Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Summary

Aqui, apresentamos um método para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila , substituindo o primeiro exon codificação de genes com drivers de transcrição. O método baseado em CRISPR/Cas9 coloca uma sequência liberada sob o Regulamento endógena de um gene substituído e, consequentemente, facilita a expressão de transctivator exclusivamente em padrões spatiotemporal gene-específico.

Abstract

Sistemas de transcrição binário são poderosas ferramentas de genéticas, amplamente utilizadas para visualizar e manipular a célula destino e gene expression em grupos específicos de células ou tecidos em organismos-modelo. Estes sistemas contêm duas componentes linhas transgénicas. Uma linha de motorista expressa um ativador transcricional sob o controle de promotores/potenciadores de tecido-específica e uma linha de repórter/efetoras portos um gene alvo colocado a jusante para o sítio de ligação do ativador da transcrição. Animais, abrigando os dois componentes induzem transactivation tecido-específica de uma expressão de gene alvo. Preciso spatiotemporal expressão do gene nos tecidos alvo é crítica para interpretação imparcial da atividade celular/gene. Portanto, é essencial desenvolver um método para gerar linhas de motorista exclusivo de célula/tecido-específica. Aqui nós apresentamos um método para gerar o sistema altamente específicos do tecido-alvo expressão empregando um "Clustered regularmente Interspaced curta palíndromo Repeat/CRISPR-associado" (CRISPR/Cas)-com base técnica de edição de genoma. Neste método, a endonuclease Cas9 é alvo de dois quimérico guia RNAs (gRNA) para locais específicos no primeiro exon codificação de um gene no genoma de Drosophila para criar quebras de dobro-Costa (DSB). Posteriormente, usando um plasmídeo exógena do doador que contém a sequência de liberada, a maquinaria de reparo celular-autónoma permite reparação homologia-dirigido (HDR) de ORL, resultando em preciso exclusão e substituição do exon com a liberada sequência. A batido em liberada é expressa exclusivamente nas células onde o cis-elementos reguladores do gene substituído são funcionais. O protocolo passo a passo detalhado apresentado aqui para gerar um binário driver transcriptional expressado em Drosophila fgf/branchless-produção de células epiteliais/neuronal pode ser adotado para qualquer expressão de gene - ou tecido-específica.

Introduction

A caixa de ferramentas genética para a expressão do gene alvo bem desenvolveu-se em Drosophila, tornando-o um dos melhores sistemas de modelo para investigar a função de genes envolvidos em uma ampla variedade de processos celulares. Sistemas de expressão binário, como fermento Gal4/UAS (sequência de ativação upstream), foi adotado inicialmente por misexpression de trapping e gene potenciador de tecido-específica na drosófila genética modelo¹ (Figura 1). Este sistema facilitou o desenvolvimento de um grande número de técnicas como spatiotemporal regulamento da superexpressão do gene, mise....

Protocol

1. projetar e construir a gRNA vetor de expressão

1. Para precisamente substituir uma região tempo definida de um exon, use uma gRNA dupla abordagem⁶, em que cada gRNA pode alvejar especificamente duas extremidades da região selecionada de interesse. Para obter uma expressão spatiotemporal precisa de gene-específico do driver, selecione dois sites de destino gRNA dentro o primeiro exon codificação do gene.
2. Drosophila melanogaster, selecione os sites de destino gRNA usando a ferramenta de utilitário de destino ideal do flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Outras ferramentas de desig....

Results

Este protocolo foi utilizado com sucesso para gerar um alvo expressão binário repórter sistema específico para bnl expressando células⁵. O cis-elementos reguladores (CREs) que controlam a expressão complexa spatiotemporal bnl não são caracterizados. Portanto, para alcançar expressão spatiotemporal sob o controlo da sequência reguladora endógena bnl , somente o primeiro exon codificação do bnl foi projetado para ser subst.......

Discussion

Tradicionalmente, as armadilhas potenciador de Drosophila foram geradas por dois métodos diferentes. Uma das maneiras inclui inserção aleatória de um driver (eg., Gal4) sequência no genoma por transposição (EG., transposição de P-elemento)¹ . Alternativamente, as sequências de motorista podem ser colocadas sob o controle transcricional de uma região de putativo realçador/promotor em uma construção do plasmídeo, que iria então ser integrada em um site de gravidez ectópica.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	clonagem
LB-Agar	BD Difco	BD  244520	clonagem
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Biologia Molecular
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Biologia Molecular
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Biologia Molecular
UltraPure DNase / RNase Livre Água	ThermoFisher Scientific	10977-023	Biologia Molecular
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Biologia Molecular
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Biologia Molecular
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Biologia Molecular
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Primers de enzima de restrição
	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA modelo e vetor para gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-alta fidelidade Taq		NEB NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	Montagem de DNA
pBPnlsLexA: p65Uw	Addgene		para amplificação LexA
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Biologia Molecular
2x PCR PreMix, com corante (vermelho)	Sydlab	MB067-EQ2R	Kit
eluição em gel	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300
Reagente	TRI de biologia molecularKits de		Molecular Biology
Direct-zol	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Biologia Molecular
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Linha de moscas
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Linha de mosca
btl-Gal4	Kornberg lab		Linha de mosca
MKRS/TB6B	Laboratório		Linha
de mosca Microscópio confocal SP5X	Leica		Imaging padrão de expressão
CO2 estação	Genesee Scientific	59-122WCU	mosca empurrando
Microscópio estéreo	Olympus	SZ-61	mosca empurrando
Pilões homogeneizadores de microtubos	Fisher-Scientific	03-421-217	isolamento de DNA genômico
Espectrofotômetro NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-1000	quantificação de DNA