Geração de células humanas de células germinativas, como Primordial na superfície dos órgãos do Embryoid de aprontado-pluripotência induzida por células estaminais pluripotentes

Resumo

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de esperma e de ovos. PGCs embrionárias humanas são especificados de células do epiblasto pluripotentes através de interações de citocinas. Aqui, descrevemos um protocolo de 13 dias de induzir células humanas transcriptomally PGCs assemelhando-se à superfície dos órgãos do embryoid de células-tronco pluripotentes aprontado-pluripotência induzida.

Resumo

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de todas as células da linha germinal. Em embriões de rato, uma população fundadora de ~ 40 PGCs são induzidas de células do epiblasto pluripotentes por exposições orquestradas de citocinas, incluindo a Proteína morfogenética óssea 4 (Bmp4). Em embriões humanos, os primeiros PGCs foram identificados na parede do saco vitelino por volta do final da semana de gestação 3^rd endodermal, mas pouco se sabe sobre o processo de especificação de PGC humana e seu desenvolvimento precoce. Para contornar as barreiras técnicas e éticas de estudar PGCs embrionárias humanas, modelos de cultura celular substituto foi recentemente gerados de células-tronco pluripotentes. Aqui, descrevemos um protocolo de 13 dias para a produção de robusta de células PGC-Like humanas (hPGCLCs). Células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) mantidas no estado de pluripotência aprontada são incubadas no ingênuo 4i reprogramação médio por 48 horas, dissociadas de células únicas e embaladas em poços da microplaca. Manutenção prolongada de hiPSCs no estado de pluripotência ingênuo provoca aberrações cromossômicas significativas e deve ser evitada. hiPSCs aos micropoços são mantidas por um adicional 24 horas a médio 4i corpos de forma do embryoid (EBs), que são então cultivadas em baixa aderência plasticware sob uma condição de balanço no meio de indução de hPGCLC, que contém uma alta concentração de BMP4 humana recombinante. EBs são mais cultivadas por até 8 dias na condição de balanço, não aderente, para obter o máximo rendimento de hPGCLCs. Por imuno-histoquímica, hPGCLCs são facilmente detectados como células expressando fortemente OCT4 em quase todos os EBs exclusivamente em sua superfície. Quando EBs são enzimaticamente dissociada e submetido ao enriquecimento de FACS, hPGCLCs podem ser coletados como CD38 + células com até 40-45% de rendimento.

Introdução

As células germinativas primordiais (PGCs) são precursores comuns de todas as células da linha germinal em ambos os sexos. A maioria de nosso conhecimento sobre o desenvolvimento do PGCs em embriões de mamíferos foi obtido através do estudo de^1,de ratos de laboratório². No dia embrionário 6.0-6.5 de embriões de rato, 6 ou similar um número pequeno de precursores PGC está localizado no epiblasto e uma população de fundador de ~ 40 que PGCs são induzidas a partir deles de forma dependente de proteínas morfogenéticas ósseas Bmp2 e Bmp4 secretada de adjacentes células. Os primeiros PGCs humanas até agora identificados em embriões foram na parede do saco vitelino por volta do final da terceira semana de gestação³endodermal. Porque esse é o mesmo lugar como migrar PGCs são observadas em embriões do rato, é provável que o PGCs humanas observados foram o caminho de migração, mas não a população fundadora. No entanto, estudos de rastreamento volta a estágios anteriores do PGCs ou PGC precursores em embriões humanos desapareceram.

Acesso ao PGCs embrionárias humanas é um desafio devido a obstáculos técnicos e éticos. Para superar estes obstáculos, modelos de cultura celular de PGC-como foram recentemente gerados a partir de células-tronco pluripotentes humanas (EPS). Pluripotência é a capacidade celular de se diferenciarem no germline e três camadas germinativas embrionárias⁴. Considerando que PSCs humanos mantiveram-se no meio de mTeSR1 (ready-to-use, comercialmente disponível meio formulado para manutenção das EPS humanas no estado de pluripotência aprontada) em pratos revestidos com as proteínas da matriz extracelular tem aprontado-estado pluripotência ⁴, em 2013, laboratório de Jacob Hanna mostrou que as células de pluripotência aprontada podem ser convertidas em um estado de pluripotência ingênuo, expondo o meio de célula-tronco humana ingênua (NHSM) contendo químicos inibidores de quinases de proteínas ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC, e p38 MAPK, bem como fatores de crescimento LIF, TGF, bFGF⁵. Partir os PSCs humana ingênua-pluripotência, em 2015, um grupo de investigação conduzido por Hanna e Azim Surani realizado a primeira produção de robusta de células humanas de PGC-Like (hPGCLCs) de EPS⁶. Vários outros laboratórios, incluindo a nossa, relataram mais tarde, geração de hPGCLCs de EPS usando protocolos ligeiramente diferentes^7,8,9,10. Nosso estudo apresentou provas que hPGCLCs gerados usando protocolos diferentes (que são resumidos na tabela S1 de nosso estudo anteriormente publicado¹⁰) são transcriptomally semelhante ao outro¹⁰. Evidência disponível suporta a semelhança de PGCLCs humanos para fase inicial humanas PGCs embrionárias antes do apagamento epigenéticas global⁷ e/ou migração quimiotáctica¹⁰.

Estudos de mouse PGCs embrionárias, rato PGCLCs e PGCLCs humanos (mas apenas com acesso muito limitado aos humanos PGCs) revelaram que os mecanismos moleculares da especificação PGC diferem significativamente entre mouse e humano^{1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17}. Por exemplo, Prdm14 tem um papel crítico na especificação de PGC em embriões de rato, mas seu papel na especificação de PGC humana parece limitada^1,15. Em contraste, a indução de SOX17 por EOMES é essencial para PGC especificação^6,11,14, Considerando que esses fatores de transcrição parecem dispensáveis para rato PGC especificação¹⁵. Estes primeiros resultados de estudos usando hPGCLCs fortemente apoiar a importância desse modelo de cultura celular como um substituto do PGCs embrionárias humanas.

Estudos publicados recentemente, envolvendo avaliação de sequenciamento profunda do nosso laboratório de DNA cópia número análise genômica, têm mostrado que a manutenção prolongada das EPS no estado de pluripotência ingênuo aumenta significativamente o risco de instabilidade cromossômica e anomalias estruturais. Este fenômeno foi observado com rato¹⁸ e humano¹⁹ EPS. O protocolo de produção original hPGCLC relatado por Hanna/Surani foi desenvolvido para PSCs humanos mantidos na meio de pluripotência 4i ingênuo pelo menos 2 semanas⁶. Para preservar o cariótipo diploide normal de humanos PSCs e PGCLCs, desenvolvemos um protocolo modificado no qual PSCs humanas são expostos para o meio 4i para apenas 72 horas¹⁰, que é apresentada neste artigo. IPSCs humanas (hiPSCs) são mantidas sob o estado de pluripotência condicionadas. Imediatamente antes da formação do EB, as células são incubadas a ingênua 4i médio de reprogramação (um meio NHSM modificado) por 48 horas. Células são então dissociadas e embaladas em poços da microplaca para formar EBs para um adicional de 24 horas no meio 4i. EBs são mantidas em meio de indução de hPGCLC que contém uma alta concentração de BMP4 humana recombinante sob uma condição de balanço para a cultura do não-apego por até 8 dias para obter o máximo rendimento de hPGCLCs. Após 8-cultura EB, hPGCLCs pode ser isolado de células dissociadas do EB por FACS como CD38 + células com até ~ 40% de rendimento em suspensão de célula única FACS-classificáveis. Considerando que outros publicados métodos^7,8,9, incluindo o protocolo original antes de nossas modificações⁶, tipicamente gerar hPGCLCs em agregados de células formado espontaneamente sem específicos localização, hPGCLC produzido por nosso protocolo são observados na superfície dos órgãos do embryoid (EBs).

Protocolo

1. células cultura de hiPSCs no estado de pluripotência Primed

1. Preparação de pratos revestido de proteínas de matriz extracelular
   1. Descongelar o Matrigel (proteínas de matriz extracelular) no gelo em um refrigerador ou um quarto frio durante a noite (Não descongele em temperatura ambiente ou usar um banho de água morna). Proteína de matriz alíquota (~ 200 μL; o volume da alíquota é determinado pelo fabricante para cada lote e indicado no rótulo do frasco) em tubos de centrífuga de baixa vincular estéril ou tubos de criopreservação de células no gelo. É importante manter a proteínas da matriz extracelular gelada durante as distribuições para evitar a solidificação. Armazenar as alíquotas a-80 ° C.
   2. Para revestir os pratos de plástico cultura celular com proteínas da matriz extracelular, diluir uma alíquota com 25 mL gelada DMEM/F12 e propagação de três pratos de 10 cm (~ 8 mL/prato). Incube os pratos à temperatura ambiente pelo menos 1 hora. Após o revestimento, os pratos podem ser selados usando Parafilm e armazenados à temperatura ambiente por até uma semana.
   3. Aspire médio de pratos imediatamente antes da inoculação de pluripotência aprontada hiPSCs. Não é necessário lavar os pratos revestidos com médio ou cálcio/magnésio-livre de fosfato salino [PBS(-)].
2. Início da cultura de hiPSC no estado de pluripotência condicionadas
   1. Adicione 2 µ l de 50mm Y27632 [inibidor de Rho-associada a proteína quinase (ROCK)] para 10 mL de meio de mTeSR1 num tubo de centrífuga de 15 mL. Prepare-se dois tubos de ROCK inibidor-completados 10 mL de meio para iniciar a cultura de células em um prato de 10 cm de 1ml congelado estoque de célula. Use o meio de Y27632-completada no mesmo dia. Escaldar médio Y27632-completados em um banho de água de 37 ° C por 5 min.
      Nota: Este protocolo funciona bem com hiPSCs mantidos em mTeSR1. Quando hiPSCs são mantidos em outros meios de comunicação apoiando o crescimento humano do PSC com diferentes graus de preparado ou ingênuo pluripotência, rendimento de hPGCLCs pode variar significativamente.
      Nota: A vida de prateleira de mTeSR1 completa é 2 semanas a 4 ° C e 6 meses a-20 ° C, mas re-congelamento causas de mau desempenho. Nós congelamos alíquotas de 40 mL de mTeSR1 a-20 ° C até o uso.
   2. Descongelar um frasco de pluripotência aprontada hiPSC congelado estoque (1,0-3,0 x 10⁶ células em 1 mL de meio de criopreservação) usando um banho-maria 37 ° C. Imediatamente após a conclusão do descongelamento, transferi todo o conteúdo de um frasco para um tubo (10 mL) do meio Y27632-suplementado escaldado.
   3. Suspensão de células centrífuga à temperatura ambiente, 300 x g por 8 min. descartar o sobrenadante e ressuspender células com 10 mL pré-aquecido Y27632-complementado do outro tubo.
   4. Espalhar uniformemente suspensão de células em um prato de 10 cm revestido de proteínas da matriz extracelular. Coloque o prato em uma incubadora tri-gás CO₂ (37 ° C, de 6,5% O₂, 5% CO₂). Manter a cultura de hiPSC sob uma pressão de oxigênio baixo.
   5. Médio de mudança (mTeSR1 sem Y27632) todos os dias. O inibidor ROCK (Y27632) é essencial para sobrevivência de hiPSC imediatamente após a dissociação de células únicas. Uma vez que hiPSCs aderir na superfície revestido de proteínas da matriz extracelular como uniformemente distribuídos pequenos agregados com > 10% confluência (que normalmente é concluída dentro de 16 horas após a inoculação), Y27632 é dispensável. Mudança média muito cedo após inoculação de dissociada hiPSCs sem Y27632 pode causar morte celular quase completa.
3. Passaging aprontadas pluripotência hiPSCs
   Nota: Passagem aprontado pluripotência hiPSCs quando colônias ocupam ~ 80% da área de crescimento efetivo. Densidades e procedimentos corretos de passagem é importante para a reprodutibilidade experimental. Temos visto que a eficiência de indução de hPGCLC não é significativamente diferente entre as culturas hiPSC 6 dias após o início de um estoque congelado (envolvendo uma ou duas passagens) ou um mês (envolvendo > 10 passagens). Indução de hPGCLC foi realizada com sucesso de hiPSCs mantida por mais de dois meses, embora a eficiência quantitativamente não foi avaliada.
   1. Tomar 4 mL da mistura de enzimas de dissociação celular num tubo de centrífuga de 15 mL e equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.
   2. Prewarm 10 mL PBS(-) em uma centrífuga de 15 mL tubo para > 5 min a 37 ° C em banho-maria.
   3. Adicione 2 µ l de 50mm Y27632 (inibidor ROCK) para 10 mL de meio de mTeSR1 num tubo de centrífuga de 15 mL. Prepare dois tubos do inibidor-completados 10 mL de meio de ROCK e usar no mesmo dia. Em outro tubo de centrífuga de 15 mL, tome 5 mL mTeSR1 sem adição Y27632. Escaldar a média + /-Y27632 em um banho de água de 37 ° C por 5 min.
      Nota: Todas as alíquotas médias preparadas na etapa 1.3.3 podem conter Y27632.
   4. Aspire o antigo médio de um células de 10 cm prato e lave uma vez com escaldadas 10 mL PBS(-). Descartar o PBS(-) e adicionar 4 mL de enzima de dissociação ao prato. Coloque o prato numa incubadora de CO₂ (incubadora de tri-gás funciona, mas não necessário) para ~ 4 min até células desanexar do fundo. Células de pipeta suavemente para cima e para baixo fazer monocelulares suspensão.
   5. Transferi hiPSC suspensão de célula única para o escaldadas tubo contendo 5 mL de meio sem Y27632 (volume total em um tubo de 15 mL é cerca de 9 mL). Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente, 300 x g por 8 min.
   6. Descartar o sobrenadante e ressuspender células com 10 mL do meio de médio escaldado, contendo Y27632.
   7. Remover agregados de células usando um coador de célula de 40 µm e determinar a densidade de pilha usando um contador de Coulter.
   8. Dilua a suspensão de células com o meio de Y27632-suplementado escaldado para atingir 3,0 x 10⁶ células em 10 mL para inocular um prato de 10 cm revestido de proteínas da matriz extracelular. Coloque o prato inoculado em uma incubadora tri-gás CO₂ (37 ° C, de 6,5% O₂, 5% CO₂).
   9. Médio de mudança (mTeSR1 sem Y27632) todos os dias.

2. geração de hPGCLCs

Nota: Inicie as etapas a seguir, quando as células de hiPSC em um prato de 10 cm (mTeSR1 médio, revestido de proteínas da matriz extracelular) atinge a confluência de ~ 80% (aproximadamente 10⁷ células).

1. Preparação de pratos de proteína-revestido de matriz extracelular (1 dia)
   1. Descongelar uma alíquota de proteínas de matriz extracelular no gelo e diluir com 25 mL de DMEM/F12 gelada.
   2. Dispense a proteína matriz extracelular diluídos para placas boas 6 (1 mL/poço). Uma alíquota é suficiente para revestir de 24 poços (4 placas). Incube as placas em temperatura ambiente pelo menos 1 hora. Placas revestidas não utilizadas podem ser seladas e armazenadas em temperatura ambiente por até uma semana.
   3. Aspire médio das placas imediatamente antes da inoculação de pluripotência aprontada hiPSCs. Não é necessário lavar os pratos revestidos com médio ou PBS(-).
2. Inoculação de pluripotência aprontada hiPSCs em placas com revestimento em proteínas da matriz extracelular (1 dia)
   1. Tomar 4 mL de enzima de dissociação celular num tubo de centrífuga de 15 mL e equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.
   2. Prewarm 10 mL PBS(-) em uma centrífuga de 15 mL tubo para > 5 min a 37 ° C em banho-maria.
   3. Adicione 7 µ l de 50mm Y27632 (inibidor ROCK) a 35 mL de meio de mTeSR1 num tubo de centrífuga de 50 mL. Use o meio de Y27632-completada no mesmo dia. Faça dois tubos para total 70 mL Y27632-suplementado médio e escaldar a médio em banho-maria 37 ° C por 15 min.
   4. Aspire o antigo médio de um células de 10 cm prato e lave uma vez com escaldadas 10 mL PBS(-). Descartar o PBS(-) e adicionar 4 mL de enzima de dissociação celular ao prato. Coloque o prato numa incubadora de CO₂ (incubadora de tri-gás funciona, mas não necessário) para ~ 4 min até células desanexar do fundo. Células de pipeta suavemente para cima e para baixo fazer monocelulares suspensão.
   5. Transferi hiPSC suspensão de célula única para o escaldadas tubo contendo 10 mL de meio de Y27632-completada. Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente, 300 x g por 8 min.
   6. Descartar o sobrenadante e ressuspender células com médio 10ml de Y27632-suplementado escaldadas.
   7. Filtre a suspensão através de um filtro de célula (tamanho de poro de 40 µm) para remover agregados de células e contagem de células usando um contador de Coulter.
   8. Dilua a suspensão de células única hiPSC para 5.0 x 10⁶ células no meio de Y27632-suplementado escaldadas de 50 mL.
   9. Inocule a suspensão de células de 2 mL (2,0 x 10⁵ células) em cada poço das placas 6-Poços revestidos (4 placas de 24 poços). Certifique-se que as células são uniformemente distribuídas em cada poço. Coloque as placas de cultura de células em uma incubadora tri-gás CO₂ (37 ° C, de 6,5% O₂, 5% CO₂).
      Nota: A densidade de células de inóculo e distribuição uniforme em cada bem é essencial. Como a inoculação de hiPSCs em pratos de 10 cm pode causar significativamente maior densidade celular do que outras áreas. Nem celular densidade de hiPSCs de célula única pode ser conseguida mais facilmente com placas boas 6.
   10. Alterar o meio com 2 mL/bem mTeSR1 (sem Y27632) em 24 horas após a inoculação.
3. Conversão de hiPSCs de estado a pluripotência condicionadas às células pluripotentes 4i-ingênuo (independente de ERK) (dia 3 e 4 dias)
   1. Preparar 4i ingênuo completa pluripotência médio em um tubo de centrífuga de 50 mL, como segue (dia 3 e 4 dias): 50 mL de meio basal 4i, 5 µ l de 30 mM CHIR99021, 5 µ l de 10mm PD0325901, 5 µ l de 20 mM BIRB796, 5 µ l de 50mm SP600125 e 5 µ l de 50 mM Y27632.
      Nota: Guarde 4i meio basal a-80 ° C e descongelar no frigorífico durante a noite. Prepare meio completo 4i fresco imediatamente antes do uso. Evite a exposição dos produtos químicos 4i (CHIR, PD, BIRB e SP) a luz forte. Não armazene 4i completo médio a 4 ° C ou congelados durante a noite ou mais.
   2. O meio completo 4i quente 50 mL em um lote de água de 37 ° C por 15 min. meio de mudança com pré-aquecido 4i médio completo (2 mL/poço) em 48 e 72 horas após a inoculação. Temporização exata da mudança média é importante para alcançar hPGCLC de alto rendimento e reprodutibilidade experimental.
      Nota: Densidade da cultura hiPSC 4i é alta sob essa condição e tornar-se confluentes em 48-72 horas após a inoculação, mas isso é normal.
4. Formação de EB usando placas de microplacas (dia 5)
   1. Preparar 50 mL de meio completo 4i num tubo de centrífuga de 50 mL e escaldá-lo em banho-maria 37 ° C para ~ 15 min antes do uso.
   2. Escaldar 35 mL DMEM/F12 em um tubo de centrífuga de 50 mL em um banho de água de 37 ° C para ~ 15 min antes do uso.
   3. Preparar um prato de microplacas
      1. Adicionar 5% (p/v) filtro esterilizado detergente Pluronic F-127 para 8 ativos poços de uma placa de micropoços (ver Tabela de materiais; 0,5 mL/poço).
      2. Centrifugue a placa de micropoços à temperatura ambiente, 1.000 x g, durante 5 min. Inspeccione micropoços com um microscópio invertido para garantir a ausência de bolhas de ar. Deixe a placa de micropoços durante 30 min à temperatura ambiente para revestir os poços da microplaca com detergente.
      3. Descartar a solução detergente de poços da placa de microplacas por poços de pipetagem e enxágue com DMEM/F12 escaldadas (2 mL/poço).
      4. Centrifugue a placa de micropoços à temperatura ambiente, 1.000 x g, durante 5 min. Inspeccione micropoços com um microscópio invertido para garantir a ausência de bolhas de ar.
         Nota: Quando as bolhas de ar ainda são observadas em poços da microplaca, examine se a folha de microplacas é ainda firmemente colada ao fundo do poço.
      5. Descartar DMEM/F12 dos poços da placa de microplacas por poços de pipetagem e enxágue com DMEM/F12 escaldadas (2 mL/poço).
      6. Repita os passos de 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Adicione meio completo 4i nos poços da placa de micropoços (1 mL/poço) enxaguados. Manter o restante meio completo de 4i em banho maria a 37 ° C.
      8. Centrifugue a placa de micropoços à temperatura ambiente, 1.000 x g, durante 5 min. Inspeccione micropoços com um microscópio invertido para garantir a ausência de bolhas de ar.
      9. Coloque a placa de micropoços numa incubadora tri-gás (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂) até a inoculação de 4i hiPSCs.
   4. Inoculação de 4i iPSCs em uma placa de micropoços
      1. Leve 13 mL de enzima de dissociação celular num tubo de centrífuga de 15 mL e equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.
      2. Prewarm 50 mL PBS(-) em uma centrífuga de 50 mL do tubo para > 5 min a 37 ° C em banho-maria.
      3. Idade média de 24 poços de ingênuo hiPSC célula células cultura e lave uma vez com 2ml escaldada, Aspire/bem PBS(-). Descartar o PBS(-) e adicionar 0,5 mL/poço enzima de dissociação. Coloque as placas de cultura de células em uma incubadora de CO₂ (37 ° C) por ~ 4 min até células desanexar do fundo. Células de pipeta suavemente para cima e para baixo fazer monocelulares suspensão.
      4. Transferi hiPSC suspensão de célula única para 20ml escaldadas 4i meio completa. Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente, 300 x g por 8 min.
      5. Descartar o sobrenadante e ressuspender células com 5 mL de meio de 4i escaldadas completa.
      6. Filtre a suspensão através de um filtro de célula (tamanho de poro de 40 µm) para remover agregados de células. Lave o filtro de célula 3 vezes com 1 mL de meio de 4i escaldadas completa. Contar as células usando um contador de Coulter.
      7. Dilua a suspensão de célula única de 4i ingênuo hiPSCs para 27,0-32,4 x 10⁶ células em 9 mL de meio de 4i escaldadas completa. Observe que esse meio completo 4i já contém Y27632.
      8. Leve o prato de microplacas contendo 1 mL de meio completo 4i em 8 bem de uma incubadora de tri-gás (2.4.3.9). Inocule 1 mL 4i ingênuo hiPSC suspensão (3.0-3.6 x 10⁶ células/poço) em cada poço. Esta densidade celular é fundamental. Certifique-se que as células são distribuídas uniformemente em cada poço pipetando suavemente.
      9. Centrifugue a placa de micropoços à temperatura ambiente, 100 g de x por 3 min.
      10. Coloque a placa de micropoços numa incubadora tri-gás CO₂ (37 ° C, de 6,5% O₂, 5% CO₂). Não perturbe células peletizadas em poços da microplaca. Incube as células por 24 a 30 horas. Uma incubação overnight (~ 16 horas) é geralmente insuficiente para formação de EBs apertado.
5. Transferência de EBs para placas de fixação baixo para balançar a cultura (dia 6)
   1. Prepare hPGCLC meio completo em um tubo de centrífuga de 50 mL como segue (dia 6 - dia 13):
      20 mL de meio de hPGCLC basal, 4 μL de 500 mM 2-Mercaptoetanol, 50 μL de 20 mg/mL ácido L-ascórbico, 4 μL de 50 mM Y27632, 50 μL de 100 μg/mL BMP4 humana recombinante, 4 μL de 500 μg/mL humana CCAH, 4 μL de 250 μg/mL de EGF humano e 8 μL de 250 μg/mL a vida humana.
      Nota: Prepare meio completo hPGCLC fresco imediatamente antes da utilização e evitar a exposição à luz. Não armazene hPGCLC completo médio a 4 ° C ou congelados durante a noite ou mais.
      Nota: A concentração de BMP4 é muito alta. A concentração ideal de BMP4 pode diferir entre lotes de BMP4. A diferença de lote para lote de BMP4 fortemente afetam a produção de hPGCLC. Na ausência de BMP4 no meio de hPGCLC completa, rendimento de hPGCLCs é muito baixo⁶. A importância de outras citocinas no meio de hPGCLC completa foi descrita por Hanna/Surani⁶.
      Nota: No presente protocolo, a concentração final de vida humana no meio de hPGCLC completa é 100 ng/mL^6,10. A concentração final de LIF usada em estudos publicados anteriormente, incluindo a nossa, era 1 μg/mL. Quando a atividade específica do reagente de vida humana é > 10.000 unidades/μg (ED₅₀ < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL LIF é suficiente para suportar a geração de hPGCLC da EBs.
   2. Transferência de EBs
      1. Escaldar 5 mL de meio de hPGCLC basal e 20 mL de meio completo de hPGCLC para > 5 min a 37 ° C em banho-maria.
      2. Cuidadosamente coloque um coador de célula de cabeça para baixo no topo de uma cónica de polipropileno de 50 mL.
      3. Pipetar cada poço de teste o de muito suavemente placa placa para desanexar EBs de micropoços. Filtre todo o conteúdo de cada poço com filtro célula para remover células não incorporadas na EBs.
      4. EBs de lavar retidos no filtro célula com 1 mL de meio basal hPGCLC escaldadas. Delicadamente repeti lavagem 5 vezes.
      5. EBs lavado agora são retidas na membrana de um filtro, que é sobre um tubo cónico de 50 mL de ponta-cabeça. Coloque um tubo cónico de 50 mL fresco sobre o filtro de célula para que o filtro célula normalmente é posicionado no tubo de novo. Então rapidamente inverta o filtro de célula com o tubo de novo. O filtro de célula e o tubo estão agora na posição normal, e EBs estão abaixo da membrana do filtro célula.
      6. Colete EBs no tubo cónico adicionando meio completo de 18 mL escaldadas hPGCLC cima da membrana do filtro da célula. Assim, meio irá atravessar a membrana e recolher EBs anexado no lado inferior da membrana para o fundo do tubo de centrífuga.
      7. Suspensão de placa da EBs em poços de uma placa de 6-poços de baixa-penhora (3 mL/poço).
      8. Coloque a placa de baixo-penhora sobre um roqueiro de gangorra-movimento em uma incubadora de tri-gás (37 ° C, de 6,5% O₂, 5% CO₂). Defina a velocidade de balanço em ~ 20 voltas por minuto.
         Nota: Não aplique movimento turbilhão porque agregado EBs no centro de poços e fusível. Cuidadosamente ajuste velocidade de balanço para que não agregam EBs. Balanço muito vigorosa danificará fisicamente EBs.
         Nota: A pressão baixa de oxigênio é altamente recomendável para cultura EB.
6. Geração de hPGCLCs na superfície da EBs (dia 7 - dia 13)
7. Recém prepare 20 mL de meio de hPGCLC completa de cada dia. Sem balanço, EBs penetrará no fundo dos poços em ~ 1 min. remover meio velho sem secagem EBs (~0.2 mL/poço velho médio pode permanecer) e adicionar meio completo hPGCLC fresco todos os dias (3 mL/poço).

3. coloração imuno-histoquímica de EBs (dia 10-dia 13)

1. Incorporação de EBs em blocos de proteínas da matriz extracelular para formaldeído-fixas, parafina immunostaining (FFPE)
   1. Para identificar o hPGCLCs como OCT4⁺ células, colher EBs em um tubo de baixa vincular microcentrifuga de 1,5 mL. Deixe EBs afundar até o fundo ou brevemente centrifugar (2 segundos) à temperatura ambiente e descarte o meio. Enxágue EBs com PBS(-) gelada.
   2. Remover PBS(-) e incubar EBs em 1 mL de 1%(w/v) gelada de azida de sódio em PBS(-) por 5 min no gelo. Deixe EBs afundar até o fundo ou centrifugar brevemente (2 segundos) à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar EBs com PBS(-) gelada.
      Nota: Adição de azida de sódio diminui a degradação de proteínas intracelulares e transcrições de RNA.
   3. Descongelar a 200 µ l de proteínas de matriz extracelular no gelo e adicionar ao tubo microcentrifuga contendo EBs. Deixe o tubo em temperatura ambiente por ~ 10 min até que o gel é solidificado.
   4. Adicionar 1 mL de formaldeído de 4% em PBS(-) e incubar a temperatura ambiente por 15 min com balanço suave.
      Nota: Ambos EBs e proteínas da matriz extracelular são fixos durante esta etapa. Sem fixação, os blocos de gel podem decompor-se durante o processo de desidratação. Se EBs pré-fixados são incorporados no gel de bloco, EBs são fixos novamente com o bloco de gel e pode ser excesso fixo.
   5. Descartar o formaldeído e enxágue EBs uma vez com PBS(-) gelada. Adicione 1 mL de etanol a 70%. Incorporado no gel de EBs podem ser armazenadas em etanol a 70% em 4 ° C por uma semana.
   6. O EBs incorporado no gel com um protocolo padrão de FFPE de processo. Prepare-se 5 μm slides FFPE de espessura. Deixe os slides secar durante a noite e armazená-los em temperatura ambiente até immunostaining.
      Nota: O nosso protocolo FFPE a rotina é a seguinte: 70% de etanol, duas alterações, 1 hora cada; 80% de etanol, uma mudança, 1 hora; etanol a 95%, uma mudança, 1 hora; 100% de etanol, três alterações, 1,5 hora cada; xileno, três alterações, 1,5 hora cada; cera de parafina (58-60 ° C), duas alterações, 2 horas cada. Os tecidos desidratados são incorporados em blocos de parafina e cortados em 3-10 μm (tipicamente 5 μm).
   7. Para a coloração, completamente seco slides em forno de 56 ° C durante pelo menos 30 min. Deparaffinize e hidratar slides com séries de álcool graduada e xilenos. Então lave slides na água da torneira por 5 min.
   8. Para inactivar peroxidases endógenas, incube rehidratado com solução de bloqueio BLOXALL à temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, lave slides com PBS por 5 min.
   9. Bloco desliza com soro de cavalo Normal (ou sera normal de outros anticorpos secundários de espécies geradas) à temperatura ambiente por 20 min.
   10. Incubar com um anticorpo primário de cabra anti-OCT-3/4, diluído com 0,1% BSA em PBS(-) a 4 ° C durante a noite (otimizar as condições de incubação e diluição para cada anticorpo primário). Em seguida, lave slides com PBS(-) três vezes à temperatura ambiente, 5 min cada.
   11. Incube com a anti-cabra IgG (os anticorpos do secundário conjugada com peroxidase rábano gerado pelo cavalo; ver Tabela de materiais) à temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, lave slides com PBS(-) três vezes à temperatura ambiente, 5 min cada.
   12. Misture quantidades necessárias a DAB coloração substratos (ver Tabela de materiais) imediatamente antes do uso e incubar em DAB completa solução em temperatura ambiente por 5 min. Monitor DAB coloração usando um microscópio invertido de coloração e parar a reação Quando OCT4⁺ células são visualizadas enxaguando rapidamente slides nas correntes de água de torneira.
   13. Desidrate os slides com série graduada de álcool e xilenos. Os slides estão prontos para a captura do laser microdissection. Preparar slides FFPE permanentes usando o meio de montagem (ver Tabela de materiais) para observações microscópicas de alta resolução.

4. enriquecimento de FACS da hPGCLCs de EBs (dia 10-dia 13)

1. Preparar a mistura de enzima de Embryoid jogo de dissociação do corpo
   1. Prepare-se enzima Mix 1 pela adição de 50 µ l da enzima P para 1.900 µ l de Buffer X e vortex. Escaldar a enzima Mix 1 em banho-maria 37 ° C por 15 min.
   2. Prepare a enzima Mix 2 adicionando 10 µ l da enzima A 20 µ l de Buffer Y.
   3. Misturar enzima mistura 1 e 2 para preparar a mistura de enzima de dissociação completa EB.
2. Dissociando EBs
   1. EBs de colheita de placas de fixação baixo e centrifugar temperatura num tubo de centrífuga de 15 mL, 300 x g por 2 min. descartar o sobrenadante e ressuspender EBs com 10 mL PBS(-). Centrifugue novamente.
   2. Descartar o sobrenadante e ressuspender EBs com mistura de enzima de dissociação de EB completa (4.1.3). Incube a suspensão EB em banho-maria 37 ° C por 15-20 min até EBs são dissociado. Durante a incubação, suavemente a pipeta EBs a cada 3-5 min para facilitar a dissociação. Alternativamente, use um dissociador automatizado com programa de dissociação corporal Embryoid.
   3. Adicione gelada 8ml PBS(-) a suspensão de células dissociada EB. Filtre a suspensão através de um filtro de célula de 40 µm. Filtro de lavagem célula com 1 mL gelada PBS(-) três vezes.
   4. Contar as células em suspensão de células filtradas usando um contador de Coulter.
   5. Centrifugar a suspensão de células para a 4 ° C, 300 x g, durante 8 min e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet de células com 10ml gelada PBS(-).
   6. Divida a suspensão de células em dois tubos, um para controle de não-coloração (células de⁵ ~ 10) e o outro para anti-CD38 coloração (todas as células restantes).
   7. Centrifuga os dois tubos a 4 ° C, 300 x g por 8 min.
3. Coloração anti-CD38 e enriquecimento de FACS de hPGCLCs
   1. Resuspenda o pellet de célula para o controle de não-coloração com 200 µ l gelada 3% (p/v) BSA e azida de sódio de 1% (p/v) em PBS(-). Coloque gelo até citometria de fluxo.
      Nota: Adição de azida de sódio retarda a interiorização do CD38 da superfície celular.
   2. Resuspenda o pellet de células para anti-CD38 manchando com gelada 3% (p/v) BSA e azida de sódio de 1% (p/v) em PBS(-) de 1 x 10⁶ células por 100 µ l.
   3. Adicione 10 µ l por 1 x 10⁶ células de uma grade de FACS, anticorpo anti-CD38 APC-conjugados. Cobrir o tubo com papel de alumínio para evitar a exposição à luz. Incube a 4 ° C, durante 45 min com balanço suave.
   4. Adicionar 5 mL gelada PBS(-) e centrifugar a 4 ° C, 300 x g por 8 min. Discard sobrenadante e ressuspender célula pelota com 5 mL PBS(-) gelada. Repita a lavagem com PBS(-) três vezes no total.
   5. Resuspenda o pellet de células com azida sódica 500 μL gelada 3% (p/v) BSA e 1% (p/v) em PBS(-) para uma densidade de célula adequada para FACS.
   6. Enriquecer a hPGCLCs como CD38⁺ células, que normalmente formam a população de células bem diferenciadas. Use o controle de não-coloração para garantir a identificação do CD38⁺ células. Rendimento típico de hPGCLCs são 1-5% de todas células únicas FACS-examinada de dia 10 EBs e 20-40% do dia 13 EBs.

Resultados

A placa de micropoços usada aqui é no formato 24-bem e tem 8 poços segurando os lençóis de microplacas, cada um deles suporta a formação de até 1.200 EBs. De aproximadamente 24 milhões de células de pluripotência 4i ingênuo, esta placa de micropoços normalmente gera ~ 8.000 EBs consistindo de ~ 3.000 células por EB. Durante a cultura de não-aderente da EBs com balanço constante, diminui gradualmente o número de EBs intacto devido ao desmantelamento Self espontâneo e ~ 3.000 EBs sobreviver até o dia 13 do protocolo. A maioria destes sobreviventes EBs tem 50-200 hPGCLCs em sua superfície (estimada pela detecção de imuno-histoquímica de células OCT4 + serial seções de EBs; consulte a Figura 8), rendendo ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs no total. Digestão enzimática da EBs em células individuais é um processo relativamente ineficiente, reduzindo o rendimento do FACS-enriquecido CD38 + hPGCLCs para células de 9.000-47.000. Em nossas mãos, uma média de seis lotes consecutivos mas independentes de experimentos foi 14.038 ± 5.731 (média ± SEM). Porque células de células CD38-negativo EB expressam OCT4 mRNA (qPCR) ou proteína (imuno-histoquímica) só muito fraca, se não completamente ausente, todas as células do EB fortemente expressando proteínas OCT4 são praticamente equivalente a toda a população do CD38 + hPGCLCs.

O parâmetro crítico do presente protocolo inclui a densidade celular. Quando 2,0 x 10⁵ humano iPSCs são inoculadas em uma proteína-revestido bem da placa de cultura de células de 6-bem (área de crescimento de² cm 9,60 por alvéolo) com 2 mL de Y27632-completado meio (2.2.9) da matriz extracelular, células chegará a cerca de 20-30% confluencia em 24 horas após a inoculação (Figura 1). Depois de um adicional de 24 horas cultura no meio de mTeSR1, na ausência de Y7632, células agregadas e formam colônias, ocupando ~ 30% da área de crescimento (Figura 2). As células são então cultivadas no meio de reprogramação de 4i (2.3.2). Após 24 horas de cultura em confluente de células tornam-se médias, o 4i (Figura 3). Uma cultura de 24 horas adicional no meio 4i faz células densamente (Figura 4). O momento exato da mudança média (cada 24 horas + /-4 horas) e densidades de célula são críticos para o sucesso formação de EBs e hPGCLCs.

Após 48 horas cultura em meio de 4i, as células são dissociadas e inoculadas para a placa de micropoços, que tem 400 µm poços em tamanho (2.4). Embora esta placa de micropoços comercialmente disponível é revestida para baixa aderência pelo fabricante, fresco de revestir novamente com detergente (2.4.3) é recomendada para reduzir o risco de aderência de célula indesejados. os poços da 800 microplaca µm resultaram em rendimento reduzido do hPGCLCs, sugerindo a importância do tamanho do EB para diferenciação corretamente direcionado. Células inoculadas em meio de 4i formarão EBs em poços da microplaca de 24 a 30 horas, que pode ser observadas usando um padrão, invertido fase microscópio de contraste (Figura 5). O contorno circular da EBs tornam-se claramente visível no e após 24 horas de incubação. Colheita de EBs em um momento anterior (por exemplo, 16 horas após a inoculação) antes que seu contorno circular é claramente visível não é recomendado porque tais EBs são muito vulneráveis a danos mecânicos e desmontar facilmente. Note-se que uma quantidade significativa de ingênuo hiPSCs não é incorporados na EBs, que é normal. Estas células não-incorporadas vão ser lavadas afastado antes do início da cultura do EBs na superfície de baixo-aderente (2.5.2) de balanço. Observe também que, no nosso protocolo, EBs são formadas no meio de pluripotência 4i ingênua - não no meio de hPGCLC. Pré-formação do sólido EBs no meio 4i antes da exposição ao meio de hPGCLC é importante para a distribuição de hPGCLCs na superfície da EBs.

EBs mantidas em meio de hPGCLC sob um balanço, condição de cultura não-aderente manterão sua forma esférica sem agregação ou fusão (Figura 6 e Figura 7). Muito fraca condição de balanço fará com agregação de EB e fusão, mas muito dura condição irá desmontar EBs. PGCLCs humanas emergem como OCT4-expressando células na superfície da EBs após tão cedo quanto a cultura de 5 dias no meio de hPGCLC e seu número aumenta até a cultura de 8 dias (Figura 8). Incubação adicional de EBs pode causar a desmontagem de EBs e perda de hPGCLCs. PGCLCs humanas podem ser enriquecidos de células EB enzimaticamente dissociadas após 5-8 dias de cultura em meio de hPGCLC pela FACS como células CD38 + (Figura 9).

Figura 1: cultura de células humanas iPSC em meio Y27632-completadas 24 horas após a inoculação. A densidade celular é de cerca de 20-30% confluentes. Na presença de inibidor ROCK Y27632, células tendem a se espalhar bem com o tempo, spike, como alongamento. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: cultura de células humanas de iPSC 48 horas após a inoculação. Agregado que formam colônias, ocupando ~ 30% da área de crescimento de células. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: cultura de células humanas de iPSC incubadas na meio de reprogramação 4i durante 24 horas. Células alcangam a confluência. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: cultura de células humanas de iPSC incubadas na meio de reprogramação 4i durante 48 horas. São densamente confluentes. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: iPSC humana EBs formada em poços da microplaca após 24 horas de incubação no 4i reprogramação médio. O contorno circular da EBs tornam-se visíveis em 24-30 horas após a inoculação. Quando o contorno é confirmado sob um microscópio de contraste de fase, EBs estão prontos para transferência para uma condição de cultura Rock. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: humano iPSC EBs incubadas durante 24 horas em meio de hPGCLC. EBs em grande parte manter sua forma esférica. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: iPSC humana EBs incubadas durante 192 horas em meio de hPGCLC. EBs são ampliados em relação à sua aparência no 24 horas de cultura, mas eles ainda em grande parte mantenham formas esféricas com nenhuma agregação ou fusão. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: humanos PGCLCs expressando OCT4 são localizadas na superfície da EBs incubadas durante 192 horas em meio de hPGCLC de hiPSC. EBs foram incorporados em proteínas de matriz extracelular e processadas para FFPE slide coloração imuno-histoquímica de OCT4 (substrato DAB). Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: PGCLCs humanas são enriquecidos de células enzimaticamente dissociadas do EB por FACS como CD38⁺ células. Após incubação em meio de hPGCLC de 5-8 dias, EBs pode ser dissociado por digestão enzimática para preparar a suspensão de célula única. hPGCLCs pode ser enriquecido como CD38⁺ células por FACS (pontos vermelhos). Células EB que não expressam CD38 (pontos azuis) também devem ser coletados como controlo negativo. Portões de FACS do CD38-positivo e negativo-CD38 células devem ser separadas com uma larga margem (pontos verdes) para evitar a contaminação de cada tipo de células. Os painéis superiores e inferiores mostram perfis FACS sem ou com anticorpo anti-CD38, coloração, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Produção de robusta de hPGCLCs usando o protocolo descrito aqui foi confirmada com três clones independentes de iPSCs humana com o cariótipo diploide normal¹⁰. Estes clones de iPSC foram derivadas do fibroblasto humano neonatal dérmica pele mesma célula cultura¹⁰. Serão fornecidos pelos autores deste artigo para os investigadores a pedido e sob o acordo de transferência de materiais adequados e arranjo das células humanas ao vivo congelados do transporte. É atualmente desconhecido se o cariótipo normal é necessário para a produção de robusta hPGCLC usando nosso protocolo ou aqueles relatados por outros laboratórios.

Estudos recentes demonstraram que a produção de hPGCLCs de hiPSCs¹¹ ou CES¹⁴ usando um protocolo descrito pelo grupo do Saitou da Universidade de Kyoto⁸ é dependente da expressão do EOMES, um factor de transcrição do T-caixa necessário para indução de SOX17. SOX17 parece funcionar como a linhagem mestre determinar o factor de transcrição em germline diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas⁶. EOMES é codificada pelo gene EOMESODERMIN , CRISPR/Cas9 nocaute da EOMESODERMIN causada quase completa ausência de indução de SOX17 na hPGCLC produzindo condição¹¹e expressão de outros genes seguia o mesmo padrão das Células SOX17-nulo nocaute. Superexpressão de EOMES de um vetor inducible no EOMESODERMIN-células de nocaute nulo durante a cultura de indução de hPGCLC resgataram eficientemente a produção de robusta hPGCLC, bem como indução de genes da linha germinal, incluindo SOX17. Em contraste, superexpressão induzida SOX17 também resgatou a produção PGCLC robusta mas sem induzir EOMESODERMIN. Assim, EOMES é um indutor de montante crítico de SOX17, e isto parece o único papel mais importante de EOMES na hPGCLC indução de células-tronco pluripotentes humanas. Nosso protocolo induz SOX17 em hiPSCs¹⁰, mas sua dependência na indução EOMESODERMINE aguarda para ser determinado.

Este protocolo converte aprontado-pluripotência iPSCs humano mantido a médio mTeSR1 ERK independente ingênuo pluripotência para 96 horas no 4i reprogramação médio⁶, que é um ingênuo modificado células-tronco humano médio (NHSM)⁵. Nossas tentativas de gerar hPGCLCs, começando com os clones humanos iPSC mesmo mas mantido em outros meios de crescimento de iPSC humano disponível comercialmente antes de cultura no 4i reprogramação médio resultou em vários graus de mais baixos rendimentos de hPGCLC. Embora se adaptação de longo prazo em outros meios de comunicação melhora a produção de hPGCLC ou não permanece ser determinado em estudos futuros, esta observação sugere que o estado exato da pluripotência purgado de iPSCs humana antes do 4i reprogramação significativamente formação de EB de impactos no meio 4i e diferenciação de EB hPGCLC médio.

Produção de hPGCLCs de hiPSCs a seguir o nosso protocolo é robusto e altamente reprodutível, em parte devido a utilização das placas de microplacas que permitem a produção eficiente de um grande número de EBs (~ 8.000 EBs por lote) com um tamanho uniforme (3.000 hiPSCs por EB). O número de EBs prontamente produzido em um único lote de experimento usando nosso protocolo pode ser muito maior do que os métodos usando os poços de cultura celular U-fundo regulares. Produção de um grande número de igual tamanho EBs uniformemente cravejado com hPGCLCs pode fornecer oportunidades únicas de alto rendimento químicas projecções para identificar ativadores de pequeno peso molecular ou inibidores que afectam a especificação PGC ou seus características biológicas como reprogramação epigenética. Tais EBs pode também ser útil para avaliações toxicológicas de grande número de tóxicas para a célula da linha germinal, incluindo não só poluentes ambientais, mas também clinicamente prescritos medicamentos como agentes quimioterápicos.

Os fatores críticos da produção robusto e reprodutível de hPGCLCs usando o protocolo apresentado incluem (i) o uso de hiPSCs saudável mantida em mTeSR1 em proteínas de matriz extracelular, (ii) para inocular o número exato de células conforme especificado e estritamente Siga os timings da mudança média e subcultura, (iii) para selecionar muita BMP4 recombinante humano e (iv) para minimizar danos físicos da EBs durante a cultura Rock. É nossa experiência que o melhor lote de reagente BMP4 trabalhou na concentração de 100 ng/mL, Considerando que outros muitos BMP4 reagentes necessários 2 X ou mais doses. Por outro lado, o rendimento de hPGCLCs produção usando o melhor lote de BMP4 diminuiu bastante em doses mais elevadas de BMP4 (por exemplo, 200 ng/mL). Recomendamos para testar vários diferentes lotes de reagentes de BMP4 humanos recombinantes obtidos de vários fornecedores para o seu desempenho no apoio hPGCLC geração e para garantir uma grande quantidade do lote melhor.

Uma característica única do nosso protocolo de hPGCLC é que hPGCLCs estão localizadas sobre a camada de superfície exterior da EBs¹⁰ (Figura 8), enquanto outros protocolos podem gerar hPGCLCs no meio da célula agregados^6,8. Corpos do embryoid tendem a formar várias camadas distintas como núcleo, escudo exterior, escudo interno e superfície, e as regiões de núcleo central são muitas vezes necróticas devido a oferta limitada de nutrientes, oxigênio, bem como a forma de fatores de crescimento desde que pro-sobrevivendo a cultura médio por difusão²⁰. Localização de hPGCLCs na superfície da EBs sem restrições possíveis devido à limitada difusão em direção ao centro da EBs pode ser benéfica para a direta, exposição e dose-controlada por tempo de hPGCLCs a drogas ou substâncias tóxicas para farmacológica ou estudos toxicológicos.

Considerando que o rato PGCLCs mostrar robusto todo o genoma ADN desmetilação envolvendo a impressão controlar regiões pelo menos em parte^7,19,20, o grau de desmetilação gDNA global em hPGCLCs parece mais fraco do que o rato PGCLCS ou PGCs^6,7. Transcriptomal perfis sugerem que hPGCLCs pode assemelhar-se numa fase anterior do PGCs embrionárias de rato PGCLCs¹⁰. Tem sido relatado que cultura prolongada do EBs sob a condição de hPGCLC produção causou um maior grau de gDNA desmetilação⁷; no entanto, se um longo período da cultura de hPGCLCs em EBs ou como células isoladas pode atingir estágios mais avançados da diferenciação do germline precisa ser determinada por estudos futuros.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cultura hiPSC de pluripotência preparada
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel no volume indicado pelo fabricante (cerca de 200 μ Use tubos frios. Armazene a -80 & C
DMEM / F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Loja em 4 ° C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Reconstitua adicionando 5X Suplemento ao Meio Basal. O meio reconstituído pode ser armazenado a 4 &graus; C por até 4 semanas sem afetar o desempenho da cultura celular.
Y27632	Axônio	1683	Diluir 5 mg Y27632 (MW 320,26) com 312,2 μ L de água para preparar a solução-mãe Y27632 50 mM. Esterilizar por filtração (0,22 μ m). Alíquota 20 μ L/tubo x 15 tubos e armazenar a -20 °C.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Loja em 4 graus C.
Accutase	Innovative cell technologies	AT104-500	Enzima de dissociação celular; alíquota 40 mL / tubo x 12 tubos e armazenar a -20 ° C.
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4i cultura hiPSC
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut Substituição	Thermo Fisher Scientific	10828028	Alíquota 40 mL/tubo x 12 tubos e armazenar a -20 °C.
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulina do pâncreas bovino	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Adicione 0,1 mL de ácido acético glacial a 10 mL de água. Esterilizar por filtração (0,22 um). Dilua 100 mg de pó liofilizado de insulina com 10 mL frios de água acidificada para fazer 10 mg / mL de solução estoque. Alíquota 650 μ L/tubo x 15 tubos e armazenar a -80 °C.
humano LIF	PeproTech	300-05	Reconstituir 250 μ g LIF humano com 250 μ L água. Adicione 750 μ L de albumina sérica bovina a 0,1% em PBS(-) para fazer 250 μ g/ml de solução-mãe LIF humana. A atividade específica deste produto é de >10.000 unidades/μg. Alíquota 40 ul/tubo x 25 tubos e armazenar a -80 °C.
FGF2 humano	R& D Systems	4114-TC	Reconstitua 1 mg de FGF2 humano com 5 mL de PBS(-) para fazer 200 μ g/mL de solução estoque de FGF2 humano. Alíquota 100 μ L/tubo x 50 tubos e armazenar a -80 °C.
TGF-&beta humano; 1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 μ g com 50 μ L de ácido cítrico 10 mM (pH 3,0). Adicione 150 μ L de albumina sérica bovina a 0,1% em PBS(-) para fazer 250 μ g/mL de TGF-&beta humano; 1 solução de estoque. Alíquota 4 μ L/tubo x 50 tubos e armazenar a -80 °C.
4i meio			Misture os seguintes reagentes para fazer o meio basal 4i. 500 mL de KnockOut DMEM 100 mL de KnockOut Serum Replacement 6 mL de Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x) 6 mL de MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x) 650 µ L de 10 mg/mL de insulina de pâncreas bovino 40 µ L de 250 µ g/mL humano LIF 20 µ l de 200 µ g/ml de FGF2 4 µ l de 250 µ g/ml de TGF-&beta humano; 1 Alíquotas 40 ml/tubo e armazenar a -80 &C.
CHIR99021	Axônio	1386	Reconstitui 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) com 1791 μ L DMSO para fazer 30 mM CHIR99021 solução estoque. Alíquota 50 μ L/tubo x 35 tubos e armazenar a -20 °C.
PD0325901	Axônio	1408	Reconstitui 5 mg PD0325901 (MW 482.19) com 1037 μ L DMSO para fazer 10 mM PD0325901 solução de estoque. Alíquota 50 μ L/tubo x 20 tubos e armazenar a -20 °C.
BIRB796	Axônio	1358	Reconstitui 10 mg BIRB796 (MW 527,66) com 948 μ L DMSO para fazer 20 mM BIRB796 solução de estoque. Alíquota 50 μ L/tubo x 18 tubos e armazenar a -20 °C.
SP600125	Tocris	1496	Reconstitua 10 mg SP600125 (MW220.23) com 908 μ L DMSO para fazer 50 mM SP600125 solução estoque. Alíquota 50 μ L/tubo x 18 tubos e armazenar a -20 °C.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Placa de micropoços
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Reconstitua 5 g de Pluronic F-127 em 100 mL de água para fazer 5% (p / v) de solução estoque de Pluronic F127. Esterilizar por filtração (0,22 um). Aliqout 50 mL/tubo x 2 tubos e armazenar em rt
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
hPGCLC culture
Glasgow' s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
piruvato de sódio (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicilina-estreptomicina (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC meio			Misture os seguintes reagentes para fazer o meio basal hPGCLC. 500 mL de Glasgow' s MEM 75 mL de reposição de soro knockout 6 mL de solução de aminoácidos não essenciais MEM (100x) 6 mL de piruvato de sódio 100 mM 6 mL de penicilina-estreptomicina (x100) Alíquotas 40 mL/tubo e armazenar a -20 °C.
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Diluir 350 μ L 2-mercaptoetanol (14,3 M) em 9,65 mL de PBS(-) para fazer 500 mM de solução de estoque de 2-mercaptoetanol. Armazene a 4 ° C.
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	Reconstitua 400 mg de ácido L-ascórbico com 20 mL de água para fazer 20 mg / mL de solução estoque de ácido L-ascórbico. Esterilizar por filtração (0,22 um). Alíquota 500 μ L/tubo x 40 tubos e armazenar a -20 °C.
BMP4 humano recombinante	R& D Systems	314-BP	Reconstitui 1 mg de BMP4 humano recombinante com 10 mL de HCl 4mM aq. para fazer 100 μ g/mL de solução estoque de BMP4 humana recombinante. Alíquota 250 μ L / tubo x 40 tubos e armazenar a -80 ° C.
Humano SCF	PeproTech	300-07	Reconstituir 250 μ g SCF humano com 500 μ L de 0,1% de albumina de soro bovino em PBS(-) para fazer 500 μ g/ml de solução de reserva de SCF humano. Alíquota 35 μ L / tubo x 14 tubos e armazene a -80 ° C.
EGF humano	PeproTech	AF-100-15	Reconstitua 1 mg de EGF humano com 1 mL de albumina de soro bovino a 0,1% em PBS(-) para fazer 1 mg/mL de solução estoque de EGF humano. Aliqot 100 μ L/tubo x 10 tubos. Diluir 100 μ L de 1 mg/ml de solução-mãe de EGF humano com 300 μ L de albumina sérica bovina a 0,1% em PBS(-) para fazer 250 μ g/mL de solução de estoque humanoEGF. Alíquota 20 μ L/tubo x 20 tubos. Armazene a -80 °C.
Filtro de célula	Corning	352340	Tamanho do poro = 40 μm.
Tubo cônico de polipropileno de 50 ml	Corning	352070
Placa de fixação baixa	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Immunohistochemical coloração
BLOXALL Blocking Solution	VECTOR	SP-6000
Soro de cavalo normal ImmPRESS Reagente Anti-Goat	IgG VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Anticorpo	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Meio de montagem
Nome<	strong>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de dissociação de corpo embrióide hPGCLC
	Miltenyi Biotec	130-096-348
Anticorpo anti-CD38 conjugado a APC	abcam	ab134399