Artigo de método

Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração

DOI:

10.3791/58310

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9 de novembro de 2018

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1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos dois protocolos de isolamento de vesículas extracelulares, centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade, para isolar vesículas extracelulares de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar murino. As vesículas extracelulares derivadas do líquido de lavagem broncoalveolar murino por ambos os métodos são quantificadas e caracterizadas.

Resumo

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Vesículas extracelulares (EVs) são componentes subcelulares recém-descobertas que desempenham importantes funções no biológico muitas funções de sinalização durante Estados fisiológicos e patológicos. O isolamento de EVs continua a ser um grande desafio neste campo, devido às limitações intrínsecas de cada técnica. A ultracentrifugação diferencial com método de centrifugação gradiente de densidade é uma abordagem comumente usada e é considerada o procedimento padrão ouro para isolamento de EV. No entanto, este procedimento é demorado, trabalhoso e geralmente resulta em baixa capacidade de expansão, que pode não ser adequada para amostras de pequeno volume, como o líquido de lavagem broncoalveolar. Demonstramos que um método de isolamento de centrifugação de ultrafiltração é simples e eficiente tempo - e do trabalho ainda fornece uma recuperação de alto rendimento e pureza. Propomos que este método de isolamento pode ser uma abordagem alternativa que é adequada para o isolamento de EV, particularmente para pequenos volumes de espécimes biológicos.

Introdução

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Exosomes são o menor subconjunto de EVs, 50 – 200 nm de diâmetro e tem várias funções biológicas através de um diversificado leque de sinalização processos1,2,3,4,5. Eles governam a homeostase celular e tecido principalmente, facilitando a comunicação intercelular através de moléculas de carga como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos6,7,8,9 . Um passo fundamental na pesquisa de EV é o processo de isolamento. Ultracentrifugação diferencial (UC), com ou sem centrifugação gradiente de densidade (DGC), é considerada a padrão-ouro de abordagem, mas esse método carrega maiores limitações, incluindo taxas de recuperação de EV ineficientes e baixa escalabilidade10 , 11 , 12, que restringem a sua melhor utilização para amostras de volume maiores, tais como célula cultura exossomo sobrenadante ou alta produção. As vantagens e desvantagens dos outros métodos, como exclusão de tamanho por ultrafiltração ou cromatografia, immunoaffinity isolamento por grânulos ou colunas e microfluídica, são bem descritas e modernos procedimentos suplementares têm sido desenvolvidos para superar e minimizar as limitações técnicas em cada abordagem11,12,13,14,15. Outros têm mostrado que uma centrifugação de ultrafiltração (UFC), com uma membrana nanoporous na unidade de filtro é uma técnica alternativa que fornece pureza comparável a uma UC método16,17,18. Esta técnica pode ser considerada como um dos métodos alternativos de isolamento.

Líquido de lavagem broncoalveolar (LBA) contém EVs que possuem inúmeras funções biológicas em várias condições respiratórias de19,20,21,22. Estudando EVs BALF-derivado implica alguns desafios devido a invasão do procedimento de broncoscopia em seres humanos, bem como uma quantidade limitada de recuperação de líquido de lavagem. Em animais de laboratório pequenos tais como ratos, apenas alguns mililitros podem ser recuperados em condições normais de pulmão, muito menos em pulmões inflamados ou fibróticas23. Por conseguinte, coletar uma quantidade suficiente de LBA para isolamento de EV por uma ultracentrifugação diferencial para aplicações a jusante pode não ser viável. No entanto, isolar populações de EV corretas é um fator crucial para o estudo de funções biológicas de EV. O delicado equilíbrio entre eficiência e eficácia continua a ser um desafio bem estabelecidos métodos de isolamento de EV.

Neste estudo atual, podemos demonstrar que uma abordagem de ultrafiltração centrífuga, utilizando uma 100 kDa peso molecular de corte (MWCO) nanomembrane unidade filtrante, é adequada para pequeno volume de amostra biológica como BALF. Esta técnica é simples, eficiente e fornece alta pureza e escalabilidade para apoiar o estudo de EVs BALF-derivado.

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Protocolo

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A utilização de animais e todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comitês (IACUC) no Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).

1. preparação e coleta de fluido (LBA) murino lavagem broncoalveolar

  1. Coleção de LBA
    1. Eutanásia em ratos com um coquetel de cetamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) através da rota intraperitoneal, seguida por deslocamento cervical.
    2. Inserir uma angiocatheter 22 G na traqueia. Anexar uma seringa de insulina contendo 1 mL (mL) de soro de tampão de fosfato de Dulbecco estéril gelada (DPBS) e instilar 1ml de DBPS em ambos os pulmões através da angiocatheter.
    3. Retire lentamente o êmbolo da seringa para recuperar BALF e dispense a LBA em um tubo cónico de 50 mL. Manter a LBA no gelo.
    4. Repita as etapas 1.1.2 e 1.1.3 3 x (4 x no total em cada rato).
      Nota: Aproximadamente 0,8 mL geralmente é obtida por mililitro de instilação. Além disso, as seguintes etapas podem ser executadas para ratos individuais (ou seja, 3 mL de LBA), mas pool de amostras múltiplas de BALF irá permitir o isolamento de um lote maior de EVs para consistência em experimentos a jusante.
  2. Preparação do LBA
    1. BALF do pool de 25 ratos e divida-o em dois conjuntos iguais (~ 35 mL por alíquota).
    2. Centrifugue a LBA a 400 x g, a 4 ° C por 5 min, para remover as células e outros restos celulares e recolher o sobrenadante.
    3. Centrifugue o sobrenadante a 1.500 x g, a 4 ° C por 10 min, para remover detritos de células. Recolher o sobrenadante e avançar para as etapas de isolamento de EV.

2. isolamento de vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino

Nota: Neste estudo, técnicas de isolamento de dois EV, nomeadamente UFC e ultracentrifugação com flutuante usado para isolar EVs do LBA. O protocolo detalhado de cada método é descrito abaixo.

  1. Método de enriquecimento ultrafiltração centrifugação (UFC)
    Nota: Este método foi modificado de um protocolo descrito anteriormente10.
    1. Filtrar o sobrenadante da etapa 1.2.3 através de um filtro de seringa estéril 0,2 μm e mantenha o filtrado BALF no gelo.
      Nota: Este é um passo de exclusão de tamanho no qual apenas vesículas menores que 200 nm são coletados.
    2. Equilibrar a unidade de filtro centrífugo MWCO 100 kDa com DPBS estéril durante 10 min. centrifugar a unidade centrífuga a 1.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C para descartar o DPBS.
      Atenção: Uma vez que a membrana do dispositivo de filtro é incubada com DPBS, a membrana deve ser mantida molhada em todo tempo, até que o dispositivo é usado.
    3. Encher a unidade de filtro com 15 mL da amostra BALF passo 2.1.1 e centrifugação a 3.000 x g por 30 min a 4 ° C. O fluxo através do LBA pode ser descartado ou coletado em um tubo canônico separado e armazenado a-80 ° C para uso futuro.
    4. Repita a etapa 2.1.3 para os restantes 0,2 µm-filtrado BALF.
      Nota: Demorou três repetições de centrifugações suficientemente concentrar o SVE BALF do volume inicial original de 35 mL. Isto resultou em 1-1,5 mL de retentate.
    5. Lave o retentate com 14 mL de DPBS estéril pipetando um suavemente repetidamente. Centrifugação a 3.000 x g, a 4 ° C por 30 min, a unidade de filtro para remover o DPBS e concentrar o retentate EV.
    6. Recolha o concentrado EVs BALF-derivado do dispositivo de filtro inserindo uma pipeta na parte inferior do dispositivo de filtro e retirar a amostra usando um movimento de varredura de lado a lado para garantir a recuperação total.
    7. Alíquota do EVs BALF-derivado e armazená-los a-80 ° C para quantificação de partículas e caracterização (ver passo 3).
  2. Ultracentrifugação (UC) com centrifugação gradiente de densidade flutuante (DGC)
    Nota: O seguinte protocolo foi modificado do protocolo descrito anteriormente24.
    1. Transferir o sobrenadante da etapa 2.1.1 em um tubo de 37 mL se e centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 30 min a 4 ° C, usando-se. Recolha o sobrenadante e centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por 60 min. Enquanto as pelotas EV são centrifugadas, prepare diferentes concentrações de buffers de gradiente de densidade flutuante (tabela 1) para etapa 2.2.3.
    2. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de EV em 200 μL de DPBS.
    3. Misturar a suspensão EV com 300 μL de solução de trabalho de 50% iodixanol (tabela 1) e transferir para o tubo se 15 mL. Em cima da suspensão de mistura de 50% iodixanol-EV, sequencialmente camada de solução-tampão de seguir na ordem de baixo para cima: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% de iodixanol (3ml), 15% iodixanol (2,5 mL) e 5% iodixanol (6 mL). Centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C para 230 min.
      Nota: O gradiente de densidade flutuante baseia a porcentagem do iodixanol dimensionamento com a maior concentração (50%) na parte inferior para a menor concentração (5%) na parte superior. Para gerar diferentes concentrações do iodixanol, várias quantidades de meio de homogeneização (tabela 1) foram misturadas com solução de trabalho (50% iodixanol).
    4. Coletar a fração de 15% e 25% e diluí-los em DPBS estéril para que apareça o volume de 15 mL. Transferi-los para um novo tubo pequeno se e centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por 60 min.
    5. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as pelotas de EV em 50 μL de DPBS estéril para caracterização mais.

3. quantificação de vesículas extracelular

Nota: O rendimento de recuperação EVs BALF-derivado é quantificado com duas métricas.

  1. Nanopartículas, acompanhamento de medição de análise (NTA)
    1. Diluir a amostra EV em 1: 200 – 1: 500 em 1 mL de DPBS e carga da amostra em uma seringa de insulina. Anexar uma seringa de amostra para uma bomba de seringa e começar a medir os números de partículas e tamanho (ver Tabela de materiais).
    2. Defina o nível de câmera no 14 e o limite de deteção em 1 para todas as medições de amostra. Cinco medições repetitivas com 1.500 quadros em 30 s foram registrados para cada amostra, com um atraso de 20 s entre leituras. Combinar e média dos dados para relatórios de tamanho e concentração final.
      Nota: Para capturar exato de todas as partículas, ajuste o nível de câmera conforme apropriado para visualizar todas as partículas e usar configurações semelhantes para todas as medições de amostra em cada experimento.
  2. Quantificação da proteína
    Nota: O ensaio da proteína bicinchoninic ácido (BCA) foi usado para medir a concentração de proteína de EVs BALF-derivado.
    1. Solubilize as amostras EV em 1 tampão de lise de x.
    2. Quantificar a quantidade de proteína em EVs BALF-derivado por um protocolo padrão de BCA usando Detecção colorimétrica medindo a absorbância em 560 nm em um leitor de placa.

4. detecção de vesículas extracelulares BALF-derivado

Nota: Exossomo comumente conhecido marcador de superfície proteínas (TSG101, CD63, CD81 e CD9) foram usadas para verificar as recuperações EV por análise de citometria de fluxo e immunoblotting e SDS-PAGE.

  1. SDS-PAGE e immunoblotting
    1. Dissolva uma quantidade igual de proteínas EV de cada amostra com uma mancha carregando buffer (Dodecil sulfato de lítio) e 50mm ditiotreitol (DTT) em um tubo de 1,6 mL. Aquece as amostras a 70 ° C por 10 min.
    2. Carregar as amostras da etapa 4.1.1 em um gel de acrilamida Bis-Tris Plus de 4 – 12% e executar eletroforese (150 volts, 35 mA) por 35 min.
    3. Transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose, usando um método de transferência secos.
    4. Bloquear a membrana com leite desnatado de 5% para 60 min, balançando à temperatura ambiente (RT).
    5. Incube a membrana com um anticorpo de um marcador de proteína de superfície de EV, Tumor susceptibilidade genética 101 (TSG101), a diluição de 1: 500 em BSA 5% em solução tampão salino Tween-20 (TBST) a 4 ° C, durante a noite de balanço.
    6. No dia seguinte, lave a membrana 3 x, 10 min cada um lavar, buffer de TBST e incube-lo com anti-coelho IgG, um anticorpo HRP-lig, a diluição de 1:5,000 por 60 min em RT
    7. Lavar a membrana 3 x, 10 min a cada lavagem, no buffer TBST. Desenvolva a membrana com quimioluminescente reagente HRP anticorpo de detecção e imagem (consulte a Tabela de materiais para sistema de imagem).
  2. Citometria de fluxo
    1. Dilua BALF-derivado EVs em 49 μL de tampão (PBS + 5 mM EDTA + 0.5% BSA, filtrada através de uma membrana de filtro de seringa 0.1 μm) a coloração de crack.
    2. Adicionar cada um dos seguintes anticorpos em cada amostra individual: 1) Anticorpo de PE CD63 rato anti-rato (100 ng por reação); 2) anti-rato rato PE CD81 (500 ng); 3) anti-rato rato FITC CD9 (200 ng). Incube a 4 ° C, balançando para 60 min no escuro.
    3. Diluir as amostras com 450 μL de filtro de membrana de crack coloração reserva e submeter as amostras para análise de citometria de fluxo (ver Tabela de materiais)25.
    4. Ajustar as configurações de citômetro de fluxo como segue: 1) conjunto de todos os canais no hiper log (hlog); 2) definir o gatilho no SSC em 4; 3) desliga o segundo gatilho. Executar as amostras em uma configuração de baixa velocidade e adquirir pelo menos 10.000 eventos em cada amostra.
    5. Realizar análise de dados de baixa citometria em cada amostra utilizando o software de análise (ver Tabela de materiais).

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Resultados

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Realizamos EV isolamento do mouse BALF usando métodos de isolamento de UFC e UC-DGC no mesmo dia. O método UFC necessário aproximadamente 2,5 – 3 h, Considerando que a técnica de UC-DGC necessários 8 h de tempo de processamento. Isto não incluíam buffers e tempo de preparação do reagente. Note-se que algumas outras tarefas podem ser realizadas durante os períodos de tempo de centrifugação. No entanto, todo o procedimento durou quase um dia inteiro para a técnica de isolamento de UC-DGC.

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Discussão

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Nas últimas décadas, os cientistas têm desvendados os significados de EVs na homeostase celular. Mais importante, EVs jogar papéis importantes em muitos processos de doença, modulando as células vizinhas e distantes a sua carga bioativos moléculas1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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O trabalho é suportado por subvenções NHLBI/NIH HL103868 (para PC) e HL137076 (para PC), o americano coração Associação Brasileira (para PC) e o prêmio de pesquisa de câncer de pulmão Samuel Oschin abrangente Cancer Institute (SOCCI) (para PC). Gostaríamos de expressar nosso grande apreço ao Instituto do coração Smidt no Cedars-Sinai Medical Center que fornece-em uma máquina de Nanosight para análise de rastreamento de nanopartículas de EV.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
Amicon Filtros centrífugos Ultra-15 Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SacaroseSigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
Cloreto de SódioSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753Gradiente de Densidade Médio
CetaminaVetOne, Boise, ID13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
Seringa 1 mLBD Seringa, Franklin Lakes, NJ309656
Angiocateter 20 GBD Seringa, Franklin Lakes, NJ381703
Tubos de centrífuga 15 mLVWR, Radnor, PA89039-666
Tubos de centrífuga 50 mLCorning Cellgro, Manassas, VA430828
Ensaio de proteína de ácido bicincônico (BCA)Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Anticorpo TSG101 anti-camundongode coelho AbCam, Cambridge, MAAB125011
Anticorpo anti-rato PE-CD63 de ratoBiolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
IgG anti-coelho, anticorpo ligado a HRPde sinalização celular, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Agente redutor (Bolt)
10x Tampão de lise (Bolt)Tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus gel de acrilamidaInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Mini pilhas de nitroceluloseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Reagente de detecção de anticorpos HRP quimioluminescente HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Tubos de ultracentrífuga 17 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
Tubos de ultracentrífuga 38,5 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Filtros de Seringa SFCA Corning 0.2 µ m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
CentrifugeEppendorf, Hamburgo,Alemanha-Ultracentrifuge
Beckman Coulter, Pasadena,CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire, ReinoUnido-Paramedir a distribuição de tamanho de partícula e concentração de partículas
MACSQuant Analyzer 10 citômetro de fluxoMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Alemanha-iBlot
Transfer ApparatusThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10Software de análise
Tecnologia

Referências

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