Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Resumo

Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.

Introdução

Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética¹. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese^2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas⁴

Protocolo

1. cepas e plasmídeos

1. Estirpes bacterianas
   1. Use a e. coli as estirpes BW25113⁵, JW4179 (BW25113 tamA::kan)⁷, BL21(DE3)²⁰e BL21ΔABCF²¹. Consulte Tabela de materiais para mais informações.
2. Bacteriófagos
   1. Use o fago P1vir para a transdução geral. Armazenar a Praga como um estoque líquido com algumas gotas de clorofórmio (consulte a etapa 2.2). Para obter mais informações, consulte Tabela de materiais.

Resultados

Geração de um tamA Knock-out de BL21ΔABCF:

A estratégia acima descrita anteriormente foi usada para produzir uma tensão derivada de BL21(DE3), uma estirpe de laboratório padrão usada para a produção de proteína, que é otimizada para a produção de proteínas de membrana exterior e chamada BL21ΔABCF²¹. Esta tensão não possui quatro genes que codificam para proteínas de membrana externa abundante e, con.......

Discussão

Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem métodos de biologia molecular .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Strains
E. coli BW25113	NIG	ME6092	Cepa selvagem da coleção Keio
E. coli BL21(DE3)	Merck	69450-3	Cepa de expressão
E. coli BL21DABCF	Addgene	102270	Derivado de BL21(DE3)
< em>E. coli JW4179	NIG	JW4179-KC	tamA mutante de deleção
P1 vir	NIG	HR16	Geralmente transdução de bacteriófagos
Plasmídeos
pCP20	CGSC	14177	plasmídeo replicante condicional com FLP
pASK-IBA2	IBA GmbH	2-1301-000	vetor de expressão
pEibD10	N/A	N/A	para produção de EibD; plasmídeo disponível a pedido
pET22b+	Merck	69744-3	vetor de expressão
pIBA2-YadA	N/A	N/A	para produção de YadA; plasmídeo disponível a pedido
Produtos químicos
ácido	acéticoThermoFisher	33209
Ágar	BD Bacto	214010
Agarose	Lonza	50004
Ampicilina	Applichem	A0839
Anhidrotetraciclina	Abcam	ab145350
anticorpo anticolágeno tipo I COL-1	Sigma	C2456
Colágeno bovino tipo I	Sigma	C9791
Cloreto de cálcio	Merck	102382
Clorofórmio	Merck	102445
Hidrogenofosfato dissódico	VWR	28029
Corante de DNA	Thermo	S33102
Marcador de tamanho molecular de DNA	New England BioLabs	N3232S
DNase I	Sigma	DN25
Mistura dNTP	New England Biolabs	N0447
ECL HRP substrato	Advansta	K-12045
EDTA	Applichem	A2937
Glicerol	VWR	24388
cabra anti-rato IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005
cabra anti-coelho IgG-HRP	Agrisera	AS10668
HEPES	VWR	30487
Isopropil tiogalactosídeo	VWR	43714
Kanamicina	Applichem	A1493
Lisozima	Applichem	A4972
Cloreto de magnésio	VWR	25108
Cloreto de manganês	Sigma	221279
N- lauroil sarcosina	Sigma	L9150
Leite em pó desnatado	Sigma	70166
Cloreto de sódio	VWR	27808
tamA primário direto	Invitrogen	N/A	Sequência 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA primário inverso	Invitrogen	N/A	Sequência 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq
DNA polimerase	New England Biolabs	M0267
Citrato trissódico	Merck	106448
Triptona	VWR	84610
Tween20	Sigma	P1379
Extrato de levedura	Merck	103753
Equipment eletroforese em gel strong>
Agarose	Hoefer	SUB13
Batedor de contas	Thermo	FP120A-115
Câmera CCD	Kodak	4000R
Cubetas de eletroporação	Bio-Rad	165-2089
Unidade de eletroporação	Bio-Rad	1652100
Gerador de imagens em gel	Nippon Genetics	GP-03LED
Agitador de incubação	Infors HT	Minitron
Incubadora	VWR	390-0482
Microcentrífuga	Eppendorf	5415D
Forno de microondas	Samsung	CM1099A
Máquina de PCR	Biometra	Tpersonal
Tiras de	PCRAxygen	PCR-0208-CP-C
medidor de pH	Hanna Instruments	HI2211-01
membrana PVDF	ThermoFisher	88518
Câmara de eletroforese SDS-PAG	ThermoFisher	A25977
Centrífuga de mesa	Beckman Coulter	B06322
Misturador de vórtice	Scientific Industries	SI-0236
Banho-maria	GFL	D3006
Unidade de transferência úmida	Hoefer	TE22