Visualizando o colapso do Cone de crescimento Axonal e primeiros efeitos β amiloide nos neurônios cultivados Mouse

Resumo

Aqui apresenta-se um protocolo para investigar os efeitos iniciais da amiloide-β (Aβ) no cérebro. Isto mostra que Aβ induz endocitose mediada por Clatrina e colapso dos cones de crescimento axonal. O protocolo é útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ em cones de crescimento axonal e pode facilitar a prevenção da doença de Alzheimer.

Resumo

Amiloide-β (Aβ) provoca deficiências de memória na doença de Alzheimer (AD). Apesar de terapêutica foram mostrados para reduzir os níveis Aβ no cérebro de pacientes, estas não melhorar as funções de memória. Desde Aβ agrega no cérebro antes do aparecimento de perturbações de memória, alvejando Aβ pode ser ineficiente no tratamento de pacientes que já apresentam défices de memória. Portanto, sinalizando a jusante devido à deposição de Aβ deve ser bloqueado antes do desenvolvimento da AD. Aβ induz a degeneração axonal, levando ao rompimento de redes neuronais e deficiências de memória. Embora existam muitos estudos sobre os mecanismos de toxicidade Aβ, a fonte de toxicidade Aβ permanece desconhecida. Para ajudar a identificar a fonte, propomos um novo protocolo que usa microscopia, transfecção do gene e célula viva de imagem para investigar mudanças adiantadas causadas por Aβ em cones de crescimento axonal de neurônios cultivados. Este protocolo revelou que Aβ induzida por endocitose mediada por Clatrina em cones de crescimento axonal, seguido pelo colapso do cone de crescimento, demonstrando que a inibição da endocitose impede que a toxicidade Aβ. O presente protocolo será útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ e pode levar a um tratamento mais eficiente e preventivo AD.

Introdução

Depósitos de amiloide-β (Aβ) são encontrados no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer (AD) e são considerados uma causa fundamental de AD¹ que disrupt redes neuronais, levando a deficiências de memória^2,3,4. Muitos candidatos clínico foram mostrados para prevenir eficazmente a produção amiloide-β (Aβ) ou remover os depósitos Aβ. No entanto, ninguém conseguiu na melhoria da função de memória em pacientes de AD⁵. Aβ já é depositado no cérebro antes do início da deficiência de memória⁶; Portanto, dimi....

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório no Campus da Universidade de Toyama Sugitani e foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal e uso de animais de laboratório no Campus da Sugitani o Universidade de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. colapso ensaio

1. Revestimento de poli-D-lisina
   1. Casaco slides de cultura 8 poços com 400 μL de 5 μg/mL poli-D-lisina (PDL) em tampão fosfato salino (PBS) e incube-os a 37 ° C durante a noite.
   2. Remover a solução PDL e lavar os poços 3 vezes com água destilada.
2. Neurônio cultura....

Resultados

Neste protocolo, Aβ1-42 foi incubada a 37 ° C por 7 dias antes do uso, porque a incubação de Aβ1-42 era necessária para a produção de formas tóxicas^27,28,30,35. Após esta incubação, formas agregadas de Aβ foram observadas (figura 1A). Tem sido relatado que a incubação semelhante de Aβ1-42 produzido forma fibrila de Aβ

Discussão

O protocolo descrito neste estudo permitiu a observação de fenômenos precoce em cones de crescimento axonal após tratamento Aβ1-42. Aβ1-42 induzida por endocitose em cones de crescimento axonal dentro de 20 min, e colapso do cone de crescimento foi observado dentro de 1 h de tratamento. Esta endocitose era provavelmente mediada por Clatrina. Usando este protocolo, a inibição de endocitose mediada por Clatrina foi confirmada para evitar o colapso do cone de crescimento Aβ1-42-induzido e degeneração axonal em neurônios cul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos ddY	SLC
Lâmina de cultura de oito poços	Falcon	354108
poli D lisina	Wako	168-19041
Meio de cultura, meio neurobasal	Gibco	21103-049
soro doméstico	Gibco	26050-088
glicose	Wako	049-31165
L-glutamina	Wako	074-00522
0,05% tripsina	Gibco	25300-054
DNase I	Worthington	DP
inibidor de tripsina de soja	Gibco	17075-029
Filtro com 70 µ m tamanho da malha, filtro de células	Falcon	352350
B-27 suplemento	Gibco	17504-044
CO2 incubadora	Astec	SCA-165DS
Amilóide β 1-42	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldeído	Wako	162-16065
sacarose	Wako	196-00015
Meio de montagem aquoso, Aqua-Poly/Mount	polysciences	18606-20
Microscópio invertido A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	Conectado com AxioCam MRm, Unidade de Aquecimento XL S, Módulo de CO2 S1 e TempModule S1
Plano Objetivo-Apocromático 20x	Carl Zeiss	420650-9901
Plano Objetivo-Apocromático 63x	Carl Zeiss	440762-9904
Objetivo, Plano CFI Apo Lambda 40X	Nikon
anti-MAP2 IgG	Abcam	ab32454
anti-tau-1 IgG	Chemicon	MAB3420
anti-amilóide β anticorpo	IBL	10379	clone 11A1
soro de cabra normal	Wako	143-06561
albumina de soro bovino	Wako	010-25783
t-octilfenoxipolietoxietanol	Wako	169-21105
cabra anti-rato IgG conjugado com AlexaFluor 594	Invitrogen	A11032
cabra anti-coelho IgG conjugado com AlexaFluor 488	Invitrogen	A11029
placa quente	NISSIN	NHP-M30N
tampa de vidro	Fisher Scientific	12-545-85
prato de 35 mm	IWAKI	1000-035
Silicone RTV	Shin-Etsu	KE42T
punção manual	Roper Whitney	No.
Sonda de membrana de fluorescência, FM1-43FX	Invitrogen	F35355
Ca2+- e Mg2+-free Solução salina balanceada de Hanks	Gibco	14175-095
Solução de transfecção, Solução de nucleofector	Lonza	VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I	Amaxa
Microscópio invertido B	Keyence	BZ-X710
Software de imagem, ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/

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