Method Article

Caracterização física de alta resolução de nanopartículas metálicas únicas

DOI:

10.3791/58257

⸱

June 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar clusters de oxigênio de metal discretos, polioxometalatos (POMs), no limite de molécula única usando uma plataforma eletrônica baseada em nanoporos biológica. O método fornece uma aproximação complementar às ferramentas analíticas tradicionais da química usadas no estudo destas moléculas.

Abstract

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As moléculas individuais podem ser detectadas e caracterizadas medindo o grau pelo qual reduzem a corrente iónica que flui através de um único poro da nanômetro-escala. O sinal é característico das propriedades físico-químicas da molécula e suas interações com os poros. Nós demonstramos que o nanoporo dado forma pelo Staphylococcus da exotoxina da proteína bacteriana aureus alfa hemolisina (αhl) pode detectar polyoxometalates (poms, grupos aniônicos do oxigênio do metal), no único limite da molécula. Além disso, os produtos múltiplos da degradação do ácido POM de 12 phosphotungstic (PTA, H3picowatt12O40) na solução são medidos simultaneamente. A única sensibilidade da molécula do método do nanoporo permite que os poms sejam caracterizados em concentrações significativamente mais baixas do que exigidas para a espectroscopia da ressonância magnética nuclear (RMN). Esta técnica poderia servir como uma ferramenta nova para que os químicos estudem as propriedades moleculars dos polyoxometalates ou dos outros conjuntos metálicos, para compreender melhor processos sintéticos de POM, e para melhorar possivelmente seu rendimento. Hipoteticamente, a localização de um determinado átomo, ou a rotação de um fragmento na molécula, e o estado de oxidação do metal poderiam ser investigados com este método. Além disso, esta nova técnica tem a vantagem de permitir o monitoramento em tempo real de moléculas em solução.

Introduction

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A detecção de analitos biomoleculares no nível da molécula única pode ser realizada usando nanoporos e medindo modulações de corrente iónica. Tipicamente, os nanoporos são divididos em duas categorias com base na sua fabricação: biológica (automontada a partir de proteínas ou DNA origami)1,2,3, ou Solid-State (por exemplo, fabricado com ferramentas de processamento de semicondutores)4,5. Enquanto os nanoporos de estado sólido foram sugeridos como potencialmente mais robustos fisicamente e podem ser usados em uma ampla gama de condições de solução, os nanoporos proteicos até agora oferecem maior sensibilidade, mais resistência a incrustantes, maior largura de banda, melhor produto químico selectividade, e uma maior relação sinal/ruído.

Uma variedade de canais de íons proteicos, como o formado por Staphylococcus aureus α-hemolisina (αhl), pode ser usado para detectar moléculas únicas, incluindo íons (por exemplo, H+ e D+)2,3,polinucleotídeos (DNA e RNA)6,7,8, DNA danificado9, polipeptídeos10, proteínas (dobradas e desdobradas)11, polímeros (polietileno glicol e outros)12,13 , 14, nanopartículas de ouro15,16,17,18,19, e outras moléculas sintéticas20.

Nós demonstramos recentemente que o nanoporo do αhl pode igualmente facilmente detectar e caracterizar aglomerados metálicos, polyoxometalates (poms), a nível da única molécula. Poms são discretos nanoescala metal aniônico clusters de oxigênio que foram descobertos em 182621, e desde então, muitos outros tipos foram sintetizados. Os tamanhos diferentes, as estruturas, e as composições elementares dos polyoxometalates que estão agora disponíveis conduziram a uma escala larga das propriedades e das aplicações que incluem a química22,23, catálise24, ciência material25 ,26, e pesquisa biomédica27,28,29.

A síntese de POM é um processo de automontagem tipicamente realizado em água misturando as quantidades estequiometricamente exigidas de sais de metal monoméricos. Uma vez formados, os POMs exibem uma grande diversidade de tamanhos e formas. Por exemplo, a estrutura do polyanion de Keggin, XM12O40q- é compor de um heteroátomo (X) cercado por quatro oxigênios para dar forma a um tetraedro (q é a carga). O heteroátomo está centralmente localizado dentro de uma gaiola formada por 12 octaédricos MO6 unidades (onde M = metais de transição em seu estado de alta oxidação), que estão ligados uns aos outros pelos vizinhos átomos de oxigênio compartilhado. Quando a estrutura dos polyoxometalates do tungstênio for estável em circunstâncias ácidas, os íons do hidróxido conduzem ao clivagem hidrolítica de ligações do metal-oxigênio (M-O)30. Este processo complexo resulta na perda de uma ou mais subunidades octaédrica do MO6 , levando à formação de espécies monovacantes e trivagas e, eventualmente, à completa decomposição dos poms. Nossa discussão aqui será limitada aos produtos parciais da decomposição do ácido 12 phosphotungstic em pH 5,5 e em 7,5.

O objetivo deste protocolo é detectar clusters de oxigênio de metal discretos no limite da molécula única usando uma plataforma eletrônica baseada em nanoporos biológica. Este método permite a detecção de aglomerados metálicos em solução. Várias espécies em solução podem ser discriminadas com maior sensibilidade do que os métodos analíticos convencionais33. Com ele, as diferenças sutis na estrutura de POM podem ser elucidadas, e em concentrações marcadamente mais baixas do que aquelas exigidas para a espectroscopia de RMN. É importante ressaltar que essa abordagem permite até mesmo a discriminação de formas isoméricas de na8HPW9O341.

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Protocol

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Nota: O protocolo abaixo é específico para o sistema de DC de Nanopatch eletrônico BioSciences (EBS). Entretanto, pode prontamente ser adaptado ao outro instrumento da electrofisiologia usado para medir a corrente através das membranas planas do BICAMADA do lipido (câmara padrão da membrana do BICAMADA do lipido, geometria do U-tubo, microcapillaries puxado, etc.). A identificação dos materiais comerciais e suas fontes é dada para descrever os resultados experimentais. Em nenhum caso essa identificação implica recomendação do Instituto Nacional de normas e tecnologia, nem implica que os materiais são os melhores disponíveis.

1. preparação da solução e do analyte

  1. Prepare todas as soluções de eletrólitos com água de 18 MΩ-cm de um sistema de purificação de água tipo 1 para remover espécies orgânicas de traço e depois filtre todas as soluções eletrolíticas através de um filtro de vácuo de 0,22 μm imediatamente antes das gravações de canal iônico
    Nota: A qualidade da água é um fator crítico para a estabilidade e longevidade do sistema de nanoporos de membrana.
  2. Tipo selvagem αHL.
    1. Siga as precauções de MSDS ao manusear a proteína de toxina αHL.
    2. Misture o tipo selvagem liofilizado monomérico S. aureus α-hemolysin (αhl) em pó com 18 MΩ-cm de água a 1 mg/ml. Distribuir 10 a 30 μL de alíquotas da amostra em tubos de centrifugação Cryo-safe, piscar rapidamente o congelamento em nitrogênio líquido e, em seguida, armazenar a-80 ° c. Alternativamente, use purificada pré-formada heptamérica αHL31.
  3. Dissolver o lipídio 1,2-Diphytanoyl-SN-Glycero-3-fosfocolina (DPhyPC) para 0,2 mg/mL em n-decano em um frasco de 4 ml de cintilação de vidro com um tampão revestido de politetrafluoroethyleneeflon. Armazene a solução a 4 ° c para uso repetido por até um mês.
  4. Prepare soluções de ácido fosfotúngstico.
    1. Siga as precauções de MSDS ao manusear o pó de ácido fosfotúngstico e prepare uma solução de ácido fosfotúngstico de 2 mM dissolvendo 57,6 mg de H3PW12O40 em 10 ml de um NaCl de 1 M e 10 mm NaH2po4 solução, que constitui a solução de ações.
    2. Tome 5 mL desta solução e ajuste o pH para 5,5 com NaOH de 3 M. Ajuste o pH dos outros 5 mL da solução de stock para 7,5 com NaOH de 3 M.
      Nota: Em pH 5,5, o ácido 12-phosphotungstic (PTA, H3picowatt12O40) decompõe primeiramente no Anion monovacant [picowatt11O39]7-.

2. conjunto de células de teste

  1. Monte a célula de teste de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Mergulhe um fio Ag/AgCl em lixívia (hipoclorito de sódio) por 10 minutos após raspa-lo com 600 lixa de grão. Posicione o eletrodo dentro da membrana de nanoporos de quartzo (QNM).
  3. Coloc um elétrodo cilíndrico da pelota de AgCl encaixado em um fio de prata fora do QNM.
  4. Uma vez que a célula de teste é configurada, ative a fonte de alimentação e o programa de aquisição de dados. Assegure-se de que a leitura atual DC seja 0 pA na ausência de solução na célula de teste.
  5. Use uma seringa conectada à célula de teste através de uma linha de fluido para adicionar solução de eletrólitos tamponada acima da face do qnm e para garantir que a corrente iónica Satula o amplificador. Se não, o QNM pode ser obstruído. Aplique uma tensão pop (± 1 V) e/ou uma pressão superior a 300 mm Hg para a limpar. Se isso funcionar, reduza a tensão e a pressão.

3. formação de bilayer lipídico

  1. Preencha a solução na célula de teste para que o nível da solução esteja bem acima da face do QNM. Em seguida, abaixe o nível da solução via seringa para abaixo da face, de tal forma que a corrente diminua para zero.
  2. Mergulhe uma ponta de pipeta de 10 μL no frasco lipídico. Empurre na extremidade traseira da ponta da pipeta e bata-a no lado do frasco para remover todo o lipido visível.
  3. Toque na ponta da pipeta na interface ar-água da solução na célula de teste quando o nível da solução estiver acima da face do QNM e aguarde de dois a cinco minutos para que o lipídio se espalhe uniformemente.
  4. Abaixe lentamente o nível da solução abaixo da cara do qnm até que a corrente saturates, e então levante lentamente o nível da solução após a cara do qnm para dar forma a uma membrana do BICAMADA do lipido.
    1. Uma vez que um BICAMADA parece formar-se (isto é, quando a corrente vai a zero), tente estalá-la diversas vezes aumentando a pressão e assegure-se de que o qnm não esteja obstruído. Para reformar a membrana de BICAMADA lipídico, abaixe o nível de solução abaixo da face do qnm e levante-o lentamente.
  5. Se a membrana de BICAMADA lipídico não se formar pela primeira vez, abaixe a solução abaixo da face e levante-a novamente. Se não se formar após 3 ensaios, adicione mais lipídios conforme descrito em 3,2 e 3,3.
  6. Depois de formar uma membrana, defina o deslocamento atual para zero quando o potencial aplicado é zero.

4. αHL formação de poros

  1. Adicionar 2,5 ng de amostra de proteína heptamérica de αHL pré-formada purificada (ou 250 ng de αhl monomérica) para a célula de teste (volume ≈ 200 μL) para permitir a formação de canais.
  2. Aumente a pressão sobre a BICAMADA com uma seringa estanque (Figura 1) após a formação de uma BICAMADA, para expandir a membrana do qnm e facilitar a inserção de nanoporos. Aumente a pressão de volta aplicada tipicamente entre 40 a 200 mmHg, dependendo de cada QNM.
    Nota: O software EBS tem um recurso de inserção automatizada que aplica um viés maior (tipicamente 200 a 400 mV) para induzir a formação de poros e, em seguida, reduz automaticamente a tensão desejada para o viés de medição, uma vez que um único canal se forma.
  3. Após uma forma de nanoporos, reduza a pressão de volta para cerca de 1 ⁄ 2 da pressão de inserção. Se forem observados vários canais, remova-os reduzindo significativamente a pressão.

5. cluster metálico particionamento no Nanopore

  1. Para compensar os desequilíbrios dos eléctrodos, defina a tensão de deslocamento DC de tal forma que, quando o potencial aplicado for definido para zero, não exista corrente medida.
  2. Antes de adicionar a amostra de POM, realize um experimento de controle para garantir que não haja contaminantes (por exemplo, poms de rastreamento de um experimento anterior) no reservatório. Especificamente, adquira um traço de corrente iónica um potencial aplicado de + 120 mV para-120 mV na ausência de quaisquer POMs para verificar se não há bloqueios de corrente espontânea estão presentes.
    Nota: Devido à estrutura assimétrica do canal αHL (Figura 1), a magnitude da corrente iónica será diferente para os potenciais aplicados positivos e negativos. A relação da corrente medida acima desta tensão aplicada é indicativa da orientação da αHL nanoporo na membrana.
  3. Adicione a amostra de POM liberando o reservatório com a solução metálica do conjunto na concentração de 1 a 5 milímetros. Alternativamente, carregue a amostra no capilar antes do conjunto da célula para estudar o particionamento de POMs na outra extremidade do canal αHL.
  4. Registre a corrente iónica usando o software do fabricante para detectar bloqueios de corrente transitórios causados pelo particionamento de POMs individuais no nanopore. Estimar as propriedades físicas e químicas da molécula a partir da profundidade do bloqueio da corrente iónica, da frequência do evento e da distribuição do tempo de permanência dos bloqueios.

6. gravações de canal iônico e análise de dados

  1. Adquira as medições da série temporal de corrente iónica usando um amplificador de alta impedância, baixo ruído e sistema de aquisição de dados. Realize as medições em uma tensão aplicada de-120 mV (em relação ao lado do canal cis ) para cada pH.
  2. Aplique um filtro Bessel de 8 pólos de passagem baixa 100 kHz ao sinal, que é posteriormente digitalizado em 500 kHz (i.e., 2 MS/ponto). Extraia eventos da série temporal e analise eventos usando o algoritmo Adept no pacote de software Mosaic 32,33.

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Results

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Ao longo das últimas duas décadas, os poros da nanômetro-escala de proteínas ligadas à membrana foram demonstrados como sensores versáteis de molécula única. As medições baseadas em nanopore são relativamente simples de executar.  Duas câmaras enchidas com a solução do eletrólito são separadas por um nanoporo encaixado em uma membrana eletricamente isolante do lipido. Ou um amplificador da remendo-braçadeira ou uma fonte de alimentação externa fornecem um potencial eletrostático através d...

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Discussion

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Devido a sua carga aniônicos, os poms associam provável com as cátions orgânicas do contador através das interações eletrostáticas. Portanto, é importante identificar as condições de solução adequadas e os ambientes de eletrólitos corretos (especialmente cátions em solução) para evitar a formação complexa com POMs. Um cuidado particular é exigido na escolha do amortecedor. Por exemplo, a taxa de captura de POMs com tris (hidroximetil) aminometano e soluções tamponadas com ácido cítrico é significativamente menor do que n...

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Acknowledgements

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Agradecemos o apoio financeiro da Organização Europeia de biologia molecular para uma bolsa de pós-doutorado (a je) e uma subvenção da NIH NHGRI (a J.J.K.). Agradecemos a ajuda dos professores Jingyue Ju e Sergey Kalachikov (Universidade de Columbia) para fornecer αHL heptamérica, e para discussões inspiradoras com o Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nanopatch DC SystemElectronic Biosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAKFiltro
1,2-Difitanoyl-sn- Glicero-3-Phosphocholine (DPhPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850356P
Decane, ReagentPlus, ≥ 99%, < / em>Sigma-AldrichD901
α HL List Biological Laboratories, Campbell, CA
Ag fioAlfa Aesar
2 mm Ag / AgCl eletrodo de discoIn Vivo MetricE202
Sistema amplificador de alta impedânciaElectronic Biosciences, San Diego, CA
capilares
célula de teste
Processamento e Análise de Dados MOSAIChttps://pages.nist.gov/mosaic/
Hidrato de ácido fosfotúngsticoSigma-Aldrich455970
Cloreto de sódioSigma-AldrichS3014
fosfato de sódio monobásico monohidratadoSigma-Aldrich71507
de vácuo Milliporede quartzo de policarbonato personalizada

References

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