Method Article

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Corneais estroma epiteliais células-tronco (LESCs) são responsáveis por renovar continuamente o epitélio corneano e mantendo assim a homeostasia corneana e clareza visual. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-LESCs derivadas fornecem uma promissora fonte de células para terapia de reposição de células da córnea. Condições de cultura e diferenciação de indefinido, xenogénicas causam variação nos resultados de pesquisa e impedem a tradução clínica da terapêutica hPSC-derivado. Este protocolo fornece um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hPSC-LESC condições xeno - e alimentador sem célula. Em primeiro lugar, cultura de monocamadas de hPSC indiferenciada na recombinação laminina-521 (LN-521) e médio hPSC definido serve como uma base para a produção de robusta de alta qualidade matéria-prima para diferenciações. Em segundo lugar, um método de diferenciação rápida e simples hPSC-LESC produz populações LESC em apenas 24 dias. Este método inclui uma quatro dias superfície ectodérmica indução em suspensão com pequenas moléculas, seguido por fase de cultura aderente na matriz de combinação LN-521/colagénio IV médio definido diferenciação epitelial da córnea. Cryostoring e diferenciação estendida mais purifica a população celular e permite bancário das células em grandes quantidades de produtos de terapia celular. Os resultantes hPSC-LESCs de alta qualidade fornecem uma potencial estratégia de tratamento romance para reconstrução da superfície da córnea tratar a deficiência de células-tronco limbal (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A córnea transparente na superfície ocular permite que a luz entra na retina e fornece a maioria do poder refrativo do olho. A camada mais externa, o epitélio estratificado da córnea, é continuamente regenerada por estroma de células tronco epiteliais (LESCs). Os LESCs residem na camada basal dos nichos estroma no corneoscleral junção1,2. LESCs falta de marcadores específicos e exclusivos, por sua identificação requer uma análise mais abrangente de um conjunto de marcadores putativos. P63 do fator de transcrição epiteliais e especialmente N-terminal truncada transcreva a isoforma alfa do p63 (ΔNp63α), tem sido proposto como um relevante positivo LESC marcador3,4. Divisão assimétrica de LESCs lhes permite renovar o Self, mas também produzir descendência que migra centripetamente e anteriormente. Como as células de progresso em direção à superfície da córnea eles gradualmente perdem sua stemness e finalmente terminalmente diferenciar superficial de células escamosas que perdem-se continuamente da superfície da córnea.

Danos a qualquer uma das camadas da córnea pode levar à severa deficiência visual, e defeitos corneais são, portanto, uma das principais causas de perda de visão em todo o mundo. Na deficiência de estroma de células estaminais (LSCD), ao limbo é destruído pela doença ou trauma que leva a conjunctivalization e opacificação da superfície da córnea e subsequente perda de visão5,6. Terapia de reposição celular usando enxertos de limbo autólogos ou alogênico oferece uma estratégia de tratamento para pacientes com LSCD4,7,8,9. No entanto, colheita de enxertos autólogos carrega um risco de complicações para o olho saudável, e tecido doador está em falta. Células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), especificamente as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs), pode servir como uma fonte ilimitada de tipos de células clinicamente relevantes, incluindo as células epiteliais da córnea. Portanto, hPSC-derivado LESCs (hPSC-LESCs) representam uma fonte de celular novo atrativo para terapia de reposição celular ocular.

Tradicionalmente, ambos os métodos de cultura hPSC indiferenciadas e seus protocolos de diferenciação para LESCs têm contado com o uso de células alimentador indefinido, soros de animais, mídia condicionadas ou membrana amniótica10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recentemente, esforços na direção de produtos de terapia celular mais seguros tem solicitado a procura de mais protocolos padronizados e xeno-livre cultura e diferenciação. Como resultado, vários métodos definidos e xeno-livre para cultura a longo prazo de hPSCs indiferenciadas estão agora comercialmente disponíveis16,17,18. Como um continuum, dirigido diferenciação protocolos confiando em pistas moleculares para orientar a hPSCs ao destino epitelial da córnea foram recentemente introduzidos19,20,21,22, 23. Ainda muitos desses protocolos utilizados ou indefinido, alimentador com base hPSCs como material, ou fator de crescimento do complexo, xenogénica cocktails para diferenciação de partida.

O propósito do presente protocolo é fornecer um robusto, otimizado, xeno- e método de cultura livre de alimentador hPSC e subsequente diferenciação para LESCs da córnea. Cultura de monocamadas de pluripotentes hPSCs na matriz de laminina-521 (LN-521) no meio de hPSC definida, livre de albumina (especificamente essencial Flex 8) permite a rápida produção de matéria-prima homogênea para diferenciações. Depois de um simples, estratégia de diferenciação em duas fases guias hPSCs em direção a superfície ectodérmico destino em suspensão, seguido de diferenciação aderente para LESCs. Uma população de células onde > 65% express ΔNp63α é obtida dentro de 24 dias. O protocolo de xeno alimentador-livre e foi testado com várias linhas de hPSC (hESCs e hiPSCs), sem qualquer exigência de otimização específicas de linha de celular. Os protocolos para fenotipagem de manutenção, passagem, cryostoring e hPSC-LESC livre de fim de semana, aqui descritos permitem a produção de grandes lotes de alta qualidade LESCs para clínicas ou fins de investigação.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Universidade de Tampere tem a aprovação da autoridade nacional para assuntos médico-legal Finlândia (Dnro 1426/32/300/05) para conduzir a investigação em embriões humanos. O Instituto também tem declarações de apoia do Comitê ético do distrito de Hospital de Pirkanmaa derivar, cultura, e diferenciar linhas hESC (Skottman/R05116) e usar linhas de hiPSC em pesquisa oftálmica (Skottman/R14023). Não há novas linhas de célula derivaram-se para este estudo.

Nota: O protocolo descrito baseia-se na hPSC específica, comercialmente disponível e meios de diferenciação do epitélio corneano. Por favor consulte a Tabela de materiais para os números de informações e catálogo do fabricante/fornecedor.

1. estabelecimento livre de Xeno e alimentador hPSC cultura

  1. Preparações
    1. Casaco bem 24 placas com laminina-521 recombinante humana (LN-521). Para a primeira livre de alimentador (FF) passagem, use LN-521 em uma concentração de 1,09 µ g/cm2e 0,55 µ g/cm2 para as seguintes passagens. As concentrações de LN-521 sugeridas servem como ponto de partida para uma bem sucedida cultura FF, mas podem ser reduzidas.
      1. Descongele o frasco de LN-521 lentamente a 4 ° C, conforme instruções do fabricante.
        Nota: Solução de LN-521 adequadamente manipulada pode ser armazenada a 4 ° C por até 3 meses após o descongelamento.
      2. Para preparar a solução de revestimento, dilua a quantidade adequada de solução estoque LN-521 com de 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) que contém Ca2 + e Mg2 + para um volume total de 300 µ l por bem.
      3. Pipetar a solução de revestimento de poços, selar a placa bem com parafilm e incubar durante a noite a 4 ° C. Placas revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 2 semanas.
        (Opcional): Alternativamente, para um protocolo de revestimento rápido, incubar as placas bem com solução de revestimento por 2 h a 37 ° C, 5% de CO2.
    2. Prepare meio de cultura hPSC (especificamente essencial Flex 8) completando o meio basal com suplemento fornecido, conforme as instruções do fabricante. Adicione 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Note que a formulação é sensível à luz e altas temperaturas. Descongelar o suplemento e aquecer os meios de comunicação, à temperatura ambiente (RT), protegidos da luz. Utilize o meio hPSC completada dentro de duas semanas a partir da data de suplementação.
  2. Transferir o hPSC para cultura de FF na LN-521
    1. Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
    2. HPSCs passagem de sistema padrão de cultura em camadas de alimentador (por exemplo, o prepúcio inactivada humana (hFF) ou embrionárias fibroblastos de rato), ou outros sistemas de cultura FF usando metodologia padrão. Por exemplo, hPSC colônias cultivadas em células de hFF alimentador podem ser dissecadas para peças pequenas com um bisturi e as peças então destacadas com uma ponta de agulha. PSCs humanas cultivadas usando FF sistemas de cultura podem ser transferidos usando cluster passagem método com ou sem tratamento prévio de enzima.
    3. Remover a solução de revestimento de LN-521 dos 24-poços e adicionar 1 mL de meio de hPSC pré-aquecido por bem.
      Nota: Não permitem aos poços secar como LN-521 irá inativar após secagem.
    4. Transferência da colônia peças/célula de clusters para LN-521 revestido 24-poços no hPSC médio com uma pipeta. Transferência de 20 – 30 pedaços de colônia por alvéolo, evitando a superlotação dos poços.
    5. Substitua o meio com 1 mL de meio de hPSC o dia após a transferência e todos os outros dias depois disso. As culturas estão prontas para passagem 3 – 4 dias mais tarde, como hPSCs têm crescido para fora para as colónias com morfologia suave e indiferenciada. Para referência, consulte figura 1B (primeira imagem). Para a primeira passagem de FF, as colônias não devem crescer a uma monocamada confluente totalmente, mas as culturas devem ser passadas quando colónias atingir um tamanho aproximado de 1 mm.
  3. Passagem e manutenção da cultura de hPSC FF
    1. Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
    2. A segunda passagem de FF em diante, passagem a hPSCs FF, quando a cultura chegou a confluência de 80-100%. HPSCs FF de passagem para novo LN-521 revestido de placas de 24 poços usando célula única passagem duas vezes por semana (às segundas e quintas-feiras) para manter as culturas de alta qualidade com morfologia indiferenciada e para alcançar o regime de alimentação livre de fim de semana. Para obter detalhes, consulte18,24,25.
      1. Enxágue o FF hPSCs duas vezes com 1 mL de 1 x DPBS sem Ca2 + e Mg2 +.
      2. Desanexe FF hPSCs com xeno-livre do trypsin-EDTA (especificamente TrypLE selecione enzima) pela incubação 500 µ l por alvéolo a 37 ° C, 5% de CO2. Para o tempo de incubação ideal, permitem que as células para arredondar para cima, mas não para separar. Isto normalmente leva 3 min a 37 ° C, 5% de CO2 (não exceder 5 min).
      3. Remover o xeno-livre do trypsin-EDTA e imediatamente adicionar 500 µ l por alvéolo de inibidor de tripsina definidos.
      4. Desanexe FF hPSCs pipetando cuidado, no entanto, completo para obter uma suspensão de célula única. Transferi a suspensão de hPSC FF através de um filtro de célula de 40 µm para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo meio hPSC previamente aquecido.
      5. Lavar os poços com 1 mL de meio de hPSC e adicionar o meio de lavagem para o tubo de centrifuga conico de 15 mL.
      6. Centrifugar a suspensão de célula única durante 5 min à 300 x g, aspirar o centrifugado e ressuspender em 1 mL de meio de hPSC previamente aquecido.
      7. Conte as células com hemocytometer ou contador automatizado de células.
      8. Remover a solução de revestimento de LN-521 (0,55 µ g/cm2) dos 24-poços e adicionar hPSC médio como na 1.2.3.
      9. Placa hPSCs de FF para 0,55 µ g/cm2 LN-521 revestido 24-poços em uma densidade de célula de 40.000 – 50.000 células/cm2.
      10. Substitua médio médio hPSC fresco o dia após a passagem e todos os outros dias daí em diante, excluindo os domingos.
    3. As células estão prontas a ser usado para diferenciação de 3-4 dias após a passagem, quando a cultura atingiu > confluência de 85%. Para garantir a alta qualidade do hPSCs, consulte métodos de caracterização descritos em detalhe em obras anteriores18,24,25. Recomenda-se apenas a cultura hPSCs até o nível de passagem 15 no sistema FF usando célula única passagem para evitar alterações espectofotômetro. Só uso hPSCs indiferenciada, de alta qualidade como material para diferenciações começar.

2. dirigido a diferenciação e criopreservação de hPSC-derivado LESCs

  1. Preparações
    1. Preparar o meio basal xeno-livre indução (meio de indução basal): suplemento Dulbecco modificado médio da águia (especificamente nocaute DMEM) com substituição de soro xeno-livre de 15% (spesifically CTS nocaute SR XenoFree), 2 mM L-glutamina, 0,1 mM 2 - Mercaptoetanol, 1% não aminoácidos essenciais e 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Utilize o meio de indução basais dentro de duas semanas.
    2. Prepare a mídia para indução da córnea na cultura de suspensão.
      1. Dia 1: Suplemento meio de indução basal com 5 μM de blebbistatin.
      2. Dia 2: Completar o meio basal de indução com 10 µM SB-505124 e 50 ng/mL humano básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF).
      3. Dia 3-4: meio de indução basal de suplemento com 25 ng/mL Proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4).
    3. Preparar o meio de diferenciação do epitélio corneano (meio de diferenciação, especificamente CnT-30) para cultura aderente: adicionar suplementos ao meio basal de acordo com as instruções do fabricante e adicionar 50 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: A formulação média de diferenciação é sensível à luz. Utilize o meio de diferenciação completados dentro de 6 semanas a contar da data de suplementação.
    4. Casaco de pratos de cultura de tecidos de 100 mm para diferenciação aderente (ver passo 2.3) com uma mistura de 5 µ g/cm2 humano placentário colágeno tipo IV (col. IV) e 0,5 µ g/cm2 LN-521, diluído em 1 x DPBS que contém Ca2 + e Mg2 +, em um total revestimento de volume de 5 mL por prato. Preparar e armazenar os revestimentos com col IV e LN-521, conforme descrito em 1.1.1.3.
  2. Etapa i: indução da córnea na cultura de suspensão
    1. Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
    2. Desanexe FF hPSCs a suspensão de célula única com xeno-livre do trypsin-EDTA conforme as instruções em passos 1.3.2.1–1.3.2.6. Contar as células e distribuir 2-3 x 106 células por fixação baixo 6 placa no volume total de 3 mL de meio de indução basal suplementado com 5 blebbistatin μM para induzir a formação de EB noite, a 37 ° C, 5% CO2 (1 dia).
    3. No dia seguinte (dia 2), remova o meio e substitua com 3 mL de meio de indução basal suplementado com 10 µM SB-505124 e 50 ng/mL bFGF.
    4. Sobre os seguintes dois dias (dias 3-4), retire o meio e substitua com 3 mL de meio de indução basal suplementado com 25 ng/mL BMP-4.
  3. Etapa II: A diferenciação da córnea na cultura aderente
    1. Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
    2. No dia 5, placa da EBs para baixo para pratos de cultura de tecidos de 100 mm revestidos com 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521.
      1. Remover a solução de revestimento de pratos de cultura de tecidos de 100mm e adicionar 10 mL de meio de diferenciação pré-aquecido por prato.
        Nota: Não deixe a louça secar como LN-521 irá inativar após secagem.
      2. Transferir o EBs de uma placa de 6 bem para dois a três pratos de cultura de tecidos de 100 mm (aproximadamente 50 EBs por cm2) pipetando. Distribua uniformemente o EBs por agitação suave.
    3. Manter as células em cultura aderente a 37 ° C, 5% CO2, substituindo o meio com 10 mL de meio fresco diferenciação três vezes por semana (na segunda, quarta e sexta-feira) para as próximas semanas de 2,5 – 3. Verifique as células regularmente para o surgimento da correta morfologia epitelial usando o microscópio de contraste de fase.
  4. Passo III: Cryo-bancário hPSC-derivado LESCs
    1. Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar, exceto para o meio de criopreservação que deve ser previamente refrigerado.
    2. Desanexar hPSC-derivado LESCs com xeno-livre do trypsin-EDTA e contar as células, como instruído para FF hPSCs em etapas 1.3.2.1–1.3.2.6, mas usando o meio de diferenciação.
      Nota: Para LESCs hPSC-derivado, tempo de incubação ideal com xeno-livre do trypsin-EDTA é mais longo (cerca de 5 min). Uso 3 mL de xeno-livre do trypsin-EDTA e inibidor de tripsina definidos por prato de 100 mm.
    3. Depois de contar as células, centrifugação repetição durante 5 min à 300 x g, Aspire médio e resuspenda o pellet de células em meio de criopreservação hPSC pre-refrigerados, xeno-livre. Pipetar o single cell suspensão em cryotubes, para que cada criotubo contém 0.5 a 1 x 106 células em 1 mL de meio de criopreservação.
    4. Coloque os tubos em um recipiente de congelação e transferência imediatamente (dentro de 5 min) a-80 ° C durante a noite.
    5. No dia seguinte, transfira os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
  5. Etapa IV: Descongelar os Shipper hPSC-LESCs
    1. Antes de descongelar, revesti as placas de pratos/bem com 5 col de2 µ g/cm IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521.
    2. Pré-aquecer todos os materiais necessários e reagentes para RT do capuz de fluxo laminar.
    3. Remover a solução de revestimento de pratos/poços e adicionar o volume apropriado de médio pré-aquecido diferenciação.
      Nota: Não deixe a louça secar como LN-521 irá inativar após secagem.
    4. Descongelar as células rapidamente ao RT e transferir imediatamente a suspensão de células para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo 5 mL de meio de diferenciação previamente aquecido.
    5. Centrifugar a suspensão de eritrócitos por 5 min a 300 x g, aspirar e resuspenda o pellet em meio de diferenciação para remover qualquer meio de criopreservação.
    6. Placa das células para pratos/Poços revestidos com 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521, no meio de diferenciação em uma densidade de 40.000 – 50.000 células/cm2. Manter as células a 37 ° C, 5% CO2, substituindo o meio de diferenciação três vezes por semana.

3. fenotipagem de hPSC-derivado LESCs

  1. Análise qualitativa da imunofluorescência
    1. Por imunofluorescência, revestimento de poços de placa de 12 ou 24 --bem com 5 µ g/cm2 col IV e 0,5 µ g/cm2 LN-521 e placa/descongelamento hPSC-LESCs no meio de diferenciação em uma densidade de 40 000 a 50 000 células/cm2.
    2. Quando chegaram a confluência das culturas, consertar as células com paraformaldeído 4% (PFA): lavar os poços duas vezes com 1 x DPBS sem Ca2 + e Mg2 +e incubar 15-20 min com 4% PFA em RT Depois disso, lave duas vezes com 1 x DPBS para remover eventuais resíduos PFA. Uso de 0,5-1 mL de soluções por bem.
      Nota: Células fixas podem ser armazenadas em 1 x DPBS a 4 ° C por até uma semana antes da coloração.
      Cuidado: PFA é tóxico e corrosivo. Lidar com PFA em uma coifa e usar roupas de proteção, óculos de proteção e luvas.
    3. Aspire 1 x DPBS e permeabilize membranas celulares incubando por 10-15 min com 0,1% Triton X-100 em 1 x DPBS.
    4. Aspire 0,1% Triton X-100 e bloco anticorpos inespecíficos locais obrigatórios incubando por 1h com 3% albumina de soro bovino (BSA) em 1 x DPBS em RT. Prepare diluições de anticorpo primário em 0,5% BSA em 1 x DPBS.
      Nota: Consulte a tabela 1 para os anticorpos primários recomendados.
    5. Aspire 3% BSA e incubar com anticorpo primário apropriadamente diluído durante a noite a 4 ° C.
    6. Lavar os poços 3 x por 5 min com 1 x DPBS. Prepare diluições de anticorpo secundário em 0,5% BSA em 1 x DPBS.
      Nota: Consulte a tabela 1 para anticorpos secundários recomendados.
    7. Aspirar 1 x DPBS e incubar com anticorpo secundário apropriado, devidamente diluído por 1h no RT, protegido da luz.
      Nota: Este passo no, mantenho as amostras protegidas da luz, a fim de evitar o desbotamento das tinturas fluorescentes.
    8. Lavar os poços 3 x por 5 min com 1 x DPBS e, finalmente, núcleos de corante de contraste com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e monte com fluorescência meios de montagem. DAPI pode ser usado separadamente de acordo com as instruções do fabricante ou incluído no meio de montagem. Lugar redondo lamelas (placas de diâmetro 19 mm e 13 mm para 12 e 24-poços, respectivamente) em cada poço. Siga as instruções do fabricante sobre secagem e armazenamento das amostras montadas.
    9. Imagem das células coradas com um microscópio fluorescente.
  2. Análise quantitativa da imunofluorescência
    1. Prepare amostras de cytospin de LESCs hPSC-derivado objeto óculos.
      1. Desanexar hPSC-derivado LESCs com xeno-livre do trypsin-EDTA e contar as células, conforme instruído na etapa 2.4.2.
      2. Depois de contar, adicione 1 x DPBS pre-refrigerados e centrifugar durante 5 min à 300 x g. ajustar o volume da amostra e concentração de células de acordo com as instruções do fabricante do cytocentrifuge dado, por exemplo, 50.000-100.000 células em um volume de 150 µ l de amostra.
      3. Girar as células até óculos de objeto com um cytocentrifuge , por exemplo, 5 min à 28 x g e correção imediatamente para 15-20 min com 4% PFA em 1 x DPBS no RT Para a fiação recomendada tempo e velocidade, consulte o manual de instruções do cytocentrifuge determinado.
    2. Prossiga para a coloração das amostras cytospin conforme descrito em etapas 3.1.3–3.1.8 uso bloqueador líquido caneta rodeiam as amostras com um círculo hidrofóbica e realizar a coloração de um droplet para prática econômica. Lavagens podem ser realizadas em recipientes com suportes de lâmina, para garantir a remoção eficiente de anticorpos em excesso e coloração de fundo mínimo. Counterstain núcleos com DAPI e montar as amostras coradas com fluorescência mídia, cobrindo com lamelas de montagem. Siga as instruções do fabricante sobre secagem e armazenamento das amostras montadas.
    3. Capture imagens de 5-10 por exemplo de locais selecionados aleatoriamente, usando por exemplo 10 X ampliação de um microscópio de fluorescência.
    4. Estime a percentagem de células coradas positivamente em relação ao totais células (DAPI positivo), por exemplo, com ferramentas de software (https://imagej.nih.gov/ij/) análise e processamento de imagem do ImageJ. De preferência analisar > 500 células por amostra.
      1. Abra a imagem a ser analisados no software ImageJ. Duplique a imagem e o filtro com Desfoque Gaussiano padrão para remover o ruído.
      2. Crie um limite. Ajustar os valores de limiar para seleção ideal de núcleos de células coradas positivamente e aplicar. Agora, a imagem duplicada é convertida para uma visão binária.
      3. Processo a imagem binária com processamento binário ferramentas "Buracos de preenchimento" e "Divisor de águas", que automaticamente vai separar áreas mescladas representando núcleos único.
      4. Use a ferramenta de "Partículas de Analyze" para automaticamente lista regiões de interesse (ROIs) para a janela de Gerenciador de ROI, que irá abrir após aplicar o comando. Feche a imagem binária.
      5. Visualize o ROIs na imagem original, escolhendo "Mostrar tudo" no Gerenciador de ROI. Confirmar seleção correta dos núcleos de células coradas e, se necessário, manualmente remover e adicionar seleções individuais.
  3. Análise de citometria de fluxo
    1. Para confirmar os níveis de expressão p63α, manche as células por citometria de fluxo.
      1. Desanexar hPSC-derivado LESCs com xeno-livre do trypsin-EDTA e contar as células, conforme instruído na etapa 2.4.2.
      2. Lave as células duas vezes com 1 mL previamente refrigeradas 1 x DPBS e centrifugar durante 5 min à 300 x g. Fix e permeabilize com solução de fixação/permeabilização de ready-to-use para 20 min a 4 ° C. Depois disso lave as células duas vezes com 1 mL pre-refrigerados 1x permeabilizing tampão de lavagem.
        Nota: Este passo no, mantenho as células a 4 ° C ou em gelo, salvo indicação em contrário.
      3. Cuidado: Solução de fixação/permeabilização contém formaldeído de 4,2%. Lidar com a solução perigosa em uma coifa e usar roupas de proteção, óculos de proteção e luvas.
      4. Divida as amostras em tubos de polipropileno de 5 mL. Cada amostra deve conter 100.000-200.000 células e o volume da amostra deve ser ajustado para cerca de 100 µ l de tampão de lavagem 1X.
      5. Adicionar 2 µ l de fluorocromo conjugado anticorpo de FACS p63-α (para anticorpo recomendado, consulte tabela de equipamentos e materiais) para os tubos de amostra. Deixe uma amostra inocente para servir como controle negativo. Vórtice as amostras e incubar durante 1 h em RT, protegido da luz.
      6. Lavar as células duas vezes com 1 mL de pre-refrigerados 1x tampão de lavagem e por último, resuspenda as pelotas com 300 µ l de tampão. Armazene os tubos em gelo, protegido da luz.
    2. Analise as amostras com um citômetro de fluxo. Use as amostras de controlo negativo imaculado para retenção da população celular correto e excluindo o sinal de fundo fluorescente. Analisar um mínimo de 10.000 p63-α-manchado de células. Para implementação técnica detalhada, por favor consulte o manual do utilizador do citômetro de fluxo determinado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hPSCs para hPSC-LESCs

Todo o processo de induzir a diferenciação de FF hPSCs para cryostoring hPSC-LESCs leva cerca de 3,5 semanas. Visão esquemática do método de diferenciação, destacando suas etapas-chave é apresentada na figura 1A. A figura 1B mostra morfologias típicas de populações de células em diferentes fases do protocolo. Os dados apresentados são obtidos com R...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O resultado esperado deste protocolo é a geração bem sucedida e robusta de LESCs de uma suspensão de célula única do FF hPSC dentro aproximadamente 3,5 semanas. Como o epitélio corneano se desenvolve a partir do ectoderma de superfície29, o primeiro passo do protocolo visa hPSCs para esta linhagem de direção. Uma indução curto 24 h com a transformação de fator de crescimento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 e bFGF são utilizados para induzir a diferenciação ectodérmica, seguida por mesodérmica s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo foi apoiado por Academia da Finlândia (número de concessão 297886), o programa de peças humanas de Tekes, o finlandês agência de financiamento para tecnologia e inovação, o olho finlandês e Fundação do banco de tecido e Fundação Cultural finlandesa. Os autores graças os técnicos de laboratório biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt e Outi Heikkilä para assistência técnica excelente e contribuição para a cultura de células. Professor Katriina Aalto-Setälä é reconhecido para fornecer a linha de hiPSC usado e facilidade de BioMediTech Imaging Core para fornecendo equipamentos para tratamento de imagens de fluorescência.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagente
1x DPBS contendo Ca2+ e Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS sem Ca2+ e Mg2+Lonza#17-512F/12
Placa de cultura de células de 100 mmCorning CellBIND#3296Formato de vaso de cultura para hPSC-LESC aderente diferenciação
Placa de 12 poçosCorning CellBIND#3336Formato de vaso de cultura para amostras de FI
Placa de 24 poçosCorning CellBIND#3337Formato de vaso de cultura para amostras de FI
2-mercaptoetanolGibco#31350-010
Placa de 6 poços, acessório ultrabaixoCorning Costar#3471Formato de vaso de cultura para indução em suspensão cultura
Alexa Fluor 488 anti-rato IgThermoFisher Scientific#A-21202Anticorpo secundário para IF
Alexa Fluor 488 anti-coelho IgThermoFisher Scientific#A-21206Anticorpo secundário para IF
Alexa Fluor 568 anti-cabra IgThermoFisher Scientific#A-11057Anticorpo secundário para IF
Alexa Fluor 568 anti-rato IgThermoFisher Scientific#A-10037Anticorpo secundário para
fator de crescimento de fibroblastos IF Basic (bFGF, humano)PeproTech Inc.#AF-100-18BAnimal-Free Humano Recombinante FGF-básico (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization SolutionBD Biosciences#554722Solução de fixação e permeabilização para citometria de fluxo
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Tampão de lavagem para citometria de fluxo
BlebbitatinaSigma-Aldrich#B0560
Proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Albumina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Anticorpo de citoqueratina 12Santa Cruz Biotechnology#SC-17099Anticorpo primário para IF
Citoqueratina 14 anticorpoR& D Systems#MAB3164Anticorpo primário para
anticorpo IF Citoqueratina 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-PAnticorpo primário para IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Meio de cultura para diferenciação aderente hPSC-LESC
Colágeno tipo IV (humano)Sigma-Aldrich#C5533Colágeno placentário humano tipo IV
CoolCell LX Recipiente de congelamentoSigma-Aldrich#BCS-405
Tubos CryoPureSarsted#72.380Criotubo de 1,6 mL para criopreservação de hPSC-LESC
Inibidor de tripsina definidoGibco#R-007-100
Kit médio Essential 8 FlexThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminina 521Biolamina#Ln521Laminina recombinante humana 521
Δ Np63&alfa; anticorpoBioCare Medical#4892Anticorpo primário para anticorpo IF
OCT3/4R& D Systems#AF1759Anticorpo primário para IF
p63α anticorpode sinalização celular#ACI3066AAnticorpo primário para IF
p63-&alfa; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugado)Tecnologia de Sinalização Celular#56687p63-&alfa; Anticorpo conjugado com PE para citometria de fluxo
Anticorpo PAX6Sigma-Aldrich#HPA030775Anticorpo primário para
IF Penicilina/EstreptomicinaLonza#17-602E
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich#158127Fixador de células para IF
ProLong Gold Antifade Mountant com DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI mountant para disco montagem para
IF PSC Cryopreservation KitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s Águia modificada' s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM aminoácidos não essenciaisGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Agente de permeabilização para IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI mountant para montagem líquida para IF
strong>NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Citocentrífuga, e.g. CellSpin IITharmac
Citômetro de fluxo, por exemplo BD Accuri C6BD Biosciences
Microscópio de fluorescência, e.g.Olympus IX 51Olympus
Tecnologia <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles