Aparelhos para colheita de tecido Microcolumns

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para a produção de colheita agulhas que podem ser usadas para coletar tecido cheio-espessura da pele sem causar o doador do site cicatrizes. As agulhas podem ser combinadas com um sistema de coleta simples para atingir alto volume de colheita.

Resumo

Este manuscrito descreve o processo de produção para um aparelho de laboratório, feito de componentes de prateleira, que podem ser usados para coletar a microcolumns dos tecidos da pele de espessura total. O tamanho pequeno da microcolumns permite aos doadores sites curar rapidamente sem causar local doador, cicatrizes, durante a colheita de tecidos da cheio-espessura permite a incorporação de todos os componentes celulares e extracelulares dos tecidos da pele, incluindo aqueles associados com regiões dérmicas profundas e as estruturas dos anexos da pele, que ainda precisa com sucesso ser reproduzido usando tecido convencional, técnicas de engenharia. O microcolumns pode ser aplicado diretamente em feridas de pele para aumentar a cura, ou podem ser usados como fonte de células/tecidos autólogos para outras abordagens de engenharia de tecidos. As agulhas de colheita são feitas, modificando o padrão de agulhas hipodérmicas, e podem ser usados sozinho para colheita de pequenas quantidades de tecido ou juntamente com um sistema simples baseado em sucção coleção (também feito de material de laboratório comumente disponíveis) para alto volume da colheita para facilitar os estudos em modelos animais grandes.

Introdução

Enxerto de pele autólogo é o esteio de reparação da ferida, mas é limitada pela escassez de sítio doador e morbidade, levando a esforços concertados nas últimas décadas para desenvolver novas opções terapêuticas para substituir o enxerto de pele convencional^1,2 . Recentemente desenvolvemos um método alternativo de colheita da pele para aproveitar os benefícios do enxerto de pele de espessura total, minimizando a morbidade do sítio doador. Através da recolha de pele de espessura total na forma de pequenas (~0.5 mm de diâmetro) "microcolumns", locais de doadores são capazes de curar rapidamente e sem cicatrizes em circunstâncias normais (para possíveis exceções, consulte a seção de discussão abaixo)³. Microcolumns pode ser aplicado diretamente na ferida camas para acelerar o fechamento da ferida, reduzir a contração³e restaurar uma variada gama de tipos de células epidérmicas e dérmicas e estruturas funcionais dos anexos⁴, muitas das quais são carentes de enxerto de pele de espessura dividida convencional ou de substitutos de pele de bioengenharia atual⁵. A capacidade de microcolumns para aumentar a cura e de seus sites de doador para curar sem cicatriz ambos independentemente validados por outros grupos de pesquisa^6,7.

Anteriormente, nós desenvolvemos um sistema de abate de laboratório para permitir que a coleção de microcolumns na escala⁸; no entanto, este sistema é composto de muitos componentes personalizados que não estão amplamente disponíveis. Aqui, descrevemos em detalhe o processo para produzir colheita agulhas, bem como sistemas de simples coleta, feita a partir principalmente componentes prontos para uso, que podem ser usados para atingir alto volume de colheita. Os aparelhos descritos neste manuscrito é apropriado para in vitro e em animal trabalho, mas não para uso em seres humanos. Um dispositivo clínico com autorização da FDA para a aplicação desta técnica em seres humanos é comercialmente disponível, mas não será discutido em detalhe aqui.

Protocolo

Todo o trabalho envolvendo animais vivos e amostras de tecido animal foram aprovadas pelo Comitê de uso (IACUC) e Massachusetts General Hospital institucional Cuidado Animal.

1. produção de colheita agulhas

1. Instalação da fase de produção
   1. Fixar um conector luer fêmea bloqueio de um post e montar o post para um palco de rotação, de modo que o conector luer-lock é o centro do palco (Figura 1A).
   2. Nesta primeira fase de rotação uma posição verticalmente e montá-lo perpendicularmente sobre um palco de rotação horizontal, segunda (Figura 1B).
   3. Monte o palco de rotação horizontal sobre um estágio da tradução de dois eixos (Figura 1B).
   4. Aperte a combinação em uma superfície estável, como uma experimentação ótica.
   5. Separadamente, monte uma ferramenta rotativa para a mesma tábua de pão, com a ferramenta posicionada em paralelo com a experimentação e a aproximadamente a mesma altura que o conector de bloqueio luer na fase de combinação de rotação e tradução (Figura 1C).
   6. Instalar dois discos de corte concêntrica para a ferramenta rotativa (um grão menor, menor corte diamantado sobre um disco de corte de pedra de grão maior, maior) (Figura 1D).
      Nota: Sobre uma 9 mm a diferença entre os diâmetros das duas rodas é geralmente suficiente.
   7. Posição de uma luz a sobrecarga da fonte com um braço ajustável sobre a ferramenta rotativa, com a luz que visam as rodas de corte.
   8. Para melhorar a visualização, posicione um microscópio dissecação sobre a instalação de produção para que o ocular está focada sobre os discos de corte (Figura 1C).
      Nota: Como alternativa, os usuários podem usar óculos de ampliação.
2. Remodelando a ponta da agulha
   1. Use óculos de proteção e uma máscara cirúrgica para impedir que partículas finas de metal entre os olhos ou vias respiratórias.
   2. Escolha de agulhas hipodérmicas do apropriado medir o tamanho, com base nos requisitos experimentais.
   3. Marque o comprimento pretendido em cada colheita de agulha.
      Nota: Para a colheita de pele suína, agulhas de 8 mm são normalmente suficientes; embora, o comprimento pode variar com base nas necessidades experimentais (EG., espessura do tecido-alvo da pele, tamanho do calibre de agulha). Geralmente, uma agulha de calibre 19 funciona bem para a pele de porco.
   4. Abaixe a agulha perpendicularmente à ferramenta rotativa com o poder, usando a borda do disco externo de corte para cortar o excesso de comprimento da agulha, no ponto marcado no passo 1.2.3.
   5. Conecte a agulha romba, encurtada ao conector luer fêmea de bloqueio na fase de produção.
   6. Ajuste a fase de rotação horizontal, para que a agulha está em um ângulo de 12° paralelo para os discos de corte da ferramenta rotativa (mudando o ângulo impactará a força necessária para a inserção da agulha).
   7. Ligue a luz aérea e ajustar sua posição enquanto observa a agulha sob a ampliação, até que a luz é refletida fora da linha mediana (longitudinal) da agulha.
   8. Poder da ferramenta rotativa e, em seguida, uso o estágio da tradução para fazer avançar a agulha para o interior (diamante) corte disco(Figura 2).
   9. Continue avançando a agulha lentamente contra o disco de corte até que o disco de corte atinge aproximadamente a linha média da agulha (como visualizada pela reflexão da luz aérea ao longo da linha mediana).
   10. Mova lentamente a superfície de corte da agulha do disco de diamante interior sobre a roda exterior de pedra para terminar a superfície de corte da agulha com um esmalte mais fina (Figura 2B).
   11. Retire a agulha longe o disco de corte.
   12. Usando a fase de rotação vertical, gire a agulha de 180°.
   13. Repita as etapas 1.2.9-1.2.10 para reformatar o outro lado da agulha.
       Nota: A agulha deve ter agora duas dicas de corte de comprimento aproximadamente igual (Figura 2 e 2D).
   14. Remova a agulha da fase de produção.
   15. Limpo dentro do furo com um fio de metal que é ligeiramente menor do que o diâmetro interior da agulha.
   16. Usando uma vara de madeira afiada (ex., encaixando a extremidade da vara de madeira pequena em um aplicador de ponta de algodão), remova quaisquer rebarbas que podem ainda ser anexadas às bordas da agulha recém formado.
       Nota: Colheita de agulhas pode ser eletropolido e esterilizados em autoclave, se necessário.

2. colheita de tecido da pele

1. Use as agulhas de colheita para coletar microcolumns pele de tecido ex vivo ou animais vivos.
2. Para pele ex vivo , tecido que é fino (especialmente a partir de amostras onde a gordura subcutânea está faltando ou foi aparada fora), segure o tecido-alvo sobre a abertura de um tubo de centrífuga de 50 mL, ou empilhar dois pedaços de tecido em cima do outro, para não danificar o n Dicas de eedle batendo neles contra superfícies duras.
   Nota: No vivo colhendo de animais vivos, é recomendável que a epinefrina e lidocaína local ser administrado por injeção intradérmica para analgesia e reduzir o sangramento.
3. Monte o aparelho de colheita de acordo com a quantidade de microcolumns necessária, conforme descrito abaixo.
4. Opção de baixa e média de volume:
   1. Para colher pequenas a médias quantidades de microcolumns, basta encher uma seringa padrão (10-20 mL seringas geralmente funcionam bem) com solução salina normal e conectá-lo a uma agulha de colheita.
   2. Completamente, insira a agulha de colheita na pele do doador, em seguida, recolhê-la.
   3. Empurre o êmbolo da seringa para liberar solução salina através da agulha de colheita e expulsar o microcolumn que está alojado no furo da agulha.
   4. Para acelerar o processo de colheita, repita a etapa 2.4.2 3 a 5 vezes antes de expulsar o microcolumns no passo 2.4.3.
      Nota: É conveniente geralmente expulsar o microcolumns em um coador de célula padrão para facilitar a coleção subsequente de microcolumns.
   5. Se as agulhas ficarem entupidas, aumente a pressão sobre o pistão para expelir o tecido furado e remover a obstrução. Se simplesmente aumentando a pressão é insuficiente, inserir um fio de metal através da abertura de ponta de agulha para a desobstruir a agulha do furo.
   6. Manter o microcolumns submergida em salina ou médio até o uso para evitar a dessecação.
      Nota: Com um operador experiente, o método descrito acima pode ser usado para colher microcolumns a uma taxa de aproximadamente 1 microcolumn por segundo.
5. Opção de alto volume:
   1. Crie um dispositivo de sucção assistida simples que pode ser construído para facilitar a recolha de grandes quantidades de microcolumns.
      Nota: O dispositivo consiste de uma agulha de colheita, seringa de 20 mL com bico de fechamento de luer, sucção adaptador normalmente usado para lipoaspiração(Figura 3)e o tubo de aspiração estéril.
   2. Remova o êmbolo da seringa de 20 mL.
   3. Ligue a seringa a um adaptador de aspiração.
   4. Complete a montagem, anexando uma colheita agulha à seringa (Figura 3B).
   5. Use um pedaço de tubo de aspiração estéril para conectar o adaptador de aspiração para uma vasilha de aspiração estéril. Certifique-se de que aparato colheita está ligado a uma entrada de caixa que permite que o fluido a fluir para o cilindro desimpedido (que pode exigir a conexão a uma porta da vasilha que está marcada para a saída, ao invés de afluência).
   6. Ligue o aparelho a uma fonte de pressão negativa.
      Nota: A pressão exigida depende de agulha de diâmetro e comprimento, como descrito anteriormente⁸. Para os aparelhos descritos neste manuscrito, o sistema de sucção encontrado em salas de operação típicas é geralmente suficiente.
   7. Conecte uma colheita agulha à seringa.
   8. Colheita da microcolumns, inserindo a colheita da agulha na pele.
      Nota: O microcolumns estará desenhado para a seringa de sucção, então liberado no tubo sucção.
   9. Intermitentemente, mergulhe a colheita agulha em um recipiente de solução salina estéril durante o procedimento de colheita para lavar o sistema.
      Nota: Esta salina facilita transporte da microcolumn e garante que eles manter-se hidratado. Alternativamente, um adaptador luer de QFP pode ser conectado ao conector luer lock da seringa e através de uma tubulação de conexão, também para um saco de soro de enforcamento.
   10. Tenha à mão um fio de metal, ou menor medidor de agulha, que é ligeiramente menor do que o diâmetro interior da agulha a colheita. Se a agulha ficar entupida, ela pode ser desmarcada inserindo o arame no furo da agulha.
   11. Quando a quantidade desejada de microcolumns acumuladas na vasilha, desligue o dispositivo de sucção, em seguida, despeje o conteúdo do tubo sucção para fora através de um filtro para recolher os microcolumns.
6. Após a colheita, aplica uma pomada antibiótica sobre os sites de doador.
   Nota: Curativos adicionais geralmente não são necessários para sites de doador.

Resultados

As agulhas de colheita devem ser capazes de coletar microcolumns cheio-espessura dos tecidos da pele com aproximadamente uma taxa de sucesso de 80-90%, e cada microcolumn deve conter a epiderme, derme e alguma gordura subcutânea (Figura 4). Se a taxa de sucesso de colheita é baixa, ou se torna-se difícil inserir uma agulha no tecido, em seguida, uma agulha nova provavelmente é necessária. Se a taxa de sucesso para a colheita é consistentemente baixa, mesmo co...

Discussão

Os métodos descritos aqui destinam-se para permitir que a coleção de tecido microcolumns em quantidades suficientes na vivo grandes estudos em animais, usando ferramentas feitas de suprimentos de laboratório disponíveis comercialmente. Este aparelho tem sido usado anteriormente na colheita do tecido da pele humana extirpado^4,9 , bem como de pele suína ao vivo³. Os parâmetros específicos descritos são aqueles que foram encontrados ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Roda diamantada	Dremel	545
Agulha hipodérmica (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Outros tamanhos de agulha podem ser usados, dependendo das necessidades experimentais
Roda de pedra	Seringa Dremel	540
(20mL com trava luer)	Fisher Scientific	22-124-967
Adaptador de sucção	Tulip Medical	PA20BD	Opcional, para colheita de alto volume
Recipiente de sucção	Fisher Scientific	19-898-212	Opcional, para colheita de alto volume. Esterilize antes de usar.
Tubo de sucção	Medline	DYND50216H	Opcional, para colheita de alto volume