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Artigo de método

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

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DOI:

10.3791/58307

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3 de outubro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para a purificação da proteína anaeróbico, concentração da proteína anaeróbica e posterior caracterização cinética usando um sistema de eletrodo de oxigênio. O método é ilustrado usando a enzima DesB, uma enzima dioxigenase, que é mais estável e ativo quando purificado e armazenados em um ambiente anaeróbio.

Resumo

Proteínas sensíveis ao oxigênio, incluindo as enzimas que utilizam o oxigênio como um substrato, podem ter reduzido estabilidade quando purified usando métodos tradicionais de purificação aeróbio. Este manuscrito ilustra os detalhes técnicos envolvidos no processo de purificação anaeróbica, incluindo a preparação de amortecedores e reagentes, os métodos de cromatografia de coluna em uma caixa de luva e a dessalinização da proteína antes da cinética. Também descritos são os métodos de preparação e usando um eletrodo de oxigênio para realizar a caracterização cinética de uma enzima de oxigênio-utilizando. Esses métodos são ilustrados, utilizando a enzima dioxigenase DesB, uma dioxigenase galato de bactéria estirpe de Sphingobium SP. SYK-6.

Introdução

Enzimas que utilizam ferro ou outros metais para ativar o oxigênio são frequentemente suscetíveis à inativação durante o processo de purificação por causa de sua remoção do ambiente de redução de uma célula. Portanto, estas proteínas devem ser usadas como lisados celulares, ser submetidas a externos agentes redutores ou ser purificadas por via anaeróbia para garantir que eles têm atividade enzimática ideal1,2,3,4. Para essas enzimas que são oxigênio-sensível (especificamente ferro-contendo enzimas), realizando todas as etapas de purificação e caracterização, mantendo condições anaeróbias é necessário totalmente caracterizá-las. Isto levou os pesquisadores a desenvolver instalações de laboratório inteiro dentro dos limites das câmaras anaeróbias para estudos variando de expressão de proteínas através de cristalografia5,6,7,8 .

Neste documento, nós relatamos métodos de purificação anaeróbica e caracterização cinética da enzima DesB usando um sistema de eletrodo de oxigênio. DesB é uma dioxigenase galato de bactéria estirpe de Sphingobium SP. SYK-6 que está relacionada com a LigAB, uma dioxigenase protocatecuate do organismo mesmo. Ambas as enzimas pertencem ao tipo II protocatechuate dioxigenase (PCAD) superfamília que não tem sido estudada extensivamente a data9, provavelmente em parte devido a enzimas desta superfamília sendo suscetíveis à inativação quando purified usando padrão aeróbio métodos de purificação de proteínas. Uma vez que algumas das enzimas PCAD exibam a promiscuidade de substrato, enquanto outros são específicos do substrato2,10, ainda mais, caracterização desta superfamília é necessária identificar os determinantes da especificidade. Como tem sido observado em várias enzimas superfamílias11,12,13,14,15, pequenas moléculas podem alterar a atividade através de inibição competitiva direta ou a vinculação de moléculas para separar bolsos alostéricos que provoca um aumento ou diminuição da atividade enzimática16. Enquanto cinética sozinha não pode diferenciar o local de ligação de um modulador, determinar a magnitude de uma mudança de atividade é importante para entender os efeitos. Como tais, métodos para a caracterização cinética da atividade de DesB nativa e sua atividade na presença de 4-nitrocatechol 4 (NC), um composto comumente usado para caracterizar e inibir dioxigenase enzimas2,17, 18, são mostrados.

DesB é capaz de quebrar para baixo galato, um aromático derivados de lignina e composto, através de uma reação da dioxigenase (EDO) extradiol qual anel de abertura é catalisada utilizando o oxigênio como um dos substratos10,19. Esta reação enzimática ocorre dentro do contexto da degradação de lignina, um heteropolímero aromático encontrada na parede celular das plantas. Lignina pode ser depolymerized, produzir uma variedade de compostos aromáticos, que pode ser mais dividido em metabólitos central3,20,21,22,23,24 ,25,26,,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) catalisar um anel de abertura reação em compostos aromáticos dihydroxylated, onde a clivagem ocorre adjacente a um diol metal-coordenado; em contraste, dioxygenases intradiol cleave análogos compostos aromáticos entre os dois grupos hidroxila (Figura 1). EDOs, como muitas outras metaloenzimas, tem um centro de metais divalente para Fe coordenação composta por um dois-histidina,3534,9,do Tríade 1-carboxilato. Estes metaloenzimas se tornar oxidadas, por meio de auto-oxidação ou inativação baseada em mecanismo, Considerando que a enzima é processada inativo2,36,37,38.

Em procedimentos experimentais descritos neste manuscrito, utilizamos DesB, um membro da superfamília PCAD da bactéria Sphingobium SP. SYK-6, para catalisar a adição de oxigénio através do vínculo de C4-C5 de galato (Figura 2A). O regiochemistry desta clivagem é análogo ao LigAB, que é um protocatechuate-4,5-dioxigenase (Figura 2B). Até então, investigações deste dioxigenase galato não incluem nenhum relato de compostos que inibem DesB10,19,39. Com o uso de métodos de purificação aeróbio, DesB exibiram atividade variável, enquanto com o uso de métodos anaeróbios fomos capazes de consistentemente obter proteína com atividade reprodutível. Os estudos cinéticos descritos aqui mostram os métodos de purificação anaeróbica do DesB, caracterização cinética de reação de DesB com galato e a inibição de DesB por 4-nitrocatechol (4 NC).

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Protocolo

1. general materiais e métodos

  1. Prepare todos os meios necessários, conforme descrito na tabela 1. Autoclave a 120 ˚ c durante 15 min. estéril filtrar a solução SOC, após a adição de MgCl2 e glicose, passando-a através de um filtro de 0,2 µm. Ajuste o pH da solução de caldo lisogenia (LB mídia) do moleiro antes da autoclavagem. A solução de mídia LB-Amp de suplemento após a esterilização em autoclave com soluções estéreis de 0,2 mM L-cisteína, então 0,1 mM ferrosos sulfato de amônio para melhorar a solubilidade e a expressão da proteína.
  2. Prepare os buffers de Laemmli e execução para eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), conforme descrito na tabela 2. Ajuste o pH das soluções (usando 1 M HCl e Tris base para a preparação de reserva) antes de diluir os componentes para os volumes de finais.
  3. Prepare os buffers para purificação de proteínas, conforme descrito na tabela 3. Ajuste o pH das soluções (usando 1 M HCl e Tris base para a preparação de reserva) antes de diluir os componentes para os volumes de finais.
  4. Transferi os buffers preparados para uma garrafa que pode ser fechada com uma rolha de borracha de um buraco e contém um tubo de vidro.
    1. Use uma mangueira para ligar o tubo de vidro na rolha a uma fonte de vácuo. Permitir que a solução desgaseificar sob pressão negativa para aproximadamente 30 min, agitando na velocidade média.
    2. Quebre o selo em primeiro lugar, em seguida, desligue o aspirador o vácuo. Em seguida, fure a rolha de borracha com duas agulhas de 20g (aquele que é o tempo suficiente para atingir o fundo da garrafa e uma agulha mais curta que pode ser usada como um respirador de fuga de gás). Bolha em um fluxo constante de nitrogênio, agitando em velocidade média por 30 min.
    3. Retire as agulhas e repita a desgaseificação e subida em nitrogênio para um total de três ciclos. Quando terminar, devidamente tapar o frasco com uma rolha de borracha maciça. Ainda mais segura a rolha com película de parafina e fio de cobre (20G) e colocá-los no porta-luvas.
      Nota: Todos os materiais são colocados no porta-luvas e submetidos a 3 ciclos de purga a antecâmara, seguida de limpar para fora o oxigênio e com nitrogênio para enchê-lo. Buffers usados para purificação e concentração podem ser tampados e armazenados na caixa de luva indefinidamente.
  5. Preparar a solução de dithionate de sódio, dissolvendo-se aproximadamente uma espátula (0,31 "x 2", a extremidade menor de uma espátula de aço inoxidável com microafilado e duas extremidades) cheia de dithionate de sódio em cerca de 1 mL de água libertos em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL . Feche o tubo com a película de parafina antes da remoção da caixa de luva.
    Nota: Guarde o dithionate de sódio sólido no porta luvas para evitar a oxidação.

2. preparação da coluna de amilose para purificação de proteínas

  1. Faça uma pasta de resina de amilose de alto fluxo (15 mL) combinada com 5 volumes de coluna (75 mL) do buffer de coluna de amilose. Transferir o chorume de resina para duas garrafas de 50 mL soro e selar cada garrafa com um septo de borracha. Perfure um 20G, agulha de 305 mm através dos septos e o nitrogênio da bolha para o chorume por aproximadamente 1 minuto para remover o oxigênio da suspensão. Transferi a solução proteicos e resina para o porta-luvas.
  2. Na caixa de luva, despeje a resina em uma coluna de borosilicato de 2 x 30 cm equipada com uma torneira de passagem simples, permitindo que a resina para se estabelecer e criar uma cama de nível. Escorrer o buffer de coluna e equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna (total de ~ 30 mL) do buffer de coluna de amilose desgaseificado usando gás nitrogênio pressurizado para empurrar o buffer através da resina em aproximadamente 1 gota/s ou 5 mL/min, até que o solvente é um pouco acima do cama de resina.
    Nota: Após a proteína é eluída (consulte a etapa 3.5 abaixo), a resina de coluna de amilose é regenerada por lavagem com volume 1 coluna (10 mL) de água, então o volume de 1 coluna de Dodecil sulfato de sódio 1% (SDS) e finalmente, 3 volumes de coluna (30 mL) de água. Esta etapa pode ser concluída fora da caixa de luva. A resina de coluna é armazenada em 4 ° C em 20% de etanol e pode ser regenerada em até 5 vezes.

3. proteína expressão e purificação anaeróbica de DesB

Nota: O gene DesB foi comercialmente sintetizado, tendo sido colocado no animal de estimação-15b, animal de estimação-32a e pMAL-c5x vetores usando a restrição NdeI e BamHI clonagem de sites.

  1. Complete os ensaios de expressão da proteína de acordo com as orientações do fabricante para determinar as condições corretas de expressão de grande escala (descrito em breve abaixo).
    1. Transformar o plasmídeo contendo DesB comercialmente feitos, quimicamente competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) células, de acordo com as instruções do fabricante. Em breve, descongelar as células no gelo durante 10 minutos, adicionar cerca de 10-50 ng do plasmídeo à mistura de célula, choque térmico as células a 42 ° C, durante 10 s e incube-os no gelo um adicional 5 min. Adicione SOC media para obter um volume final de 1 mL e permitir que o células para apertar (~ 200 rpm) a 37 ° C por 60 min. Para uma placa LB-Amp, adicionar e espalhar 100 µ l da solução de célula e incubar durante uma noite a 37 ° C.
    2. Selecione uma única unidade formadoras da placa após incubação durante a noite e usar esta colônia para inocular 10 mL de mídia LB-Amp. Crescem as células durante a noite, com agitação (~ 200 rpm) a 37 ° C.
    3. A 10 mL de mídia, adicionar 100 µ l da solução de crescimento durante a noite e agitar os novos meios de comunicação, conforme descrito na etapa 3.1.2 a 37 ° C. Quando a densidade óptica em 600 nm (OD600) é entre 0.4-0.8, adicionar isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para obter uma concentração final da solução de 1 mM.
    4. Imediatamente retire uma alíquota de 1 mL da solução e transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com tempo rotulado = 0 horas. Gire o tubo a 15.000 x g durante 10 minutos para as células de Pelotas. Após a fiação, remover o sobrenadante e armazenar as células a 4 ° C.
    5. Retire alíquotas adicionais (1 mL cada uma) em intervalos de tempo após a adição de IPTG (normalmente em 5, 10, 12, 18 e 24 h). Conforme descrito na etapa 3.1.4, cada tubo de centrifugação, decante o sobrenadante e armazenar as células a 4 ° C.
    6. Uma vez que todas as alíquotas são obtidas, Ressuspender as células de cada commit em 30 µ l de solução de extração de proteínas bacterianas, incube-los em temperatura ambiente por 10-15 minutos e centrifugar os tubos em 15.000 × g por 5 min separar os solúveis e insolúveis proteínas.
    7. Transferir a solução de proteína solúvel para um novo tubo de microcentrifugadora e ressuspender as bolinhas restantes insolúveis com 30 µ l de solução de extração de proteínas bacterianas.
    8. Combinar a 30 µ l de cada solução (solúveis e insolúveis soluções para cada commit) com um volume igual de Laemmli buffer e, em seguida, visualize-se em um gel de SDS-PAGE40. Selecione as condições correspondentes para as vias que contenham as bandas do tamanho correto na fração solúvel para expressão de proteínas em larga escala e purificação.
      Nota: Desde proteína solúvel mínima inicialmente foi gerada usando as condições acima, vários suplementos foram adicionados para testar os efeitos sobre a expressão da proteína solúvel, com 0,2 mM L-cisteína e sulfato de amônio ferroso 0,1 mM, mostrando a proteína melhorada expressão. De acordo com esta tela de expressão da proteína, um vetor de expressão adequado para a produção de solúvel de DesB foi vetor pMAL-c5x.
  2. Após transformação em Escherichia coli BL21 (DE3), faça um estoque de DesB/pMal-c5x combinando 900 µ l de cultura bacteriana (crescida durante a noite com agitação a 200 rpm e 37 ° C) com 100 µ l de 80% de glicerol. Armazene o estoque a-80 ° C num tubo criogênico.
    Nota: Fazer um novo congelado estoque aproximadamente a cada 6-8 meses.
  3. Use uma ponta de pipeta para raspar as células do estoque congelado e começar uma cultura bacteriana, crescendo durante a noite em 5 mL de mídia LB-Amp a 37 ° C, com agitação. Inocule 1,5 litros de mídia LB-Amp em um frasco de 2 L a 37 ° C e 200 rpm, usando a cultura bacteriana crescida durante a noite.
    Nota: Devido a sensibilidade observada da proteína ao oxigênio, achou nesse espaço livre reduzido no balão e moderado sacudindo o rendimento de proteína melhorada de velocidades para expressão em grande escala.
  4. Induzir a expressão de proteínas quando a densidade óptica em 600 nm (OD600) é entre 0.4-0.8 com 1 mM IPTG e suplementado com 0,2 mM L-cisteína e 0,1 mM sulfato de amônio ferroso. Abaixar a temperatura de incubação a 30 ° C e agitar a 200 rpm. Gire para baixo as células através de centrifugação após a indução de pós 24h em 4.700 x g durante 10 minutos e descartar a mídia irradiada.
  5. Ressuspender as células em 20 mL de tampão de coluna de amilose por cada 1,5 L de crescimento, seguido pela adição de 1 mg de lisozima. Mexa por 20 minutos no gelo.
    Nota: Mais tampão pode ser adicionado se a solução for muito viscosa, como proteína soluções que sejam muito viscosas podem interromper a etapa seguinte de homogeneização.
  6. Lise a solução ressuspensão celular através de homogeneização de alta pressão com 3-5 passes a aproximadamente 15.000 psi. A proteína de transferência de um tubo de centrífuga de 50 mL e irrigue o headspace com nitrogênio por 1 min. Em seguida, centrifugar a célula lisada a 20.000 x g, durante 40 min remover os detritos insolúveis.
    Nota: Homogeneizando bem sucedida faz com que a proteína de micelas de forma como ela flui através do tubo e colocar no balão de coleção, e a solução aparece como uma cor cinzento-marrom translúcida. Manter a proteína homogeneizada no gelo durante todo o processo.
  7. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um tubo de 50 mL (mais de um pode ser necessário), tampa do tubo com um septo de borracha e com uma agulha de calibre 20, lentamente bolha nitrogênio através da solução por 2 min deslocar o oxigênio. Enrole o septo com película de parafina mais fixe-o com fio de cobre e trazer o sobrenadante para a caixa de luva, juntamente com os materiais da coluna.
  8. Equilibrar a coluna (ver passo 2.3) e carregar a proteína sobrenadante na coluna. Colete o escoamento em frações de 5 mL sob nitrogênio pressurizado moderadamente (1 gota por segundo ou aproximadamente 5 mL/min). Em seguida, lavar a coluna usando outra coluna 3 volumes, volumes de tampão de coluna de amilose e manualmente coletar frações de 3 mL em tubos de ensaio de vidro sob moderadamente pressurizado nitrogênio (cerca de 5 mL/min). Eluir a proteína usando 5 volumes de coluna (~ 50 mL) de tampão de eluição e manualmente coletar frações de 3 mL sob pressão de nitrogênio moderado (cerca de 5 mL/min).
    Nota: As frações podem alternativamente ser coletadas usando filtração por gravidade. Aproximadamente 12 fracções de eluição devem ser colhidas.
  9. Coletar 30 alíquotas µ l de frações e removê-los da caixa de luva para permitir a visualização de proteínas contendo frações através de análise de SDS-PAGE.
    Nota: As fracções recolhidas permanecem na caixa de luva para a duração do teste. DesB purificada normalmente elutes da coluna em frações de 3 a 5.

4. anaeróbio proteína concentração/Buffer Exchange

  1. Monte o concentrador de célula pressurizado, mexido com um filtro de membrana de celulose reconstituído de 76 mm (corte de 10 kDa). Adicione uma quantidade suficiente de 20% de etanol para o concentrador para manter a membrana molhada como o concentrador montado é transferido para a caixa de luva.
    Nota: Certifique-se que existem sem lágrimas na membrana, e que o-ring não é enrugado.
  2. Depois de trazer o concentrador de célula mexido na caixa de luva, lave a solução de etanol fora da membrana com água. Cap e pressurizar a célula mexida para limpar a tubulação e a membrana de qualquer excesso de água.
  3. Adicione todas as frações que contêm proteína, conforme determinado por SDS-PAGE (Figura 3) para o concentrador. Adicione o buffer de troca suficiente para produzir 150 mL de volume de solução de proteína total.
  4. Pressurizar a câmara mexido célula usando uma linha externa de2 N e concentrar a proteína para 50 mL com moderada velocidade de agitação.
    Nota: Alcançar uma concentração de 50 mL leva cerca de 20 min.
  5. Completar a 100 mL de tampão de troca com 0,1 mM ditiotreitol (DTT) e sulfato de amônio ferroso de 0,1 mM, adicionar a solução para a célula mexida e concentrar a proteína para um volume total de 50 mL com uma moderada velocidade de agitação.
  6. Depois que a solução atinge um volume de 50 mL, adicionar mais uma vez no buffer de troca completada, mas concentrar a solução para um volume total de 10 mL com moderada velocidade de agitação.
  7. Filtre a proteína concentrada usando um 0,45 µm poro filtro de seringa de tamanho e alíquota nos tubos de reação em cadeia (pcr) polimerase individual 0,2 mL (cada um contendo cerca de 150 µ l da solução da proteína). Remover as alíquotas tampadas de luvas e imediatamente flash congelá-los com nitrogênio líquido. Armazenar as alíquotas a-80 ° C.

5. dessalinização DesB

  1. Lave o saco de luva com gás nitrogênio por aproximadamente 1,5 horas antes do uso.
  2. Descongele uma alíquota de 150 µ l de proteína purificada de DesB dentro o saco, luva, no gelo.
  3. Enquanto a proteína está pronto, prepare uma pequena gravidade, dessalinização coluna contendo 3 mL de Sephadex G-25 grosseiros do desalting-gel em uma coluna de borosilicato de 9 mL. Lavar a coluna com 2 volumes de coluna (~ 6 mL) de desgaseificado do desalt reserva.
    Nota: Substitua o gel do desalting quando há uma mudança no gel de cor do branco ao amarelo (após cerca de 7 utilizações).
  4. Carrega o DesB descongelado na coluna através de um processo controlado por gravidade. Descarte o escoamento. Eluir a proteína com aproximadamente 5 mL de tampão de dessalinização.
    Nota: A pressão do tanque de gás continuamente enchendo o saco de luva afetará a taxa na qual as soluções do gotejamento da coluna.
  5. Para a determinação inicial de eluição de proteína da coluna, colete 12 frascos/elutions (contendo 3 gotas por frasco). Selado com um septo de borracha, removê-los do saco de luva e teste para a presença de proteína diretamente (por meio de análise do gel de SDS-PAGE) ou indiretamente (através de exame da atividade de cada fração).
    Nota: Normalmente, as frações são testadas individualmente para a atividade, conforme descrito no passo 7.1, com a maior atividade correspondente a fração com a maior concentração de proteína ativa. DesB geralmente elutes começando no drop-7, após o qual são recolhidas as seguintes 9 gotas de proteína demolhada. Alíquotas de proteína são armazenadas no gelo durante as medições de cinética (etapas 7.1-7.4).

6. preparação do eléctrodo de oxigénio

  1. Polir o anel de prata ânodo e o cátodo platina com eletrodo mais limpo e um cotonete úmido até que não haja nenhum sinal visível de depósitos de óxido preto.
  2. Com uma tesoura, corte aproximadamente um quadrado de 1,5 polegadas de espaçador do papel (ou papel cigarro, que funciona igualmente bem como). Em seguida, corte os cantos para ajudar o envolvimento do eletrodo 1) pequenos triângulos em cada face da Praça e fendas de 2).
  3. Adicione 5 gotas de uma solução de KCl de 50% sobre o ânodo prata groove e conectá-los para que eles formam um anel contínuo da solução. Adicione 2 gotas da solução de KCl de 50% para o topo do eléctrodo de platina. Cuidadosamente coloque o papel de espaçador em cima o eléctrodo de platina e suavizar o papel de espaçador para que não haja nenhuma bolha de ar.
    Nota: Tenha cuidado para evitar rasgar o papel de espaçador.
  4. Corte um pedaço da membrana PTFE (politetrafluoroetileno) 30m S4 é aproximadamente 2 polegadas de comprimento e coloque-o em cima do papel de espaçador. Corte as bordas da membrana, então eles estão alinhados com o anel externo do eletrodo.
  5. Utilizando o aplicador do-Ring, empurre o anel-o pequeno sobre o eletrodo para fixar o espaçador papel e membrana para o eletrodo. Coloque o maior o-ring sobre o sulco circular do eletrodo, assegurando que não há nenhuma membrana debaixo dela. Deslize a câmara superior do eletrodo na base e Dane-se os dois juntos.
    Nota: Os dois são parafusados na corretamente se nenhum pau de bolhas de ar para os lados da câmara.
  6. Coloque o eléctrodo montado na sua base e conecte o eletrodo para o sistema de monitoramento. Iniciar o programa de controle de eletrodo e calibrar o eletrodo executando o protocolo de calibração de fase líquida (Figura 4A). A variável de temperatura deve ser a temperatura da sala em que a experiência é realizada, e a pressão ambiente variável é dependente da região e as condições climáticas atuais.
    Nota: A pressão ambiente pode ser obtido de uma previsão para a região.
  7. Adicionar 1 mL de tampão Tris de 25 mM para a câmara de eletrodo, insira o êmbolo, começar a calibração de uma solução saturada de oxigênio e ajustar a velocidade do misturador de 100. Depois que estabiliza o eléctrodo, o set-point de calibração para o oxigênio é determinada solução saturada (Figura 4B).
  8. Sem retirar o êmbolo, use uma seringa de 1 mL e agulha 40 x 1.2 mm para injetar aproximadamente 1 mL de solução de ditionito de sódio na câmara, tendo o cuidado de evitar a adição de quaisquer bolhas de ar (Figura 4). Use uma rolha de borracha para selar a câmara de eletrodo imediatamente após a adição de ditionito de sódio.
  9. Permita a calibração continuar até que todo o oxigênio é utilizado e o programa é concluído e salvar a calibração (Figura 4). Aspirar a solução da câmara e enxaguar o pistão e a câmara com água desionizada, 5 - 6 vezes para assegurar a remoção completa do ditionito de sódio. Ao enxaguar, use um tubo de plástico, equipado com uma ponta de pipeta conectada a um balão de vácuo lado-braço. Evite danificar a membrana.

7. cinéticos ensaios utilizando o eléctrodo de oxigénio

  1. Identifica as alíquotas demolhadas proteicos ativo serialmente testando 1 µ l de solução enzimática para a atividade em uma solução de tampão Tris de 25 mM, com pH 7,5 e contendo 100 µM galato. Use o aliquot(s) com a maior atividade observada para os restantes experimentos. (Consulte a etapa 5.5.1)
  2. Determinar a taxa da reação enzimática, medindo O consumo de2 usando um O2-eletrodo de Clark-tipo sensível com a integração do computador através da unidade de controle do eletrodo.
    1. Para cada dados de cinética ponto medição de DesB, adicionar 1 mL de tampão Tris de 25 mM (pH 7,5) para a câmara de eletrodo. Adicione um volume calculado de uma solução stock de 25 mM de galato ao buffer Tris para obter a concentração de substrato final desejado (0,05-25 mM).
      Nota: Preparar soluções estoque frescas de galato e compostos inibitórios com água diariamente e ajustar o pH a 7,5 com a adição de 0,1 mM de NaOH, se necessário.
    2. Após 10 s do agitando para permitir a mistura da solução, Veda-se a câmara com o êmbolo lentamente e aparafuse o topo. Um tecido limpo pode ser utilizado para absorver o excesso de líquido que é deslocado da câmara. Permitir que o eletrodo equilibrar onde pode produzir uma medição estável da concentração de oxigênio na solução pelo menos 1 minuto antes de prosseguir para a adição de enzima (taxa de consumo de2 O plano de fundo de ± 0.5 µM/min).
    3. Utilizando um gás apertado 10 µ l seringa, adicione cerca de 1 µ l da enzima (aproximadamente 3-7 enzima µM) para a câmara de eletrodo através o êmbolo.
      Nota: A quantidade de enzima pode ser aumentada ou diminuída em resposta à atividade observada da alíquota específica para permitir taxas de reação suficiente.
    4. Calcular a velocidade de reação baseada na encosta do primeiro 30 s de dados lineares após adição de enzima e correto para O consumo de2 usando o 30 de fundo s de dados imediatamente antes da adição da enzima. A velocidade de catálise é igual à taxa de consumo de O2 (Figura 5A).
    5. Após a coleta dos dados para uma concentração de substrato determinada taxa, esvaziar a câmara de eletrodo através de aspiração por meio de um tubo plástico conectado a um balão de vácuo lado-braço e enxaguar várias vezes com água para 4-6 ciclos. Configure a solução no eletrodo, conforme descrito na etapa 7.2.1 usando uma nova concentração de substrato.
    6. Variam as concentrações de substrato de maneira ordenada e replicar no decorrer do experimento para conta para a diminuição da atividade enzimática com tempo (Figura 5B).
      Nota: Quando repetições de uma concentração específica são executadas e demonstram mais do que uma diminuição de 30% na taxa, em comparação com uma execução mais cedo, não há ensaios adicionais devem ser realizados com esse lote de enzima. Normalmente, após 30-40 é executado, a enzima demonstra uma diminuição de 30% na atividade.
    7. Determinar os parâmetros cinéticos, kgato (a constante catalítica para a conversão de substrato em produto) e Km (o Michaelis constante, operacionalmente definido como a concentração de substrato na qual a taxa inicial é metade da velocidade máxima), por meio de uma montagem de quadrados mínimos de dados de cada um das concentrações de substrato para a equação de Michaelis−Menten (Figura 6) usando GraphPad Prism.
  3. Adicione 4-nitrocatechol (4 NC) para testar o seu impacto sobre a cinética de dioxygenation e determinar a constante de inibição (Keu) com DesB. Para cada condição de reação, estoque soluções de Tris (50mm), galato (25mm) e 4 NC (25 mM) são combinados e diluída com água para produzir uma solução de 2 mL de tampão de 25 mM Tris (pH 7,5) com galato de 1 mM e variando as concentrações de 4 NC. O volume de 4 NC era variado para atingir a concentração de inibidor final desejado (0,05-20 mM).
    1. Após 10 segundos de agitação para permitir a mistura da solução, devagar, coloque o êmbolo na câmara e aparafuse o topo. Um tecido limpo pode ser utilizado para absorver o excesso de líquido que é deslocado da câmara. Permitir que o eletrodo equilibrar e produzir uma medição estável de concentração de oxigênio na solução pelo menos 1 minuto antes de prosseguir para a adição de enzima (taxa de consumo de2 O plano de fundo de ± 0.5 µM/min).
    2. Conforme descrito anteriormente, adicionar a proteína (etapa 7.2.3), determinar a taxa de reação (etapa 7.2.4) e redefinir o eletrodo para a seguinte condição.
    3. Como parte desta série de experimentos, determine a taxa de reação na ausência de inibidor várias vezes. Determine a inibição pela padronização das taxas de consumo de oxigênio na presença de diferentes concentrações do inibidor com substrato de 1 mM e ausência de inibidor (v/vo).
    4. Cabe a inibição de galato dioxygenation a equação de 7.3A e, em seguida, os dados de inibição à equação 7.3B usando um programa gráfico (Figura 7).
  4. Determine a concentração de enzima precisos para cada experimento através da realização de um ensaio de Bradford após a conclusão de todas as execuções de cinéticas.
    Nota: Todos os preços foram corrigidos para concentração de enzima. Esta etapa não precisa ser feito em uma caixa de luva ou saco de luva.

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Resultados

É mostrada a análise do gel de SDS-PAGE de frações individuais de purificação da construção de fusão de DesB-maltose ligação proteína (MBP) (Figura 3). O gel revela que a proteína é pura (MW = 91.22 kDa), exceto a presença de DesB (MW = 49.22 kDa) e domínio da proteína MBP (42 kDa) clivada do outro. Fracções E2 e E3 foram selecionados para a concentração (etapa 4.2).

Resultados reprodutíveis de DesB...

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Discussão

Os passos críticos na obtenção de ativa, purificada da proteína DesB envolvem a formação e manutenção do site ativo da FE reduzido na enzima. Como tal, corrigir o desempenho da indução, purificação, concentração, e passos do desalting são essenciais para obter com sucesso a enzima activa. Induzindo a expressão de proteínas em presença de sulfato de amônio ferroso de 1 mM garante que FE corretamente é incorporada ao sítio ativo de DesB. Este método é inspirado por estudos como aqueles com amidohydrolase metaloenzimas, que...

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Divulgações

Os autores têm sem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer o Dr. Camille Keller da Wesleyan University para suporte técnico. Professor Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk pela University of British Columbia, bem como Christian Whitman a Universidade do Texas em Austin, um agradecimento especial por seus conselhos sobre métodos de purificação de proteínas anaeróbico e o uso de um O2 -eletrodo sensível.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ouro Isopropílico β-D-1-tiogalactopiranodiseBio TechnologiesI2481C50
Coomassie Azul Brilhante R-250Bio-Rad161-0400
Persulfato de amônioBio-Rad161-0700
30% AcrilamidaBio-Rad161-0158
N,N'tetrametil-etilenodiaminaBio-Rad161-0801
Resina de amilose High FlowNew England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) células competentes de Escherichia coliNew England BiolabsC2527I
L-cisteínaSigma AldrichC7352
ácido gálicoSigma AldrichG7384
4-nitrocatecolSigma AldrichN15553
Ferroso sulfato de amônioMallinckrodt5064
Ditionito de sódioAlfa Aesar33381-22
frascos de soro wheatonFisher Scientific06-406G
Filtro de seringa Acrodisc PF de 25 mm com Supor MembranePall Corportation4187
400 mL Amicon Agitado Concentrador de Células EMDMilliporeUFSC40001
Filtro de membrana de celulose reconstituída de corte Millipore Ultracel de 76 mm 10 kDaEMD MilliporePLGC07610
DL-ditiotreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 coluna gal de dessalinização grossaGE Healthcare17-0033-01
Frascos de 2 mLFisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus Unidadede Controle de EletrodoCâmaraHansatech Instruments OXYG1 Plus
Hansatech InstrumentsDW1
Disco de EletrodoHansatech InstrumentsS1
PTFE (0,0125 mmX25mm) Bobina de 30mHansatech InstrumentsS4
Kit de limpeza de eletrodosHansatech InstrumentsS16
Papel espaçadorZig Zagdisponível em qualquer posto
Porta-luvas Dri-Lab da série HeVacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-TrainVacuum/Atmospheres Company
Espátula de Aço Inoxidável Micro-Cônica de Dupla ExtremidadeFisher Scientific21-401-10
DWK Life Sciences Coluna Flexível Kimble Kontes Coluna EconômicaFisher Scientifick420400-1530
10 μ L, Modelo 701 N SYR, NDL cimentado 26s ga, 2 pol, ponta stlye 2 seringaHamilton80300
DWK Life Sciences Coluna Flex Kimble Kontes Coluna EconômicaFisher ScientificK420401-1505
Emulsiflex-C5 homogeneizador de alta pressãoAvestin
B-PER Reagente Completo de Extração de Proteína BacterianaThermo Fisher Scientific89821
Lisozima de clara de ovo de galinhaSigma Aldrich12650-88-3
Dodecil sulfato de sódioThermo Fisher Scientific151-21-3
ampicilinaSigma Aldrich7177-48-2
TriptonaFisher ScientificBP-1421-500
Extrato de leveduraFisher ScientificBP1422-2
Cloreto de sódioFisher ScientificS271-10
Cloreto de PotássioFisher ScientificP217-3
Cloreto de MagnésioFisher ScientificM33-500
DextroseFisher ScientificD16-3
Hidróxido de SódioFisher ScientificS318-1
Cloridrato de TrisFisher ScientificBP153-500
MaltoseFisher ScientificBP684-500
GlicinaFisher ScientificG46-500
de Eletrodo de Oxigênio de gasolina

Referências

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