Artigo de método

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

DOI:

10.3791/58210

⸱

20 de setembro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

Neste artigo

Resumo

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Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.

Resumo

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Orientação de intestino de células do sistema imunológico é importante para a patogênese de doenças inflamatória intestinal (IBD). Aderência de célula dependente de integrinas para addressins é um passo crucial neste processo e interferir com a adesão de estratégias terapêuticas foram estabelecidas com sucesso. O anticorpo anti-α4β7 de integrina, vedolizumab, é usado para o tratamento clínico da doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC) e mais compostos são propensos a seguir.

Os detalhes do processo de adesão e os mecanismos de ação dos anticorpos anti-integrina não são ainda claras em muitos aspectos, devido às limitadas técnicas disponíveis para a pesquisa funcional neste campo.

Aqui, apresentamos um ensaio dinâmico de adesão para a análise funcional da aderência de célula humana sob condições de fluxo e o impacto das terapias anti-integrina no contexto do IBD. Ele se baseia a perfusão de células humanas primárias através de capilares de vidro ultrafinos morada revestido com análise microscópica em tempo real. O ensaio oferece uma variedade de oportunidades de melhorias e modificações e detém potenciais para descobertas mecanicistas e aplicações translacionais.

Introdução

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Movimento de célula é um processo bem regulamentada área indispensável para o desenvolvimento e a função dos organismos multicelulares, mas também está implicado na patogênese de uma infinidade de doenças1. Recentemente, o processo de localização de células do sistema imunológico do fluxo de sangue para os tecidos periféricos ganhou a atenção crescente, uma vez que contribui para a reposição e expansão de células patogênicas em tecidos inflamados em doenças imunologicamente mediadas2 ,3. Em particular, homing foi mostrado para ter relevância translacional em doenças inflamatória intestinal (IBD). A terapêutica anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferir com orientação de intestino tem demonstrado eficácia em ensaios clínicos grande4,5 e tem sido utilizado com sucesso na prática clínica do mundo real6,7 , 8. outras compostos são propensos a seguir9,10. Da mesma forma, o anticorpo de integrina terapêutica anti-α4, natalizumab, é usado para o tratamento da esclerose múltipla (em)11.

No entanto, nossa compreensão funcional do processo de sinalização em geral e o mecanismo de ação de tais anticorpos terapêuticos em particular ainda é limitada. Está bem estabelecido que a orientação consiste de várias etapas, incluindo a célula tethering e rolando com aderência de célula subsequente levando a prisão firme, seguido por trans endoteliais migração12,13. Os anticorpos acima mencionados neutralizam integrinas na superfície das células, impedindo a interação com addressins no endotélio da parede do vaso. Isto é pensado para impedir a aderência de célula firme14,15. Ainda, estamos apenas começando a entender a relevância diferencial das integrinas específicas para orientação de célula de subconjuntos distintos de célula. Além disso, os efeitos dos anticorpos anti-integrina em diferentes subconjuntos de células e associações de dose-resposta são em grande parte desconhecidas, levando a muitas questões no campo das terapias de localizador e antiaderência de intestino no IBD.

Portanto, ferramentas convenientes para abordar tais questões são desesperadamente necessários. O efeito dos anticorpos anti-integrina na interação integrina-morada predominantemente até agora tem sido avaliado por avaliar a inibição da eficácia/vinculação vinculação com citometria de fluxo ou através de de16,de ensaios de adesão estática17 ,19,18,20, assim, com a aparente simplificação e desvio da situação fisiológica. Recentemente estabelecemos um ensaio de adesão dinâmico para estudar dependente de integrinas adesão de células humanas para addressins e os efeitos dos anticorpos anti-integrina sob tensão de cisalhamento2. O princípio da técnica anteriormente foi demonstrado com rato células21,22. Aqui, foi adaptado e desenvolvido para abordar as questões acima mencionadas translacionais, abertura de avenidas romance para melhor compreender os mecanismos da terapia com anti-integrina anticorpos na vivo.

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Protocolo

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Os estudos descritos nas seções a seguir foram realizados de acordo com a aprovação do Comitê de ética da Universidade Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.

1. preparação dos capilares

  1. Conecte retangulares capilares para o tubo de borracha esticando a tubagem de um lado com uma pequena tesoura e cuidadosamente, inserindo o capilar (cerca de 0,5 cm) no tubo. Feche a conexão entre o capilar e tubo com filme plástico de parafina.
  2. Revestir o capilar com 20 µ l de morada (recombinante Quimera Fc; 5 µ g/mL, morada, por exemplo, MAdCAM-1, no buffer de revestimento (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) ou a solução de controle do isotipo apropriado usando uma pipeta de p20 (fluido irá mergulhar em si do capilar). Em seguida, selar o lado não conectado para o tubo com o filme plástico da parafina e incubar durante pelo menos 1 h a 37 ° C. Use um capilar preenchido apenas com o buffer de revestimento ou com o controle adequado do isotipo como controlo negativo.
  3. Retire a película de plástico da parafina da ponta do capilar, esvazie o revestimento, deixando o banho líquido fora do capilar em um papel toalha e bloquear os capilares pelo menos 1 h com 20 µ l de bloqueio solução (1X PBS com 5% BSA) a 37 ° C. Feche o lado aberto do capilar com filme plástico de parafina. Não remova a solução de bloqueio antes de prosseguir para microscopia.

2. cela de isolamento, tratamento e preparação para a microscopia

Nota: Estas etapas podem ser executadas durante a incubação os períodos necessários para a preparação capilar.

  1. Recolher 18 mL de sangue total humano anticoagulados com uma coleção de sangue asséptico da Veia cubital do voluntariado de pessoas (por exemplo, os pacientes de DII e/ou controles saudáveis) após consentimento informado de acordo com os regulamentos do local Comitê de ética.
    Nota: Este passo só deve ser realizado por pessoal médico treinado e experiente, de acordo com normas nacionais e/ou locais.
  2. Encher o sangue em um tubo de 50 mL e diluir para um volume de 35 mL com PBS 1x. Então subjacência da mistura de sangue-PBS com 10 mL de meio de gradiente de densidade.
  3. Realize a centrifugação gradiente de densidade por 15 min a 800 x g e 24 ° C sem freio para celas separadas.
  4. Colete as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) aspirando a camada de células brancas em cima da camada média densidade de gradiente (camada clara média). PBMC de transferência em um tubo 50 mL, enchem a 50 mL de 1X PBS e centrifugar durante 10 minutos a 300 x g e 10 ° C.
  5. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de 1X PBS posteriormente contar números de telemóvel, por exemplo, usando uma célula de Neubauer, contando com a câmara.
  6. Opcional: Para estudar a aderência dos granulócitos executar o procedimento a seguir. Caso contrário, prossiga com a etapa 2.7 ou 2.8.
    1. Recolha a camada de colônias de granulócitos (bottommost camada após centrifugação gradiente de densidade que contém também as hemácias). Ressuspender as células em 40 mL de 1X PBS. Em seguida, adicionar 8 mL de 6% Dextran em PBS 1x, misture delicadamente e deixe o sedimento de células durante 30 min à temperatura ambiente.
      Nota: As hemácias vão afundar até o fundo do tubo, enquanto os granulócitos vão ficar em suspensão.
    2. Depois de 30 min, recolher o sobrenadante, transferir para um tubo de 50ml fresco e centrifugar para 6 min a 300 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e lisar as hemácias restantes pela adição de 5 mL de 0,2% NaCl em ddH2O. Incubar durante 1 min.
    3. Adicionar 5 mL de 1,4% NaCl em ddH2O e incube por mais um minuto. Pare a Lise hipotónica adicionando 20 mL de 1X PBS e centrifugar para 6 min a 300 x g e 4 ° C.
    4. Ressuspender as células em 10 mL de 1X PBS. Em seguida, conte números de celular usando uma célula de Neubauer, contando com a câmara.
  7. Opcional: Para estudar a aderência dos subconjuntos PBMC, purificar diferentes tipos de células ou subconjuntos (por exemplo, CD4+ e CD8+ T células ou CD19+ B células) usando microbeads de acordo com o protocolo do fabricante ou por fluorescência-ativado célula de triagem (FACS). Caso contrário, prossiga com a etapa 2.8.
  8. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 300 x g e 10 ° C. Desprezar o sobrenadante e mancha as células com celular rastreamento corante (por exemplo, CFSE) de acordo com as instruções do fabricante.
  9. Posteriormente, Centrifugar as células durante 10 minutos a 300 x ge descartar o sobrenadante. Resuspenda em 1X PBS, determinar o número de telemóvel e centrifugar novamente por 10 min a 300 x g.
  10. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o células manchadas em quantidade adequada de buffer de adesão (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obter uma suspensão de 1,5 x 106 células/mL. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de MnCl2 para obter uma concentração final de 1 mM a 100 mM.
    Nota: Estas células estão agora prontas para microscopia.
  11. Opcional: Tratar as células com citocinas, neutralizando anticorpos ou outros compostos. Caso contrário, proceda com o passo 3.
    1. Pular a etapa 2.10 e resuspenda o pellet de células coradas da etapa 2.9 em meio RPMI (com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina) para obter uma concentração de 1,5 x 106 células/mL.
    2. Pipete 1 mL da suspensão celular para tantos poços de uma placa de 48-bem como há condições para ser analisado. Sempre prepare um poço com células não tratadas para ser perfundidos através de um capilar não revestido como controle negativo e um poço com células não tratadas para ser perfundidos através de um capilar morada revestido como controle positivo.
    3. Para o tratamento com anticorpos anti-integrina, adicione a quantidade apropriada de anticorpo (por exemplo, 10 µ g/mL vedolizumab) para a suspensão de eritrócitos. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Para tratamento com citocinas, adicione a quantidade apropriada de citocinas recombinantes (por exemplo, 10 ng/mL CXCL10) para a suspensão de eritrócitos. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
    4. Após a incubação, colha células por resuspending células várias vezes usando uma pipeta p1000. Transferência de células para um tubo de 2 mL, lave bem novamente com 1 mL de 1X PBS e adicionar ao tubo de 2 mL. Determine o número de células.
      Nota: Incubação de populações de células aderentes (por exemplo, monócitos) pode exigir medidas adicionais (ex., tratamento com tripsina) para separar as células da placa.
  12. Células de centrifugar durante 10 minutos a 300 x g a 10 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em quantidade adequada de buffer de adesão para obter uma suspensão de 1,5 x 106 células/mL. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de MnCl2 para obter uma concentração final de 1 mM a 100 mM. Quando pretreating com quimiocinas não adicione MnCl2 à suspensão de células. Estas células estão agora prontas para microscopia.
    Nota: O volume mínimo utilizado para o ensaio é dependente da bomba e a tubulação usada. Neste estudo, utilizando a bomba peristáltica e o tubo especificado na Tabela de materiais, foi necessário um volume mínimo de 400 µ l. Se desejado e aplicável (dependendo do tipo de célula e rendimento), a concentração de células em suspensão pode ser aumentada para medir a aderência superior em um período mais curto de tempo.
  13. Modificação de potencial: ensaio de adesão dinâmica competitiva
    1. Execute as etapas supracitadas, com populações de células diferentes para ser comparado com os outros (por exemplo, regulamentar e células efetoras T isoladas por meio de isolamento magnético do grânulo, seguindo as instruções do fabricante como por passo 2.7).
    2. Mancha de cada população com um corante diferente (por exemplo, CFSE e FarRed) como descrito nos passos 2,8-2,9 para ser capaz de diferenciar populações de células durante a microscopia.
    3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de células coradas em quantidade adequada de buffer de adesão (150 mM NaCl 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obter uma suspensão de 1,5 x 106 células/mL.
    4. Misturar volumes iguais das suspensões celulares (por exemplo, 500 µ l de pilhas de T reguladoras) e 500 µ l de células efetoras T obter um final misturado a concentração celular de 1,5 x 106 células/mL. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de MnCl2 para obter uma concentração final de 1 mM a 100 mM. Tais suspensões subsequentemente podem ser usadas para análise competitiva do processo de adesão por perfusing populações de células diferentes através do mesmo capilar.

3. imagem latente da pilha de adesão dinâmica ao vivo

  1. Ligue o microscópio e selecione o filtro apropriado ou laser para excitar a célula dye(s) (por exemplo, 488 nm laser para CFSE), um objectivo adequado (por exemplo, 40 X) e imagens de lapso de tempo permitindo uma aquisição modo de rastreamento.
  2. Retire a película de plástico da parafina da ponta do capilar e conectar o capilar com um pedaço curto de tubo (aproximadamente 5 cm de comprimento), estendendo-se a tubagem de um lado com uma pequena tesoura e cuidadosamente inserindo o capilar (cerca de 0,5 cm) dentro do tubo. Feche a conexão entre o capilar e o tubo com o filme plástico de parafina.
  3. Montar o capilar em uma bandeja de fixação (por exemplo, a tampa de uma placa com um corta-circuito retangular ligeiramente menor do que o comprimento do capilar de 6) e coloque o capilar fixo no suporte da bandeja do microscópio, para que o capilar em foco e pronto para a microscopia.
  4. Insira o tubo de borracha no entalhe correspondente da bomba peristáltica e coloque a extremidade não anexada para o capilar no tubo de amostra de acordo com contendo a suspensão de eritrócitos. Inserir um tubo de 15 mL para coletar o fluxo através do tubo curto do outro lado do capilar.
  5. Deixe-o preenchimento da tubulação com uma vazão de 500 µ l por minuto até a suspensão de células quase atinge o capilar. Então deixe o preenchimento capilar com um caudal de 100 µ l/min.
    Nota: Um rápido enchimento do capilar assegura uma distribuição regular da suspensão celular dentro do capilar.
  6. Quando o capilar é preenchido com a suspensão de eritrócitos, ajuste a taxa de fluxo de 10 µ l/min.
    Nota: Estas taxas de fluxo podem variar, quando os capilares de um tamanho diferente ou diferentes bombas peristálticas são usados. Neste estudo, a taxa de fluxo de 10 µ l/min foi otimizada para a bomba e capilares para imitar o fluxo de sangue na vivo .
  7. Capturar imagens de lapso de tempo das células movendo-se lentamente através do capilar ao longo da morada revestido no interior da parede cada 2 s para um total de 3 min.
    Nota: Intervalos e tempo total podem variar dependendo do tipo de célula e pergunta a ser dirigida.
  8. Antes de eliminar o capilar, tela inteiro capilar através da peça de olho do microscópio para certificar-se que a seção mostrada no vídeo é representante. Se necessário, fazer uma segunda gravação.
  9. Livre da tubulação da bomba e deixe o líquido restante correr de volta para o tubo de 2 mL, em seguida, desligue o capilar e tubos da bandeja de fixação e continuar com o próxima capilar.

4. a avaliação e contagem de células

  1. Abra a sequência lapso de tempo com o software adequado e exportar as três primeiras imagens ("início") e as três últimas imagens ("End") como arquivos Tiff.
  2. Abra as três imagens de "Começo" no ImageJ, converter para 32 bits ('imagem | Tipo | 32 bits ') e Mesclar fotos (' imagem | Cor | Mesclagem de canais; Atribua as cores vermelhas, verdes e azuis para as fotos diferentes). Converter imagem composta em RGB (' imagem | Type-RGB') e salve como um arquivo Tiff. Repita com as imagens de "Fim".
    Nota: Em ensaios de aderência dinâmica competitiva com células coradas com cores diferentes, primeiro dividi os canais das imagens para analisar a adesão das populações celulares diferentes separadamente.
  3. Contar as células brancas visíveis no "Início" e "End" composto e subtrair o número de células brancas no "Princípio" de células brancas no "Final".
    Nota: A diferença representa o número de recém aderindo células no intervalo de tempo de 3 min. Na imagem composta, células que moveu são visíveis na cor específica que foi atribuído ao respectivo quadro, desde que eles localizar em outro lugar no quadro anterior e seguinte. Para as células que são aderentes, os sinais de vermelhos, verdes e azuis na mesma sobreposição lugar ao branco.
  4. Para visualizar melhor os resultados, compile um vídeo das sequências de lapso de tempo, por exemplo, usando o ImageJ.

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Resultados

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O método apresentado neste manuscrito visa simular o processo in vivo da aderência de célula humana à parede endotelial quanto possível para funcionalmente avaliar aderência de célula e o papel dos anticorpos interferentes. Portanto, capilares ultrafinos são revestidos com addressins e pintados com fluorescente etiquetadas células humanas de interesse usando uma bomba de perfusão. Usando a célula viva, a adesão de células humanas para a addressins de imagem pode ser observado em ...

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Discussão

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O protocolo acima descreve uma técnica útil para estudar a dinâmica adesão das células do sistema imunológico humanas para ligantes endoteliais. Através da variação dos ligantes revestidos, tipos de células perfundidos ou subconjuntos, incubação com estímulos adicionais ou diferentes anticorpos neutralizantes, que tem quase ilimitada de aplicações potenciais. Portanto, tais ensaios dinâmicos de adesão podem ser útil para responder a ambas as questões fundamentais da pesquisa básica, bem como consultas de translação que p...

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Divulgações

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M.F.N. serviu como um conselheiro para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. M.F.N. e S.Z. receberam apoio à pesquisa de Takeda e Roche.

Agradecimentos

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A pesquisa de CN, IA, MFN e SZ foi apoiada pelo centro interdisciplinar para pesquisa clínica (IZKF) e o programa ELAN da Universidade de Erlangen-Nuremberga, a outra Kröner-Fresenius-Stiftung, o Fritz-Bender-Stiftung, o alemão de Crohn e Colite Foundation (DCCV), a CEDER de grupo investigação clínica do Conselho alemão de pesquisa (DFG), DFG tópico programa de Microbiota, a iniciativa de campo emergente e a DFG Collaborative Research centros 643, 796 e 1181.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 48 poçosSarstedt833.923
Tampão de adesão: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2Solução de
bloqueio: 1x PBS em ddH2O + 5% de
(BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
Capilares: Tubo Boro Retangular 0.20 mm x 2.00 mm ID, comprimento de 50 mmCM Scientific3520-050
CCL-2, Immunotools humanos11343384
CD4-Microesferas, humanosMiltenyi Biotec130-045-101
CellTrace™ Kit de Proliferação Celular CFSECentrífuga ThermoFischer ScientificC34554
(Rotixa 50 RS)Tampão de revestimento Hettrich
: 150 mM NaCl + 1 mM Microscópio Confocal HEPES
(TCS SP8)Leica
CXCL-10, ferramentas imunológicas humanas11343884
Dextran 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL MonovetteSarstedt
Falcons (50 mL)Sarstedt62.547.004
Fc controle de isotipo de quimeraR& D Systems110-HG
Bomba peristáltica de vazões (LabV1)Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPESVWRJ848-100ML
Controle de isotipo de IgG humanaThermoFischer Scientific31154
Molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) Fc quimeraR& D Systems720-IC-050
LS-ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
controle de isotipo IgG de camundongoMiltenyi Biotec130-106-545
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc quimeraR& D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer Câmara de contagemRothT729.1
Pancoll, humanoPAN BiotechP04-601000
Phosphate Buffered Saline (PBS) BiochromL 182-10sem Mg e Ca
Filme plástico de parafina: Parafilm (PM-996)VWR52858-000
purificado anti-humano CD18Biolegend302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
Tubo de borracha: SC0059T Tubo LMT-55 de 3 pontos, 1,02 mm de diâmetro, 406,4 mm de comprimentoIsmatecSC0059
Pipetas sorológicasSarstedt861,254,025
Azul de tripanoRothCN76.1
Molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1) Quimera FcBiolegend553706
Vedolizumabe (Entyvio)Takeda
albumina de soro bovino BSA

Referências

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