Artigo de método

Visualizando o colapso do Cone de crescimento Axonal e primeiros efeitos β amiloide nos neurônios cultivados Mouse

DOI:

10.3791/58229

⸱

30 de outubro de 2018

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresenta-se um protocolo para investigar os efeitos iniciais da amiloide-β (Aβ) no cérebro. Isto mostra que Aβ induz endocitose mediada por Clatrina e colapso dos cones de crescimento axonal. O protocolo é útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ em cones de crescimento axonal e pode facilitar a prevenção da doença de Alzheimer.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloide-β (Aβ) provoca deficiências de memória na doença de Alzheimer (AD). Apesar de terapêutica foram mostrados para reduzir os níveis Aβ no cérebro de pacientes, estas não melhorar as funções de memória. Desde Aβ agrega no cérebro antes do aparecimento de perturbações de memória, alvejando Aβ pode ser ineficiente no tratamento de pacientes que já apresentam défices de memória. Portanto, sinalizando a jusante devido à deposição de Aβ deve ser bloqueado antes do desenvolvimento da AD. Aβ induz a degeneração axonal, levando ao rompimento de redes neuronais e deficiências de memória. Embora existam muitos estudos sobre os mecanismos de toxicidade Aβ, a fonte de toxicidade Aβ permanece desconhecida. Para ajudar a identificar a fonte, propomos um novo protocolo que usa microscopia, transfecção do gene e célula viva de imagem para investigar mudanças adiantadas causadas por Aβ em cones de crescimento axonal de neurônios cultivados. Este protocolo revelou que Aβ induzida por endocitose mediada por Clatrina em cones de crescimento axonal, seguido pelo colapso do cone de crescimento, demonstrando que a inibição da endocitose impede que a toxicidade Aβ. O presente protocolo será útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ e pode levar a um tratamento mais eficiente e preventivo AD.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depósitos de amiloide-β (Aβ) são encontrados no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer (AD) e são considerados uma causa fundamental de AD1 que disrupt redes neuronais, levando a deficiências de memória2,3,4. Muitos candidatos clínico foram mostrados para prevenir eficazmente a produção amiloide-β (Aβ) ou remover os depósitos Aβ. No entanto, ninguém conseguiu na melhoria da função de memória em pacientes de AD5. Aβ já é depositado no cérebro antes do início da deficiência de memória6; Portanto, diminuindo os níveis Aβ nos cérebros de pacientes exibem deficiência de memória pode ser ineficaz. Deposição de aβ está presente em pacientes pré-clínicos de AD; no entanto, estes pacientes raramente apresentam com neuronal défices degeneração e memória6. Há um desfasamento entre a deposição de Aβ e deficiências de memória. Portanto, uma estratégia fundamental para a prevenção do anúncio está bloqueando a toxicidade Aβ sinalização durante os estágios iniciais do anúncio, antes do desenvolvimento dos défices de memória. Deposição de aβ induz axônio degeneração7,8,9,10,11,12,13, que pode levar a uma ruptura do redes neurais e comprometimento permanente da função de memória. Muitos estudos têm investigado os mecanismos de toxicidade Aβ; por exemplo, os axônios degenerados dos cérebros de ratos de AD foram mostrados para ter aumentado de autofagia14. Ativação de calcineurina tem sido relatada como um possível mecanismo de degeneração axonal induzida por Aβ15; no entanto, o gatilho directo de degeneração axonal permanece desconhecido.

Este estudo enfoca o colapso do axonal terminações chamadas de cones de crescimento. O colapso dos cones de crescimento axonal pode ser causado por repelentes de crescimento axonal, tais como semaforina-3A e ephrin-A516,17,18,19,20. Colapso-como distróficos axonal finais foram observadas no cérebro de pacientes de AD21,22. Além disso, uma falha de funcionamento de cone de crescimento pode provocar degeneração axonal23. No entanto, é desconhecido se Aβ induz o colapso do cone de crescimento. Portanto, este estudo apresenta um novo protocolo para observar os primeiros efeitos de Aβ nos neurônios cultivados e investigar o colapso do cone de crescimento induzido por Aβ.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório no Campus da Universidade de Toyama Sugitani e foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal e uso de animais de laboratório no Campus da Sugitani o Universidade de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. colapso ensaio

  1. Revestimento de poli-D-lisina
    1. Casaco slides de cultura 8 poços com 400 μL de 5 μg/mL poli-D-lisina (PDL) em tampão fosfato salino (PBS) e incube-os a 37 ° C durante a noite.
    2. Remover a solução PDL e lavar os poços 3 vezes com água destilada.
  2. Neurônio cultura24
    1. Mince recém isoladas córtices cerebral de embrionárias dia 14 (E14) ddY os ratos com micro-tesouras em meio de cultura de neurônio que contém 12% de soro de cavalo, 0,6% de glicose e 2 mM L-glutamina (meio A). Não adicione antibióticos.
      Nota: No presente protocolo, o papá rato é usado. Esta é uma tensão outbred comumente usada no Japão. Este protocolo de cultura de neurônio pode ser também aplicado para rato neurônios corticais7,25.
    2. Centrifugue os tecidos a 87 x g, durante 3 min.
    3. Remova o sobrenadante. Em seguida ao pellet, adicionar 2 mL de tripsina 0,05% e incube por 15 min a 37° C. Misture, tocando a cada 5 min.
    4. Adicione 4 mL de A médio e a mistura batendo.
    5. Centrifugue os tecidos a 178 x g, durante 3 min.
    6. Remover o sobrenadante e incube-os tecidos com 600 U/mL DNase I e inibidor de tripsina de soja de 0,3 mg/mL dissolvidos em PBS por 15 min a 37 ° C. Misture, tocando a cada 5 min.
    7. Após a incubação, adicione 4 mL de A médio e a mistura batendo.
    8. Centrifugue os tecidos a 178 x g, durante 3 min.
    9. Depois de retirar o sobrenadante, adicionar 4 mL de meio A e triture os tecidos com uma pipeta Pasteur polido.
    10. Filtre os tecidos triturados com uma malha de tamanho de poro de 70 µm. Após filtração, calcule a densidade de células com um hemocytometer.
    11. Cultura das células em cultura 8 poços deslize em 0,8 x 104 células/poço com médio A e mantêm-los numa incubadora de CO2 com um ambiente umidificado de 10% CO2 a 37 ° C.
    12. Após 4h de cultivo, substitua o meio de cultura para um suplemento contendo de 2% para cultura neuronal, 0,6% de glicose e 2 mM L-glutamina (médio B).
      Nota: A pureza dos neurônios foi aproximadamente 75%, conforme descrito anteriormente,26.
  3. Colapso do ensaio27
    1. Dissolver obtidos comercialmente completos amiloide β1-42 (Aβ1-42) em água destilada a uma concentração de 0,5 mM e incubar a 37 ° C por 7 dias. Após a incubação, armazene a solução Aβ1-42 agregada em um freezer-30 ° C até o uso.
      Nota: Esta incubação é necessária para agregação e toxicidade de Aβ27,28,29,30.
    2. Após 4 dias de cultura neuronal, tratar os poços com 100 μL de Nova B média, contendo 0,5 μM agregados solução Aβ1-42 ou veículo (água destilada) por 1h.
      Nota: Efeitos de Aβ1-42 foram dose-dependente aumentou de 0,1 a 5 μM e atingiu um pico de 0.5 μM, conforme descrito anteriormente,27. Resultados semelhantes podem ser observados quando por Aβ1-42 tratamento por 1h após 3 dias de cultura neuronal31.
    3. Remover o meio de cultura e corrigir imediatamente os neurônios com paraformaldeído 4% com 4% de sacarose em PBS durante 1 h a 37 ° C em uma chapa quente.
    4. Após a fixação, lave os neurônios 3 vezes com PBS e montá-los com um meio de montagem aquoso. Seca o meio de montagem a 4 ° C por 2 – 4 dias.
    5. Capture toda a área (7,8 x 9 mm2) de cada poço com uma 20 X seco lente objetiva em um microscópio invertido.
    6. Classifica os neuritos mais longos de cada neurônio no estágio 3 ou 4 como axônios, como descrito anteriormente,32,33.
    7. Classificar os cones de crescimento, de acordo com os seguintes critérios: cones de crescimento 1) axonal falta lamellipodia ou 2) possuindo menos de três filopodia são considerados recolhido cones de crescimento, conforme descrito anteriormente,17.
      Nota: Cones de crescimento saudável são marcados como 0 ponto; cones de crescimento recolhido são marcados como 1 ponto. Quer dizer colapso escores são calculados para cada tratamento.

2. amiloide β imunocoloração

  1. Neurônios corticais rato de cultura por 3 dias, conforme descrito na etapa 1.2.
  2. Tratar com agregados Aβ1-42 (5 μM) ou veículo por 4 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 .
  3. Sem retirar o meio, adicionar um volume igual de paraformaldeído 4% com 4% de sacarose em PBS a cada poço e manter a cultura a 37 ° C em uma chapa quente por 5 min.
  4. Substitua a solução 400 μL de paraformaldeído 4% com 4% de sacarose em PBS e manter a 37 ° C, o prato quente por 1h. Este protocolo de fixação foi modificado de um anterior relatório34.
  5. Lave os neurônios 3 vezes com PBS.
  6. Bloco com 5% de soro de cabra normal em PBS.
  7. Incube os neurônios com imunoglobulina antiamilóide β de rato G (IgG) (01:50) e 1% albumina de soro bovino em PBS a 4 ° C durante a noite.
  8. Lave os neurônios 3 vezes com PBS.
  9. Incube os neurônios com um anticorpo secundário conjugado fluorescência (1: 400) e 1% albumina de soro bovino em PBS em temperatura ambiente por 2 h.
  10. Lave os neurônios 3 vezes com PBS e montá-los com um meio de montagem aquoso.
  11. Capturar imagens de fluorescência e campo claro com iluminação oblíqua usando uma lente objetiva seco X 40 em microscópio invertido B.

3. axonal Immunostaining27

  1. Lave os neurônios 3 vezes com PBS após a fixação do neurônio culta, conforme descrito na etapa 1.3.3.
  2. Incubar os neurônios com rato anti tau-1 IgG (1: 500), proteína associada de coelho anti-microtubule 2 (MAP2) (1: 500) de IgG no soro de cabra normal de 5% e 0,3% t- octylphenoxypoly-etoxietanol em PBS a 4 ° C durante a noite.
  3. Lave os neurônios 3 vezes com PBS.
  4. Incube os neurônios com anticorpos secundarios conjugados a fluorescência (1: 400) e 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol, em PBS em temperatura ambiente por 2 h.
  5. Lave os neurônios 3 vezes com PBS e montagem utilizando um meio de montagem aquoso.
  6. Capturar imagens de contraste (DIC) de interferência de fluorescência e diferencial usando uma lente objetiva seca de 20 × no microscópio invertido A.

4. célula de imagem27 ao vivo

  1. Revestimento de pratos à base de vidro com 500 μL de PDL (5 μg/mL), conforme descrito na etapa 1.1.1.
    Nota: No presente protocolo, foram utilizados pratos caseiros à base de vidro. Comercialmente disponíveis pratos à base de vidro também podem ser usados para a geração de imagens ao vivo. Pratos caseiros à base de vidro foram preparados como segue: 1) fazer um buraco de aproximadamente 1,4 mm de diâmetro no centro de um prato de 35 mm com um soco da mão e 2) anexar uma lamela de vidro (diâmetro de 22 mm) na parte de trás do prato com silicone.
  2. Lavar as placas com água destilada, conforme descrito na etapa 1.1.2 e cultura os neurônios corticais no prato com base em vidro em 3 x 104 células/prato com A média, como descrito na etapa 1.2.
  3. Após 4 dias de cultura de células, substitua o meio com 2 mL de meio novo B e transferência o prato para microscópio invertido r. Maintain a cultura em um ambiente umidificado de 10% CO2 a 37 ° C.

5. endocitose experimento

  1. Cultura os neurônios corticais do mouse, conforme descrito na etapa 1.2.
  2. Quatro dias depois, substitua o medium com 100 μL de novo meio B contendo 20 sonda de membrana de fluorescência μM por 1 min.
  3. Adicione 1 μL de 0.05 mM agregados Aβ1-42 (final 0,5 μM) ou solução de veículo (água destilada) e misture por pipetagem. Incube durante 20 min.
  4. Remover o meio e lavar os poços duas vezes com médio B que tenha sido previamente aquecido a 37 ° C.
  5. Corrigir, lavar e montar os neurônios conforme descrito nas etapas 1.3.3 e 1.3.4.
  6. Capturar o fluorescente e DIC imagens com um 63 X lente objetiva de óleo no microscópio invertido A.
  7. Quantificar a densidade da área de sonda-positivo da membrana de fluorescência em cada cone de crescimento saudável, usando um software de imagem.

6. Gene Transfection

  1. Prepare os neurônios corticais conforme descrito na etapa 1.2. Depois de concluir as etapas 1.2.1 para 1.2.10, centrifugue os neurônios a 178 x g, durante 3 min.
  2. Retire o sobrenadante, adicione 4 mL de Ca2 +-gratuito e Mg2 +-livre solução salina equilibrada de Hanks (CMF-HBSS) e misture por pipetagem.
  3. Centrifugar as células a 178 x g, durante 3 min.
  4. Remover o sobrenadante, adicione 4 mL de CMF-HBSS e misture por pipetagem. Em seguida, calcule a densidade de células, conforme descrito na etapa 1.2.10.
  5. Transferi 5 x 106 células para um tubo de 1,5 mL e centrifugar 1.677 x g por 1 min.
  6. Remover o sobrenadante, adicionar 100 μL de solução de transfecção com suplemento e 3 μg de Plasmideo DNA codificação EGFP ou EGFP-AP180 C-terminal e misture por pipetagem.
  7. Transferir a solução acima (passo 6.6) para uma cubeta certificada e transfect com um electroporator, de acordo com o protocolo do fabricante.
  8. Imediatamente após a transfeccao, adicionar 500 μL de médio A para a cubeta e transferir a solução para um tubo de 1,5 mL com uma pipeta certificada. Em seguida, calcule a densidade de células, conforme descrito na etapa 1.2.10.
  9. Cultura de células em um slide de cultura 8 poços em 0,8 x 104 células/poço, conforme descrito nas etapas 1.2.11 e 1.2.12.
  10. Após 4 dias de cultura celular, realizar um ensaio de colapso, conforme descrito na etapa 1.3.

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Resultados

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Neste protocolo, Aβ1-42 foi incubada a 37 ° C por 7 dias antes do uso, porque a incubação de Aβ1-42 era necessária para a produção de formas tóxicas27,28,30,35. Após esta incubação, formas agregadas de Aβ foram observadas (figura 1A). Tem sido relatado que a incubação semelhante de Aβ1-42 produzido forma fibrila de Aβ

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Discussão

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O protocolo descrito neste estudo permitiu a observação de fenômenos precoce em cones de crescimento axonal após tratamento Aβ1-42. Aβ1-42 induzida por endocitose em cones de crescimento axonal dentro de 20 min, e colapso do cone de crescimento foi observado dentro de 1 h de tratamento. Esta endocitose era provavelmente mediada por Clatrina. Usando este protocolo, a inibição de endocitose mediada por Clatrina foi confirmada para evitar o colapso do cone de crescimento Aβ1-42-induzido e degeneração axonal em neurônios cul...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O autor não tem nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsas de investigação de JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japão, Takeda Science Foundation, Japão e Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos ddYSLC
Lâmina de cultura de oito poçosFalcon354108
poli D lisinaWako168-19041
Meio de cultura, meio neurobasalGibco21103-049
soro domésticoGibco26050-088
glicoseWako049-31165
L-glutaminaWako074-00522
0,05% tripsinaGibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
inibidor de tripsina de sojaGibco17075-029
Filtro com 70 µ m tamanho da malha, filtro de célulasFalcon352350
B-27 suplementoGibco17504-044
CO2 incubadoraAstecSCA-165DS
Amilóide β 1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldeídoWako162-16065
sacarose Wako196-00015
Meio de montagem aquoso, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Microscópio invertido ACarl ZeissAxio Observer Z1 Conectado com AxioCam MRm, Unidade de Aquecimento XL S, Módulo de CO2 S1 e TempModule S1
Plano Objetivo-Apocromático 20xCarl Zeiss420650-9901
Plano Objetivo-Apocromático 63xCarl Zeiss440762-9904
Objetivo, Plano CFI Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anti-amilóide β anticorpoIBL10379clone 11A1
soro de cabra normalWako143-06561
albumina de soro bovinoWako010-25783
t-octilfenoxipolietoxietanolWako169-21105
cabra anti-rato IgG conjugado com AlexaFluor 594InvitrogenA11032
cabra anti-coelho IgG conjugado com AlexaFluor 488InvitrogenA11029
placa quenteNISSINNHP-M30N
tampa de vidroFisher Scientific12-545-85
prato de 35 mmIWAKI1000-035
Silicone RTVShin-EtsuKE42T
punção manualRoper WhitneyNo.
Sonda de membrana de fluorescência, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- e Mg2+-free Solução salina balanceada de HanksGibco14175-095
Solução de transfecção, Solução de nucleofectorLonzaVPG-1001
Electroporator, Nucleofector IAmaxa
Microscópio invertido BKeyenceBZ-X710
Software de imagem, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
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Referências

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