhagens. No entanto, quando utilizou-se a galactose, a estirpe W303 não mostrou comportamento fermentativa em qualquer das concentrações testadas, enquanto que a tensão de WLP530 mostrou um fenótipo fermentativa em galactose de 2%. Curiosamente, a estirpe de W303 cresceu em todas as concentrações de ambas as fontes de carbono testadas. No entanto, a tensão de WLP530 não mostrou crescimento na mais baixa concentração de carbono usado (0,01%). Isto pode ser porque o WLP530 é usado na indústria de cerveja e as concentrações de carbono a que está exposto são geralmente muito maior (Figura 6).

No total, os dados destas três experiências provam que as curvas de crescimento e parâmetros cinéticos são úteis para a discriminação preliminar entre crescimento respiratória e fermentativa em S. cerevisiae. Além disso, é importante salientar que esta é uma ferramenta versátil que pode ser usada em diferentes aspectos da investigação do metabolismo de energia.

Figura 1: Efeito de concentrações de glicose diferentes no fenótipo de crescimento de S. cerevisiae . Curvas de crescimento foram construídas através da medição da densidade óptica em 600 nm todos 30 min por 48 h. Quando as células de S. cerevisiae de fermentar, culturas mostraram uma fase de retardo curto e a taxa de crescimento rápido durante a fase exponencial. A fase de respiro-fermentativa poderia ser seguida por uma fase de desaceleração de crescimento (fase respiratória), onde o etanol produzido por fermentação é metabolizado usando via fosforilação oxidativa, em seguida, a fase estacionária é alcançada. Os dados são apresentados como média ± erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Efeito de fontes de carbono respirável no fenótipo de crescimento de S. cerevisiae . Curvas de crescimento foram construídas através da medição da densidade óptica em 600 nm cada 30 min para células de 48 h. de S. cerevisiae mostrou uma fase de retardo prolongado e a taxa de crescimento lento durante a fase exponencial e geralmente não mostrou uma mudança diauxic. Os dados são apresentados como média ± erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito da fonte de carbono e sua concentração nos parâmetros cinéticos de S. cerevisiae . (um) Dt valores de crescimento BY4742 de S. cerevisiae sob fontes de carbono diferente; (b) valores μ do crescimento de BY4742 de S. cerevisiae sob diferentes concentrações de fontes de carbono diversos. Os dados são apresentados como o média ± desvio-padrão. Análises estatísticas foram realizadas utilizando uma One-Way ANOVA seguida pelo teste de Dunnett-um (*p < 0,01 vs. 2% de glicose). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: efeito da suplementação de resveratrol no status de energia de célula diferente. (um) crescimento fenótipo e μ valores usando 10% de glicose; (b) crescimento fenótipo e μ valores usando 1% de glicose. Dados de curvas de crescimento são apresentados como média ± erro padrão, e valores μ são apresentados como o média ± desvio-padrão. Análises estatísticas para valores μ foram realizadas usando uma One-Way ANOVA seguida pelo teste de Dunnett, um [*p < controle respiratório 0,01 vs. com 2% de glicerol (RC)]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Efeito da suplementação de sulfato de amônio no metabolismo energético de S. cerevisiae . Curvas de crescimento foram construídas através da medição da densidade óptica em 600 nm todos 30 min por 48 h. dados de curvas de crescimento são apresentados como média ± erro padrão, e valores μ são apresentados como o média ± desvio-padrão. Análises estatísticas para valores Dt foram realizadas usando uma One-Way ANOVA seguida pelo teste de Dunnett, uma [* p < controle respiratório 0,01 vs. com 2% de glicerol (RC)]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: efeito da concentração de galactose e sacarose no metabolismo fermentativa de Saccharomyces cerevisiae. (um) Dt valores para W303 laboratório cepa (b) Dt valores e para a estirpe industrial WLP530. Os dados são apresentados como o média ± desvio-padrão. Análises estatísticas para valores Dt foram realizadas usando uma One-Way ANOVA seguida pelo teste de Dunnett, uma [* p < 0,01 vs. 2% de glicose (controle fermentativa)]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.