Aqui, descrevemos dois protocolos de isolamento de vesículas extracelulares, centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade, para isolar vesículas extracelulares de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar murino. As vesículas extracelulares derivadas do líquido de lavagem broncoalveolar murino por ambos os métodos são quantificadas e caracterizadas.
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Artigo de método
Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vesículas extracelulares (EVs) são componentes subcelulares recém-descobertas que desempenham importantes funções no biológico muitas funções de sinalização durante Estados fisiológicos e patológicos. O isolamento de EVs continua a ser um grande desafio neste campo, devido às limitações intrínsecas de cada técnica. A ultracentrifugação diferencial com método de centrifugação gradiente de densidade é uma abordagem comumente usada e é considerada o procedimento padrão ouro para isolamento de EV. No entanto, este procedimento é demorado, trabalhoso e geralmente resulta em baixa capacidade de expansão, que pode não ser adequada para amostras de pequeno volume, como o líquido de lavagem broncoalveolar. Demonstramos que um método de isolamento de centrifugação de ultrafiltração é simples e eficiente tempo - e do trabalho ainda fornece uma recuperação de alto rendimento e pureza. Propomos que este método de isolamento pode ser uma abordagem alternativa que é adequada para o isolamento de EV, particularmente para pequenos volumes de espécimes biológicos.
Introdução
Exosomes são o menor subconjunto de EVs, 50 – 200 nm de diâmetro e tem várias funções biológicas através de um diversificado leque de sinalização processos1,2,3,4,5. Eles governam a homeostase celular e tecido principalmente, facilitando a comunicação intercelular através de moléculas de carga como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos6,7,8,9 . Um passo fundamental na pesquisa de....
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Protocolo
A utilização de animais e todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comitês (IACUC) no Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. preparação e coleta de fluido (LBA) murino lavagem broncoalveolar
- Coleção de LBA
- Eutanásia em ratos com um coquetel de cetamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) através da rota intraperitoneal, seguida por deslocamento cervical.
- Inserir uma angiocatheter 22 G na traqueia. Anexar uma seringa de insulina contendo 1 mL (mL) de soro de tampão de fosfato de Dulbecco estéril gelada (DPBS) e instilar 1ml de DBPS em ambos os pulmões através d....
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Resultados
Realizamos EV isolamento do mouse BALF usando métodos de isolamento de UFC e UC-DGC no mesmo dia. O método UFC necessário aproximadamente 2,5 – 3 h, Considerando que a técnica de UC-DGC necessários 8 h de tempo de processamento. Isto não incluíam buffers e tempo de preparação do reagente. Note-se que algumas outras tarefas podem ser realizadas durante os períodos de tempo de centrifugação. No entanto, todo o procedimento durou quase um dia inteiro para a técnica de isolamento de UC-DGC.
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Discussão
Nas últimas décadas, os cientistas têm desvendados os significados de EVs na homeostase celular. Mais importante, EVs jogar papéis importantes em muitos processos de doença, modulando as células vizinhas e distantes a sua carga bioativos moléculas1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O trabalho é suportado por subvenções NHLBI/NIH HL103868 (para PC) e HL137076 (para PC), o americano coração Associação Brasileira (para PC) e o prêmio de pesquisa de câncer de pulmão Samuel Oschin abrangente Cancer Institute (SOCCI) (para PC). Gostaríamos de expressar nosso grande apreço ao Instituto do coração Smidt no Cedars-Sinai Medical Center que fornece-em uma máquina de Nanosight para análise de rastreamento de nanopartículas de EV.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Amicon Filtros centrífugos Ultra-15 Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sacarose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Cloreto de Sódio | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Gradiente de Densidade Médio |
| Cetamina | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Seringa 1 mL | BD Seringa, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocateter 20 G | BD Seringa, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Tubos de centrífuga 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Tubos de centrífuga 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Ensaio de proteína de ácido bicincônico (BCA) | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Anticorpo TSG101 anti-camundongo | de coelho AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Anticorpo anti-rato PE-CD63 de rato | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| IgG anti-coelho, anticorpo ligado a HRP | de sinalização celular, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Agente redutor (Bolt) | |||
| 10x Tampão de lise (Bolt) | Tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus gel de acrilamida | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Mini pilhas de nitrocelulose | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Reagente de detecção de anticorpos HRP quimioluminescente HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Tubos de ultracentrífuga 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Tubos de ultracentrífuga 38,5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Filtros de Seringa SFCA Corning 0.2 µ m pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburgo, | Alemanha-Ultracentrifuge | |
| Beckman Coulter, Pasadena, | CA-Nanosight | ||
| (NS300) | Malvern, Worcestershire, Reino | Unido-Para | medir a distribuição de tamanho de partícula e concentração de partículas |
| MACSQuant Analyzer 10 citômetro de fluxo | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, | Alemanha-iBlot | |
| Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad | ||
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Software de análise |
Referências
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of B....
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Reimpressões e permissões
