Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.
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Artigo de método
Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.
Introdução
PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade5,6. Para resolver este problema, alterna....
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Protocolo
1. local-dirigido Mutagenesis de Protease Vector
- Design e ordem personalizada-sintetizados oligonucleotides instalar uma mutação de interesse usando uma modificação do padrão mutagenesis local-dirigido protocolos12. Norma primeiras demão demolhadas (sem purificação adicional) são perfeitamente aceitáveis.
Nota: Uma abordagem geral para projetos cartilha envolve a criação de cartilhas parcialmente sobrepostas conforme indicado na tabela 1, usando uma calculadora de temperatura (Tm) derretimento específica para o polymerase de interesse. - Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para o mutagen....
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Resultados
O ensaio de proteólise de alto rendimento depende de superar três grandes desafios. Primeiro, para superar a saída intrinsecamente baixa de uma protease de PCSK9 single-volume de negócios, uma protease PCSK9 falta o inibitório prodomínio é usado, com a sequência de clivagem na cauda do prodomínio ligada a um luciferase que pode ser secretada14. Em segundo lugar, para satisfazer a necessidade da protease de dobrar em complexo com sua inibitório prodomínio, que os do.......
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Discussão
Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto rendimento. A.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores graças ao apoio generoso financiamento do NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH através da UCSF clínica e translacional ciência Instituto catalisador programa (UL1 TR000004), o Senado académico UCSF, a Fundação de Hellman, um Gilead Sciences Research Scholar Award, um prêmio Pfizer ASPIRE Cardiovascular (todos John S. Chorba) e do Howard Hughes Medical Institute (para Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR | EUA Scientific | 1402-2900 | para PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | de DNA polimerase de alta fidelidade |
| New England Biolabs | N0447L | dNTPs (para PCR) | |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Autores | n / a | Disponível dos autores |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Autores | n/a | Disponível dos autores |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | Para géis de DNA |
| E-Gel Imager System com Base de Luz Azul | ThermoFisher Scientific | 4466612 | Para geração de imagens de géis de DNA |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Para géis de DNA |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | Para tampão de gel de DNA |
| Ácido acético glacial | ThermoFisher Scientific | A38-500 | Para tampão de gel de DNA |
| Solução de ácido etilenodiaminotetracético | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, para buffer de gel de DNA |
| 1 kb Escada de DNA | Gold Biotechnology | D010 | Escada de DNA |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Enzima de restrição |
| Placas de ágar LB com 100 µ g / mL de carbenicilina | Teknova | L1010 | LB-Carb placas |
| One Shot Mach1 T Resistente a fagos quimicamente competentes E. coli< / em> | ThermoFisher Scientific | C862003 | Células quimicamente competentes |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnology | C-103-5 | Antibiótico seletivo |
| E.Z.N.A. Plasmídeo Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | Kit Miniprep de Purificação de DNA |
| NanoDrop 2000 Espectrofotômetro | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | |
| Células 293T Coleção | Americana de Cultura de Tecidos (ATCC) | CRL-3216 | Células HEK 293T |
| DMEM, glicose alta, piruvato | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, célula de mamífero mídia |
| Fetal Bovino Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Tripsina, para dissociação celular |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess contador de células automatizado | ThermoFisher Scientific | C10227 | Contagem automatizada de células |
| Lâminas para câmara de contagem de células | Countess ThermoFisher Scientific | C10228 | Lâminas para contagem de células |
| Placas de Cultura de Tecidos CELLSTAR, Brancas, Brancas, com Tampa | Grenier Bio-One | 655083 | Placa de 96 poços branca, fundo branco |
| Placa PCR de 96 poços TempPlate não contornada Placa PCR de 96 poços, natural | USA Scientific | 1402-9596 | Placa de 96 poços para placa de plasmídeo mestre |
| Nunc 2.0mL DeepWell Placas | ThermoFisher Scientific | 278743 | placa de 96 poços profundos |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Reagente de transfecção de lipídios, Reagente Lf3K |
| P3000 Reagente | de pré-complexação de DNA | L3000008 | ThermoFisher Scientific |
| meio de soro reduzido Lf3K OptiMEM I | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Meio de soro reduzido para transfecção |
| (+)-L-ascorbato de sódio | Millipore | Sigma A4034 | Ascorbato de sódio |
| Cloreto de sódio | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumina, soro bovino, fração V, baixo teor de metais pesados | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Metanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Ácido clorídrico | VWR | JT9535-2 | Concentrado HCl |
| Coelenterazina | Gold Biotechnology | CZ2.5 | substrato de luciferase |
| , estéril | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Filtro estéril, PVDF, 0,22 µ |
| Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-200XLS+ | Pipeta | Multicanal 17013810 | Pipeta Multicanal |
| Pipet-Lite L12-20XLS+ | Pipeta | Multicanal 17013808 | |
| Pipeta Multicanal Pipet-Lite L12-10XLS+ | Pipeta | Multicanal 17013807 | Rainin Reservatório |
| reagentes | Corning | 4870 | Calha para reagentes |
| Tubos de centrífuga, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | Tubos de 15 mL |
| Tubos de centrífuga, 50 mL | Corning | 430829 | tubos de 50 mL |
| Leitor de microplacas Spark | Tecan | N/a | Leitor de placas |
| Excel | Microsoft | 2016 para Mac | Software de planilha |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Software de análise de dados científicos |
Referências
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
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Reimpressões e permissões
