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Artigo de método

Geração de Homo - e Heterografts entre melancia e cabaça para o estudo de MicroRNAs frio-responsivo

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DOI:

10.3791/58242

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20 de novembro de 2018

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1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para eficientemente tornando homo - e heterografts entre melancia e cabaça, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados, para a investigação de microRNAs frio-responsivo.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt, conhecida por desempenhar um papel importante no desenvolvimento da planta e adaptação. Há uma acumular evidências mostrando que as expressões de determinados miRNAs são alteradas quando o enxerto, uma prática agrícola comumente utilizada pelos agricultores para melhorar a tolerância das culturas a estresses bióticos e abióticos. Cabaça é uma colheita inerentemente resistentes às alterações climáticas, em comparação com muitos outras abóboras grandes, incluindo melancia, tornando-o um dos porta-enxertos mais utilizados para o último. O recente avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento tem proporcionado grandes oportunidades para investigar os miRNAs frio-responsivo e suas contribuições para vantagens heterotópico; ainda, os procedimentos experimentais adequados são um pré-requisito para esta finalidade. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a geração eficiente de homo e heterografts entre o frio-suscetíveis de melancia e a cabaça tolerante ao frio, além de métodos de amostragem de tecido, geração de dados e análise de dados. Os métodos apresentados são também úteis para outros sistemas de planta-enxerto, para interrogar miRNA regulamentos sob vários estresses ambientais, tais como calor, seca e salinidade.

Introdução

Enxertia tempo foi empregado como uma técnica agrícola para melhorar a produção agrícola e tolerância a estresses bióticos e abióticos1,2,3. Em sistemas de heterografting, porta-enxertos elite podem aumentar a absorção de água e nutrientes das plantas, reforçar a resistência a patógenos de solo e limitar os efeitos negativos da toxicidade do metal4,5, que podem conferir os enxertos uma reforçada vigor de crescimento e maior tolerância a estresses ambientais. Em muitos casos, heterografting também pode afetar as qualidades de frutos em plantas hortícolas, levando ao sabor da fruta melhorada e maior conteúdo de compostos relacionados com a saúde6,7. Verificou-se que a transferência de longa distância de fitohormônios, RNAs, peptídeos e proteínas entre o porta-enxerto e o scion é um mecanismo fundamental de modulação do crescimento e desenvolvimento reprogramação de scion plantas8,9 ,10. Enxertia tem sido amplamente utilizada em estudos de longa distância de sinalização e transporte em relação à adaptação ambiental11. Experimentos de enxerto são especialmente poderosos para a deteção inequívoca de moléculas transmitidas em tecido ou seiva vascular e ativação ou supressão de alvos moleculares devido ao sinal de transmissão12a receber.

RNAs não-codificantes, uma grande classe de RNA que exercem funções reguladoras importantes nas células, têm sido relatados para desempenhar um papel em facilitar a adaptação da planta ao estresse abiótico13. os miRNAs são endógenos pequeno não-codificantes RNAs de cerca 20-24 nt. estudos revelaram o papel regulador dos miRNAs em vários aspectos das atividades da planta, tais como atirar em crescimento, lateral raiz formação14,15,16, absorção de nutrientes, metabolismo de sulfato e homeostase17e respostas bióticos e abióticos stress18. Recentemente, a expressão de miRNAs e seus genes-alvo foram relacionados com tolerância de estresse em mudas de pepino heterografted19de sal. Nos enxertos intervariety de uva, as respostas de miRNA expressão ao estresse de seca foram encontradas para ser dependente do genótipo20.

O desenvolvimento rápido e diminuindo o custo da tecnologia de sequenciamento do elevado-throughput forneceram uma grande oportunidade para o estudo dos regulamentos de miRNA em plantas agrárias. Melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), uma colheita importante Cucurbitácea crescido em todo o mundo, é suscetível a baixas temperaturas. Cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec.) é uma Cucurbitácea mais clima-resistente comumente usada pelos agricultores para enxertar com melancia. O objetivo principal do estudo atual é estabelecer um padrão, eficiente e um método conveniente para fazer heterografts entre melancia (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e cabaça (Lagenaria siceraria [Molina] Cuatrec). Este protocolo também fornece um esquema experimental detalhado e procedimentos analíticos para o estudo do Regulamento de miRNA expressões após a enxertia, que é útil para revelar os mecanismos subjacentes vantagens heterografting.

Os materiais de planta utilizados neste estudo incluem a cultivar de melancia e a cabaça landrace. Cultivar de melancia é um cultivar comercial com alto rendimento, mas suscetível a baixas temperaturas. Cabaça landrace é um popular porta-enxertos para enxertia com melancia, pepino e cabaça, devido à sua excelente tolerância de temperaturas baixas21.

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Protocolo

1. esterilização e germinação de sementes

  1. Para a esterilização de superfície, mergulhe as sementes de cabaça num copo de 500 mL com água a 58 ° C, com agitação ocasional, até que a temperatura da água cai para 40 ° C.
  2. Enquanto isso, coloque 3 kg de solo de turfa em um saco de nylon e, para esterilizar, autoclave em 120 ° C/0.5 MPa por 20 min.
  3. Continue a embeber as sementes de cabaça para 4-5 h mais com nenhuma agitação.
    1. Uma vez que a água atinge a temperatura ambiente, lave as sementes 2 x - 3 x com água destilada.
    2. Escorra o excesso de água e permitir que as sementes germinar em um saco de gaze a 28 ° C em uma câmara de crescimento no escuro.
    3. Após a germinação, semear as sementes em potes de plástico (6 cm de diâmetro) enchidas com o solo de turfa esterilizado.
  4. Quando as mudas de cabaça desenvolveram dois cotilédones achatados, repita os passos 1.1-1.3 com sementes de melancia.
    Nota: Este tempo de gestão assegura que os tamanhos do descendente e porta-enxerto correspondem bem para enxertia bem sucedida.

2. seedling crescimento e enxertia

  1. Crescem as mudas em uma câmara de crescimento com um ciclo de 16-h /8-h luz escura, mantendo a temperatura a 28 ° C durante o dia (luz) e a 22 ° C durante a noite (escuro). Irriga as mudas, adicionando água 1 x por dia no final da tarde.
  2. Use o método de enxertia de corte22 para fazer heterografts quando as mudas da garrafa cabaça (porta-enxerto) estão na um fase verdadeiro-folha e os cotilédones da melancia (scion) surgiram (ainda não achatados).
    1. Cortar o hipocótilo das mudas melancia em 2-3 cm abaixo os cotilédones e folhas de topo das mudas no local imediatamente acima o verdadeiro cabaça.
    2. Use um palito para fazer um furo na parte superior das mudas aparado de cabaça. Insira as mudas de melancia aparada nos orifícios das mudas cabaça para fazer heterografts.
  3. Use um método semelhante como apresentada no passo 2.2 tornar stent.
    Nota: Combinações de Homo e heterografting sempre devem ser feitas simultaneamente (Figura 1), que, neste caso, resulta no seguinte: melancia/cabaça (WB, heterotópico), melancia/melancia (WW, homograft) e /bottle de cabaça cabaça (BB, homograft).

figure-protocol-1
Figura 1: ilustração de combinações o enxerto e as estruturas de plantas enxertadas. WB = heterografting de melancia/garrafa cabaça; WW = homografting de melancia/melancia; BB = cabaça/garrafa cabaça homo-enxerto; WB-S = folhas descendente de heterografts de cabaça a melancia/garrafa que foram amostradas; WB-R = folhas de porta-enxertos das heterografts de cabaça de melancia/garrafa que foram amostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. postgrafting de gestão, tratamento pelo frio e amostragem

  1. Wrap as mudas enxertadas com sacos de polietileno transparente para manter uma umidade relativamente elevada e mantê-las para a 7D sob condições ambientais de 16-h luz/8-h ciclos escuros, mantendo a temperatura a 28 ° C durante o dia (luz) e a 22 ° C, durante o noite (escuro).
  2. Descobri os sacos de polietileno transparente no dia 7. Deixe que as plantas crescem para um adicional 7-10 dias, sob as mesmas condições.
  3. Divida as mudas saudáveis e uniformes em dois grupos, um para tratamento pelo frio (estressado) e outro para o controle (não-forçado). Para o grupo de controle, deixe as mudas na câmara de crescimento mesmo (a 28 ° C) para um adicional 48 h, enquanto que para o grupo de frio-salientou, transferir as mudas para uma câmara de crescimento com uma temperatura constante a 6 ° C, com condições de claro/escuro, conforme descrito na etapa 2.1.
  4. As folhas do scion e o porta-enxerto de enxertos (Figura 1) da amostra. Congelar as amostras imediatamente em nitrogênio líquido e armazená-los a-70 ° C até o uso.

4. Biblioteca preparação e arranjar em sequência do elevado-throughput

  1. Transferi as amostras congeladas para um tubo de 2 mL microcentrifuga em nitrogênio líquido.
  2. Adicione um talão de aço inoxidável (5 mm de diâmetro) para cada tubo contendo os tecidos.
  3. Homogeneizar os tecidos a um pó fino usando um homogeneizador de moinho do grânulo por 30 s.
  4. Para cada combinação de enxertia, tomar quantidades iguais (0,1 g) da amostra de solo de dez mudas e misturá-los num tubo de centrífuga de 10 mL. Adicione uma quantidade adequada de reagente de cloridrato de guanidium (Tabela de materiais) baseado nas sugestões do fabricante correspondente ao peso do tecido.
    1. Remover contaminações de DNA genômicas pela adição de RNA-livre de DNase I 150 U/mL a 37 ° C por 1h.
  5. Determinar o total número de quantidade de RNA em um sistema de eletroforese conta para garantir a integridade do RNA > 7.0.
    Nota: Um RIN > 7.0 assegura uma alta integridade das amostras do RNA.
  6. Prepare pequenas bibliotecas do RNA usando um kit comercial (Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Use 1 µ g de RNA total por amostra para iniciar.
    1. Degelo biblioteca normalização reagentes e adaptadores de acordo com as orientações do fabricante. Ligate RNAs pequeno com os adaptadores 5 ' e 3 ' e eluir e purificá-los. Em seguida, reverso transcrever o 5 ' e 3' ligada a RNAs pequeno, seguindo as orientações do fabricante.
    2. Execute a amplificação por PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Avalie a qualidade e quantidade das bibliotecas de cDNA usando uma conta de eletroforese.
    3. Carregar de 1 µ l de uma biblioteca de RNA em um sistema de eletroforese conta para garantir o RIN > 7.0.
  7. Sequencie as pequenas bibliotecas de RNA em um instrumento de sequenciamento de alto rendimento, conforme descrito em outro lugar23.

5. miRNA e previsão de Gene alvo

  1. Para cada combinação de enxertia, use o open source UEA sRNA bancada 2,4-planta versão24 para remover sequências de má qualidade e aparar sequências de adaptador do lê cru. Descartar as sequências que são menores do que 18 nt ou maior que 32 nt.
  2. Compare as sequências de "limpas" de alta qualidade para o banco de dados de código aberto Rfam 11.0 a reconhecer e remover leituras de tRNA, rRNA, snoRNA e outros snRNPs.
  3. Alinhe o restante lê para os genomas de referência usando uma sequência curta-leitura alinhamento ferramenta25. Não há incompatibilidade é permitida nesta etapa.
    Nota: A montagem do genoma "97103" melancia V126 foi usado para o alinhamento com as leituras de scion e o cabaça "HZ" genoma assembly V127 foi usada para leituras do rootstock.
  4. Compare o restante lê contra conhecidos miRNAs maduros no código-fonte aberto miRBase 22,028. Leituras que são homólogas ao conhecido miRNAs são classificadas como os miRNAs conservados.
  5. Compare as sequências que não combinam os precursores de miRNA conhecido com a sequência do genoma. Use o algoritmo de29 MIREAP para detectar potenciais miRNAs romance sob as configurações padrão.

6. diferencial expressão e análise do Gene Ontology

  1. Compare os níveis de expressão de miRNAs baseados suas contagens de leitura. os miRNAs com um P-valor (teste exato de Fisher) < 0,05 e um registro absoluto2 valor > 2 são considerados para ser diferencialmente expressos.
  2. Use do oligonucleotide antisentido alvo local seleção ferramenta (TargetFinder)30 para prever potenciais mRNAs complementares (miRNA genes-alvo) para os miRNAs diferencialmente expressos sob parâmetros padrão.
  3. Usar a ontologia de gene (ir) padrões de enriquecimento ferramenta analítica31 para revelar a ontologia de genes alvo miRNA (GO) sob um P- limite de valor de 0,05 de significância estatística.

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Resultados

figure-results-1
Figura 2: fenótipos de vários enxertos em temperatura ambiente e condições de frio-salientou. (um) este painel mostra homo e heterografted mudas à temperatura ambiente como o controle. (b) este painel mostra homo e heterografted mudas após 48 h de tratamento pelo frio.

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Discussão

Neste protocolo, descrevemos em detalhe um método altamente eficiente e reprodutível para tornar homo e heterografts entre melancia e cabaça. Esse método, que exige nenhum equipamento específico, é muito fácil de operar e normalmente tem uma taxa de sobrevivência muito alta de enxertia. O método também pode ser usado para fazer enxertos para outras abóboras, tais como entre melancia, pepino e abóbora.

É interessante notar que o tamanho relativo (idade) do porta-enxerto e descendente é fundamen...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar. Os dados de sequenciamento de RNA pequenos são depositados no GenBank sob o número de adesão SRP136842.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31772191), o projeto de pesquisa para o interesse público na província de Zhejiang (2017C 32027), a chave de ciência projeto de melhoramento de plantas em Zhejiang (2016C 02051) e o programa nacional de o apoio de top-notch jovens profissionais (para lojas).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente TRIzolInvitrogen15596026
DNase livre de RNA ITakaraD2270A
Truseq Kit de preparação de amostra de RNA pequeno IlluminaRS-200-0012
2100 BionalyserAgilent5067
DNA PolimeraseThermo Fisher ScientificF530S
UEA sRNA workbench versão 2.4-planta  (software)NANAhttp://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/
Banco de dados Rfam 11.0 ( website)NANAhttp://rfam.janelia.org
miRBase 22.0( website)NANAhttp://www.mirbase.org/
MIREAP(software)NANAhttps://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder ( software)NANAhttp://targetfinder.org/

Referências

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