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Artigo de método

Síntese e caracterização de placentária Condroitina sulfato de uma (plCSA) - Targeting Lipid - nanopartículas de polímero

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DOI:

10.3791/58209

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18 de setembro de 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 2Guangdong Key Laboratory of Nanomedicine, CAS Key Lab for Health Informatics, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (CAS), 3Department of Chemistry, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de sulfato de condroitina placentária A peptídeo de vinculação (plCSA-BP)-conjugados lipid-polímero nanopartículas através de etapa única sonication e bioconjugate técnicas. Estas partículas constituem uma nova ferramenta para a entrega de alvo da terapêutica de tumores mais humanos e trophoblasts da placenta para tratar cancros e anormalidades da placenta.

Resumo

Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Nanopartículas ativamente direcionamento oferecem uma abordagem promissora para a terapia do câncer. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é expressa em uma ampla gama de células cancerosas e trophoblasts da placenta e proteína da malária que var2csa especificamente pode ligar para plCSA. Um peptídeo de sulfato de condroitina placentária relatado A ligação (plCSA-BP), derivado da malária proteína VAR2CSA, especificamente também pode ligar para plCSA em células cancerosas e trophoblasts placentárias. Daí, nanopartículas plCSA-BP-conjugado podem ser usadas como uma ferramenta para entrega de drogas específicas para cânceres humanos e trophoblasts placentárias. Neste protocolo, descrevemos um método para sintetizar lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero nanopartículas carregadas com doxorrubicina (plCSA-DNPs); o método consiste em um único sonication passo e bioconjugate técnicas. Além disso, vários métodos para caracterizar plCSA-DNPs, incluindo a determinação de suas propriedades físico-químicas e celular captação pelas células da placenta Coriocarcinoma (JEG3), são descritos.

Introdução

Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Daí, tumor seletivo segmentação é a chave para explorar métodos terapêuticos bem sucedidos. Nanopartículas para oferecer uma oportunidade promissora para a terapia do câncer, e moleculares assemblies com diferentes grupos funcionais irão melhorar a eficácia da droga e reduzir os efeitos colaterais associados1,2. Além disso, os sistemas de nanopartículas principalmente utilizam passiva e ativa como alvo para atingir o alvo tumores3.

Segmentação passiva explora as características inatas de nanopartículas e permeabilidade reforçada e efeitos de retenção (EPR) para alcançar as células do tumor. Os lipossomas catiônicos têm sido utilizados com sucesso para entregar várias drogas anticâncer para tumores em aplicações clínicas4,5,6. Apesar do potencial efeito terapêutico eficaz do cancro, uma concentração baixa de drogas na região de tumor e uma incapacidade de distinguir as células do tumor de tecidos normais são duas limitações principais de nanopartículas de direcionamento de passivo-7.

Estratégias de segmentação ativas aproveitam do antígeno-anticorpo, ligante-receptor e outras interações de reconhecimento molecular para entregar drogas especificamente tumores8. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é amplamente expresso na maioria das células cancerosas e trophoblasts placentárias. Além disso, a proteína da malária VAR2CSA especificamente pode ligar para plCSA9,10. Portanto, o VAR2CSA pode ser uma ferramenta para o direcionamento de células cancerosas humanas. No entanto, quando VAR2CSA é conjugada com nanopartículas, a proteína completo pode limitar a penetração de nanopartículas em células tumorais. Recentemente, descobrimos um peptídeo de vinculação de plCSA (plCSA-BP), derivado da proteína da malária VAR2CSA. nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados rapidamente ligado a células de Coriocarcinoma e doxorrubicina significativamente aumentada (DOX) atividade anticancerígena em vivo11; Estas partículas também especificamente ligados a trophoblasts da placenta e podem servir como uma ferramenta para a entrega de alvo de drogas para a placenta12.

Nanopartículas de lipídios-polímero consistem em um escudo de monocamada lipídico e um núcleo de polímero hidrofóbico e representam uma nova transportadora para a entrega da droga. Essas nanopartículas combinam as vantagens de lipossomas e nanocarriers poliméricos, tais como tamanho controlável de nanopartículas, alta biocompatibilidade, liberação de drogas sustentado, eficiência de carregamento de droga alta (LE) e excelente estabilidade13. Neste trabalho, usamos um método passo a passo sonication para sintetizar lipídios-polímero nanopartículas. Este método é rápido, conveniente e apropriado para aumentar e tem sido amplamente utilizado para preparar as nanopartículas de lipídios-polímero do nosso grupo11,14 e outros15,16,17,18 .

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) cloridrato de carbodiimida (EDC) é uma popular carbodiimida usada como um agente de reticulação para conjugar biomoléculas contendo aminas e carboxilatos19. Além de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) é o reagente de conjugação mais comum na superfície e nanopartículas conjugação reações20,21. NHS pode reduzir o número de reações colaterais e melhorar a estabilidade e o rendimento do éster intermediários22,23.

Aqui, descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Primeiro, a síntese de etapa única sonication de nanopartículas de lipídios-polímero DOX-carregado (DNPs) é descrita. Então, uma técnica de bioconjugate EDC/NHS para a geração de nanopartículas de lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero é introduzida. Esta técnica de bioconjugate também pode ser usada para conjugar outros anticorpos e peptídeos de nanopartículas. Finalmente, descrevemos o ensaio físico-químico de propriedades e in vitro usado para caracterizar as nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Acreditamos que essas nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo poderiam constituir um sistema eficaz para a entrega de alvo de drogas para cânceres mais humanos e a alvo entrega de cargas para a placenta para tratar anormalidades da placenta.

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Protocolo

1. preparação das soluções estoque

  1. Prepare uma solução aquosa de etanol a 4% diluindo com 100 mL de água ultrapura, 4 mL de etanol absoluto. Armazenar a solução a 4 ° C.
    Nota: Água ultrapura é definida como a água sem contaminantes, como bactérias, partículas, íons ou nucleases. Água ultrapura foi Obtida de um sistema de purificação de água com uma resistividade de alvo de até 18,2 mΩ·cm, que significa baixa contaminação aniônica.
  2. Prepare um 1 mg/mL solução de lecitina de soja, dissolvendo-se 20 mg de lecitina de soja em 20 mL de solução aquosa de etanol a 4%. Armazenar a solução estoque da lecitina de soja a 4 ° C.
  3. Prepare um 25 mg/mL solução DSPE-PEG (2000)-COOH dissolvendo-se 100 mg de DSPE-PEG-COOH em 4 mL de solução aquosa de etanol a 4%. Armazenar a solução estoque a-20 ° C.
  4. Prepare um 10 mg/mL solução stock de DOX, dissolvendo-se 50 mg de DOX em 5 mL de água ultrapura. Armazene a solução estoque DOX a 4 ° C no escuro.
  5. Prepare um 2 mg/mL solução stock de PLGA, dissolvendo-se 20 mg de PLGA em 10 mL de acetonitrila. Armazenar a solução estoque de PLGA a 4 ° C.
    Cuidado: Acetonitrilo é inflamável e tóxico. Operar com cuidado em uma coifa e usar o equipamento pessoal, tais como aventais, óculos de segurança e luvas de látex.
  6. Prepare uma solução stock ácido (MES, pH 6.0) de etanesulfónico 0,1 M 2-(morpholino) dissolvendo 2,17 g do MES em 100 mL de água ultrapura. Armazenar a solução a 4 ° C.

2. síntese das DNPs

Nota: Para evitar degradação fotoquímica de DOX, todas as operações foram realizadas no escuro.
Nanopartículas foram sintetizadas por um relatado anteriormente etapa única sonication método11,13,14.

  1. Adicione 3 mL de solução aquosa de etanol a 4% para um tubo de centrifuga estéril 10 mL. Em seguida, adicione 90 µ g da solução-mãe lecitina de soja, 210 µ g da solução DSPE-PEG-COOH e 750 µ g da solução DOX para 3 mL de solução aquosa de etanol a 4%.
  2. Coloque o tubo de centrifugação em um banho de gelo e coloque o banho de gelo em um processador ultra-sônico.
  3. Com uma seringa de 1 mL, pipete 2 mg de PLGA solução-mãe gota a gota (1 gota/4-6 s) no tubo de centrífuga. Enquanto isso, proceda à sonicação do tubo usando um processador ultra-sônico em uma frequência de 20 kHz e uma amplitude de saída de 30% por 5 min para sintetizar os DNPs.
    Nota: Para sintetizar partículas uniformes com tamanhos pequenos, a velocidade na qual a solução PLGA é gotejada no tubo precisa ser lento, e geração de bolha deve ser evitada.
  4. Purificar os DNPs lavando a solução acima no buffer MES de 0,1 M (pH 6,0) 3 vezes usando um filtro de centrífuga (MWCO, 10 kDa). Centrifugar a 4 ° C e 1000 × g por 3 min cada tempo. Finalmente, aproximadamente 1 mL de nanopartículas MES-resolvido deve permanecer.
    Nota: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. Se não costumava conjugado peptídeos, as nanopartículas podem ser purificadas por tampão PBS (pH 7,4) e os DNPs purificados podem ser armazenados a 4° C, no escuro.

3. conjugação de peptídeos para DNPs

  1. Ativação de éster
    1. Adicionar 0,4 mg de EDC (concentração final 2 mM) a 1 mL de DNPs.
    2. Adicionar 0,24 mg de NHS para a reação (concentração final de 2 milímetros).
      Nota: Para fácil adição da quantidade correta de EDC e NHS, uma solução pode ser preparar os reagentes são dissolvidos e usados imediatamente.
    3. Misturar os componentes de reação bem e colocar a reação num agitador; permita a reação por 30 min - 1 h à temperatura ambiente no escuro.
  2. Reação de amina
    1. Aumentar o tampão pH 7,2-7,5 usando PBS (20 ×, pH 7,4).
    2. Adicione 0,5 mg de plCSA-direcionamento peptide (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) para a solução de reação.
      Nota: Antes de adição, dissolva os peptídeos em 20% acetonitrila. Se não solúvel, peptídeos sonication em um sonicador de banho pode útil.
    3. Misture a solução bem e coloque em uma coqueteleira; permitir que a reação proceder a 4 ° C durante a noite, no escuro.
    4. Coloque a solução de conjugado em sacos de diálise (MWCO, 3.500 Da) para urinar e purificar os DNPs-plCSA usando o tampão PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente por 24 h no escuro.
      Nota: Como alternativa, purificação pode ser executada como na etapa 2.4 para obter plCSA-DNPs.
    5. Para aplicações de cultura de células, filtre a solução reconstituída através de um filtro de 0,22 µm seringa estéril para remover potenciais precipitados.

4. caracterização de lipídios plCSA-alvo-nanopartículas de polímero

  1. Medição do tamanho hidrodinâmico de nanopartículas usando Difusão dinâmica da luz (DLS)
    1. Nanopartículas diluídas com água ultrapura (50-fold diluição). Carrega 500 µ l da amostra em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta.
      Nota: Potencial Zeta e cubetas DLS podem diferir com base nas especificações do instrumento.
    2. Depois de concluída a medição, grave o diâmetro das partículas, índice de polidispersividade (PDI) e potencial zeta. Média dos resultados obtidos de 4 repetidas leituras e calcular o desvio padrão.
  2. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
    Nota: A morfologia das nanopartículas foi observada pela TEM com o método da mancha negativa. 24
    1. Nanopartículas diluídas com água ultrapura (400-fold diluição). Adicionar 20 µ l da amostra para um grid TEM e deixe para descansar por 5 min.
    2. Adicione 100 µ l de ácido fosfotúngstico a 2% (p/v) e deixe para descansar por 2 min. pavio fora da gota.
    3. Seque a grade TEM a temperatura de quarto.
    4. Definir a tensão de aceleração TEM 80 kV e ampliar a imagem para 100.000 × Visualizar as nanopartículas.
  3. Determinação da eficiência de encapsulação (EE) e LE
    1. Geração da curva padrão. Dissolver a DOX em água ultrapura para preparar soluções DOX de cinco diferentes concentrações: 1 µ g/mL, 5 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL e 100 µ g/mL. Medir a absorção das soluções DOX em 480 nm com um espectrómetro de UV-VIS. Gere uma curva padrão baseada-se as concentrações de DOX.
    2. Dilua 25 µ l de nanopartículas com 500 µ l de água ultrapura. Medir a absorção no 480 nm com um espectrómetro de UV-VIS. Calcule as concentrações de droga pela curva padrão.
    3. Calcule o LE usando a seguinte equação:
      LE = ((quantidade de drogas em nanopartículas) / (peso total dos materiais)) × 100%.
    4. Calcule o EE usando a seguinte equação:
      EE = ((quantidade de drogas em nanopartículas) / (quantidade de adicionado droga)) × 100%.
  4. Medição da eficiência conjugação usando o bicinchoninic ácido (BCA) ensaio 25 , 26 , 27
    1. Pipete 25 µ l de soluções padrão de peptídeo (tabela 1) ou plCSA-DNPs em poços da microplaca em duplicado. Adicionar 200 µ l de reagente de trabalho para cada poço e misture a placa bem em um agitador de placa por 30 s.
    2. Cobrir a placa e incubar a 37 ° C por 30 min.
    3. Medir a absorvância a 562 nm em um leitor de placa. Use a curva padrão gerada para calcular as concentrações de plCSA de plCSA-DNPs.
    4. Calcule a eficiência de conjugação usando a seguinte equação:
      Eficiência de conjugação = ((quantidade de peptídeo em nanopartículas) / (quantidade de adicionado do peptide)) × 100%.
Tubo de ensaioVolume de diluente (μL)Volume e fonte de peptídeo (μL)Concentração final do peptide (μg/mL)
A0300 de estoque1000
B250250 do frasco uma diluição500
C250250 de diluição do frasco B250
D250250 de diluição frasco C125
E300200 de diluição frasco D50
F250250 de diluição do frasco E25
G400100 de diluição do frasco F5
H50000

Tabela 1. Preparação de peptídeos padrão

5. avaliação de microscopia de fluorescência de plCSA-alvo absorção de nanopartículas nas células Coriocarcinoma (JEG3)

  1. Semente de células em placas de 12 poços estéril em 1,0 × 104 células/poço com DMEM/F12 completa (cDMEM/F12, contendo 1% penicilina/estreptomicina e 10% fetal de soro bovino (FBS)). Permitir que as células a crescer a confluência de 60% a 37 ° C e 5% CO2 sob condições úmidas.
  2. Remova a mídia e adicionar 1 mL de mídia fresca fria com um teor baixo de soro (5% FBS) e DNPs ou plCSA-DNPs (5 µ g de equivalentes DOX).
  3. Incube a mistura de células e nanopartículas a 4 ° C, durante 1 h.
  4. Após a incubação, remova a mídia e lavar as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 1 mL de cDMEM fresco/F12 e incube as celulas a 37 ° C por 30 min.
  5. Retire a cDMEM/F12 e lave as células três vezes com PBS.
  6. Adicionar 2 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) e incubar a temperatura ambiente por 15 min consertar as células.
  7. Remova o PFA. As células com 2 mL de PBS lave uma vez. Adicionar 1 mL de PBS contendo DAPI (1 µ g/mL) para núcleos de coloração e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
  8. Aspirar a PBS e lavar as células três vezes com PBS.
  9. Adicionar o meio de montagem e imagem a fluorescência com uma microscopia de fluorescência, utilizando canais verdes e azul para visualizar o DOX e núcleos, respectivamente.

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Resultados

Neste protocolo, lecitina de soja, DSPE-PEG-COOH e PLGA são um polímero representativo, lipid-PEG-COOH conjugado e lipídios, respectivamente. A síntese de nanopartículas de lipid-polímero plCSA-alvo através de uma única etapa sonication método e uma técnica EDC/NHS é ilustrada na Figura 1. Primeiro, em condições de sonication, lecitina de soja, PLGA e DSPE-PEG-COOH auto-montagem para shell-núcleo de forma estruturada DNPs. O núcleo consiste de PLGA e...

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Discussão

Este protocolo fornece um método eficiente e reproduzível para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados. O método passo a passo sonication para preparar nanopartículas de lipídios-polímero é rápido, reprodutível e diferente do típico nanoprecipitation métodos que envolvem o aquecimento, evaporação ou num Vortex. Portanto, o método desenvolvido reduz significativamente o tempo de síntese. Além disso, a EDC/NHS bioconjugate utilizado neste protocolo é uma técnica comumente usada e conveniente co...

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Divulgações

X.F. e B.Z. são os inventores sobre a patente PCT/CN2017/108646 e 201710906587.6 submetidos SIAT que abrange um método de síntese de nanopartículas plCSA-alvo e aplicação. Não há conflitos de interesse potenciais foram divulgados por outros autores.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1000402), Fundação Nacional de ciências naturais (81571445 e 81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) para O fundo de investigação do Basic de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) para X.F. e X.F.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
peptídeo plCSAShanghai GL Biochem573518para síntese de peptídeos
Etanol absolutoSinopharm 10009218 químicopara síntese de nanopartículas
Lecitina de sojaAvanti Polar Lipids441601para síntese de nanopartículas
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125para síntese
de nanopartículasDoxorrubicinaJKChemical113424para síntese de nanopartículas
AcetonitrilaShanghai Lingfeng1008621para síntese de nanopartículas
PLGASigma-Aldrich719897para síntese de nanopartículas
Processador ultrassônicoSonicsVCX130para síntese de nanopartículas
Filtro centrífugo (MWCO 10 kDa)MilliporeUFC801024para centrífuga de purificação de nanopartículas
Sigma3-18KSpara purificação de nanopartículas
Ácido 2-[morfolino] etanossulfônico (MES)Sigma-AldrichM3671para conjugação de peptídeos
Cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)Sigma-Aldrich3450para conjugação de peptídeos
N-hidroxisuccinimida (NHS)Sigma-Aldrich56480para conjugação de peptídeos
Bolsas de diáliseSpectrum132592Tpara purificação de nanopartículas
PBSHycloneSH30028.01para cultura de células
Tubos de centrífuga de 10 mL, polipropilenoAladdinS-025para síntese de nanopartículas
Tubos de centrífuga de 15 mL, polipropilenoCorning430791para várias aplicações
0,22 μ m filtro de seringa estérilMilliporeSLGV033RBpara purificação de nanopartículas
seringa de 1 ml, polipropilenoBD328421para síntese de nanopartículas
Malvern ZetasizerMalvernNano ZSpara analisador de tamanho de partícula
Ácidopara TEM
Grade TEMEMCNBZ10024apara TEM
Espectrômetro UV-VISLeageneDZ0035de transmissão
TEM
JEOLJEM-100CXIIpara analisador de tamanho de partícula
Reagente BCA AThermo Fisher Scientific23228para ensaio
BCA Reagente BCA BThermo Fisher Scientific23224para ensaio BCA
Placas de 96 poçosCorning3599para BCA leitor
de placasThermo Fisher ScientificMultiskan™ GOpara ensaio BCA
Placas de 12 poçosCorning3513para cultura de células
JEG3 célulaBanco de células da Academia Chinesa de CiênciasTCHu195Planeta humana
DMEM / F12HycloneSH30272.01fenol sem vermelho
Soro bovino fetal (FBS)GIBCO10100para cultura de células
Penicilina / estreptomicinaGIBCO15070063para cultura celular
Microscópio de fluorescênciaOLYMPUSCKK53para captação celular
ParaformaldeídoShanghai Lingfeng1372021para captação celular
DAPISangon BiotechA606584para captação celular
Meio de montagemVidaútil P36961para captação celular
fosfotúngstico para microscópio eletrônico de ensaio

Referências

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