Quantificar intermembranar distâncias com dilatações imagem Serial

Summary

O objetivo desse algoritmo é continuamente medir a distância entre duas arestas 2-dimensional usando pathfinding e dilatações imagem serial. Esse algoritmo pode ser aplicado a uma variedade de campos como cardíaca biologia estrutural, biologia vascular e engenharia civil.

Abstract

Um nanodomain recentemente descrito extracelular, denominado o perinexus, tem sido implicada em ephaptic de acoplamento, que é um mecanismo alternativo para a condução elétrica entre cardiomyocytes. O método atual de quantificar este espaço por segmentação manual é lento e tem baixa resolução espacial. Desenvolvemos um algoritmo que usa dilatações imagem serial de um contorno binário para contar o número de pixels entre dois opostos 2 bordas dimensionais. Este algoritmo requer poucos homens-horas e tem uma resolução espacial maior do que o método manual, preservando a reprodutibilidade do processo manual. Na verdade, experientes e investigadores de principiante foram capazes de recapitular os resultados de um estudo anterior com esse novo algoritmo. O algoritmo é limitado pelo humana entrada necessários manualmente delinear o perinexus e o poder computacional principalmente oneradas por um algoritmo de pathfinding pré-existente. Entretanto, o algoritmo para recursos de alta produtividade, alta resolução espacial e reprodutibilidade tornam uma ferramenta de medição versátil e robusto para uso através de uma variedade de aplicações que exigem a medição da distância entre quaisquer 2-dimensional (2D ) as bordas.

Introduction

O seguinte algoritmo foi desenvolvido para medir a distância intermembranar entre dois cardiomyocytes estruturalmente acoplados no ponto separam uns dos outros na borda de uma chapa de junção de lacuna em um nanodomain o perinexus¹, que tem sido implicada em ephaptic acoplamento^2,3,4,5. Em processo de análise de centenas de imagens de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão de perinexi usando um método de segmentação manual em um anterior estudo⁶, identificou-se a necessidade para um método de maior rendimento que amostradas largura perinexal no mais alto resolução espacial preservando a precisão do processo de segmentação manual anterior durante a segmentação manual, as linhas são desenhadas em intervalos de 15 nm, aproximadamente ortogonais à linha central, para medir a largura de perinexal. O novo algoritmo leva um contorno binário grosso de um pixel de duas linhas paralelas e usa dilatações imagem serial para contar o número de pixels entre as duas membranas. Enquanto dilatações de imagem comumente têm sido usadas em uma infinidade de aplicações de processamento de imagem, incluindo o contorno ou borda deteção^7,8, este algoritmo usa dilatações como um mecanismo de contagem. A linha central é então isolado usar uma largura de⁹ e perinexal de algoritmo pathfinding é então medido com uma resolução ao longo do comprimento de perinexus igual a resolução da imagem. Neste caso, a diferença de resolução é 1 medição por 15 nm para segmentação manual e 1 medição por 0,34 nm com o novo algoritmo, um 44-fold aumento da frequência de amostragem espacial. Além disso, este aumento frequência de amostragem é realizada em aproximadamente 1/5^th o tempo necessário para segmentação manual.

Este algoritmo será usado em sua forma atual para medir a largura de perinexal para o convencional 0-150 nm da borda de um fosso junção placa⁵ (GJ), bem como dentro de uma região especificada de interesse, onde o perinexus platôs entre 30 e 105 nm^{2 , 3 , 10}. a maior frequência de amostragem reduz a variabilidade nas medições individuais perinexus comparado a segmentação manual e significativamente encurta o tempo de análise, permitindo processamento eficiente de grandes conjuntos de dados. No entanto, este programa não está limitado a imagens de nanoescala TEM de discos intercalados cardíacas. A mesma abordagem pode ser usada para quantificar o diâmetro vascular, fração de ejeção ventricular ou até mesmo não-biológico fenômenos como Rio erosão ou inundações. Este algoritmo é apropriado para quantificar a distância entre quaisquer duas bordas quase paralelas.

Protocol

Nota: O Software necessário são ImageJ (ou software de modificação de imagem similar) e Matlab R2015. O usuário pode encontrar problemas de compatibilidade com outras versões do Matlab.

1. pré-processamento de imagens

1. Para qualquer imagem em tons de cinza, certifique-se do valor de intensidade máxima de qualquer determinado pixel é < 255. Isto é normalmente feito subtraindo um valor de 1 da imagem no programa Matlab personalizada "ImageSub.m", incluído no arquivo suplementar S1.

2. a Perinexus de estrutura de tópicos

1. Delinear o perinexus no ImageJ ou outro software de processamento de imagem.
2. Certifique-se que o contorno é um pixel de espesso e é definido como o valor mais alto de intensidade em uma imagem (255 em uma imagem em tons de cinza de 0 a 255).
3. Identificar o GJ por estrutura pentalaminar^11,12e definir o início da perinexus como o ponto no qual os dois opostos da membrana celular bilayers divergem, como mostrado na Figura 1A. Begin ~ 200 nm da borda da GJ, rastreamento da membrana interna da célula primeira e volta ao longo da membrana interna da segunda célula. No ImageJ, solte a caneta para automaticamente fechar o contorno. Este fechamento artificial será cortado para fora mais tarde.
   Nota: É fundamental delinear o perinexus com grande cuidado em como alta uma ampliação possível, pois mesmo pequenas aplicações mis da estrutura de tópicos podem resultar em vários nanômetros de erro na medição final.

3. criação de algoritmo e selecionar Perinexus de interesse

Nota: O algoritmo de pathfinding requer o autógrafo, borda, gráfico, nó e Pathfinding funções⁹ para estar no mesmo diretório que o arquivo MembraneSepDist-m. Todos os arquivos podem ser encontrados no arquivo suplementar S1.

1. Selecione salvar locais para dados e números. Estes são atualmente embutido no arquivo-m.
   Nota: A primeira linha do programa é uma função para limpar todas as variáveis, feche todas as janelas e limpar a janela de comando. Salve qualquer variáveis desejadas ou figuras antes de executar o arquivo de m.
   Nota: O Software screenshots são incluídos no arquivo suplementar S2 para todos os valores codificados.
2. Execute o programa "MembraneSepDist.m".
3. Definir parâmetros.
   Nota: Um GUI pop-up com parâmetros padrão para o limite de gradiente, escala, região de interesse e inicialização manual. Os valores padrão podem ser alterados no arquivo-m, ou podem ser mudados para cada imagem individual.
   1. Conjunto espacial derivado gradiente limiar.
      Nota: Valores mais altos resultam em mais pontos selecionados no isolamento da linha central. Valores que são muito alto ou muito baixo (fora de um intervalo de aproximadamente 3.0-7,9) podem resultar em ineficiência computacional ou uma seleção imprecisa dos pontos da linha central, gerando isolamento imprecisa da linha central (ver Figura 2A-C).
   2. Definir a escala em unidades de pixels/escala.
   3. Defina os limites superiores e inferiores espaciais para a região de interesse.
      Nota: Por convenção do nosso laboratório, a região definida de interesse é entre 30 e 105 nm da borda do GJ^2,3,10.
   4. Definido início automático/manual. Na maioria dos casos, o algoritmo detecta com precisão o ponto de partida onde as extremidades de junção de lacuna e perinexus começa. No entanto, em alguns casos de perinexi irregulares, o usuário deve identificar o ponto de partida manualmente. Defina esse valor como 0 para automático, 1 para manual.
4. Selecione a imagem desejada.
   Nota: Seleccione a pasta do arquivo pode ser alterada no arquivo-m.
5. Recorte a imagem para selecionar o perinexus de interesse.
   1. Quando a imagem aparece, o cursor mudará automaticamente para uma cruz. Recorte a imagem arrastando uma caixa ao redor da perinexus de interesse (ver Figura 3). A caixa de colheita pode ser ajustada usando-se os quadrados sobre os lados e cantos para torná-lo maior ou menor.
   2. Ao corte, certifique-se a extremidade "aberta" do perinexus (mais afastada do GJ, ver Figura 3) é cortada para que a dois membrana contornos atingir a borda da imagem recortada.
      Nota: É recomendável tornar a imagem em tela inteira para ver o perinexus de interesse e mais facilmente cortar adequadamente.
6. Selecione a safra final clicando com o cursor entre as bordas opostas a ser medido.
   Nota: É fundamental que o clique duplo ser realizada dentro do perinexus. Se o programa não consegue identificar uma linha de centro, reinicie o programa e certifique-se de que o clique ocorre dentro do perinexus.
7. Observe o final da linha central após todas as dilatações e erosões pop para uma avaliação de usuário final da eficácia do programa.
   Nota: Uma caixa de diálogo aparecerá na tela enquanto o programa está sendo executado para informar ao usuário que o Matlab será incapaz de processar quaisquer comandos adicionais, até que o programa tenha terminado. Quanto tempo leva este processo depende do tamanho da matriz (imagem) e poder de processamento de computador.
8. Se o ponto de partida manual é habilitado, observar a imagem da linha de centro pop-up sobre a imagem anatômica original, juntamente com um cursor de mira (ver Figura 2). Selecione um ponto fora do perinexus perto do ponto inicial desejada.
   Nota: O programa irá encontrar o ponto da linha central mais próximo ao pixel selecionado e usar isso como o ponto inicial.
9. Registro de dados.
   Nota: Quando o programa tiver terminado, o programa retornará uma linha central mapeada, trama de largura perinexal em função da distância da borda da GJ. Além disso, o programa irá retornar a largura média perinexal até 150 nm da borda do GJ, bem como a média de dentro da região definida do interesse na linha de comando do Matlab. Valores de_p W e distâncias desde o GJ são armazenadas na variável "WpList" ou o usuário pode registrar manualmente-los separadamente.

4. algoritmo de solução de problemas

1. Se a central não estiver devidamenteidentificados (Figura 2),Abra a figura "Gmag" e usar o índice para identificar um limite de gradiente apropriado (Figura 2C).
2. Se o ponto de partida não é identificado corretamente, defina o ponto inicial manualmente (ver protocolo 3.8).

Results

Métodos estatísticos: Foram feitas comparações entre os grupos experimentais usando testes t de Student. Um p-valor < 0,05 é considerado significativo e todos os valores são representados como média ± desvio-padrão.

Segmentação manual. A quantificação da GJ-adjacente perinexus nanodomain largura (W._p) normalmente é realizada pela segmentação manual. Este processo de segmentação manual é demonstrado na Figura 1A e foi descrito anteriormente⁶. O observador identifica a borda da GJ (Figura 1, ponto vermelho), mede 5nm ao longo do centro do perinexus e mede a distância entre as membranas nesse ponto. O processo então é repetido em 10, 15, 30 e cada 15 nm até 150 nm. Esta técnica, ao mesmo tempo eficaz, tem limitações de tempo e espacial sob amostragem ao longo do comprimento da perinexus.

Quer dizer W_p medidas de estudos anteriores podem variar de aproximadamente 10 a 20 nm^2,3,10e 3 nm parece ser a diferença média necessária para detectar a significância estatística, que é bem acima da frequência de Nyquist espacial de 0,7 nm por medição com base em uma resolução de interpixel de 0,34 nm. Portanto, enquanto segmentação manual é demorada, o método é suficiente para medir as diferenças de W_p associado a um estado de doença ou intervenção.

Imagem serial dilatações. Para medir a perinexus de forma mais rápida, podem ser reproduzida com resolução espacial adequada, desenvolvemos um programa baseado em dilatações imagem serial para contar os pixels entre duas membranas tracejamento de manualmente, o que podem ser vistos na Figura 1B .

O processo de dilatação serial é ilustrado na Figura 4. Como a imagem binária é dilatada (Figura 4A-4D), que a dilatação é então invertida e adicionada a uma imagem de trabalho - a forma não-binários do contorno original (Figura 4E-4 H). O processo é repetido até que o contorno é inteiramente preenchido (Figura 4-D). Neste ponto, a imagem final de trabalho (Figura 4-H) é uma contagem do número de vezes que um determinado pixel manteve-se un-dilatado. Como tal, os valores perto o contorno das membranas celulares são muito baixos, enquanto os valores no centro são mais altos. Contando o número de dilatações para preencher a área em cada ponto, a distância entre as bordas da membrana pode ser calculada. O próximo desafio é identificar e isolar a linha central de forma a quantificar a largura de perinexal em função da distância entre o GJ, que é feito aplicando primeiro um derivado espacial para a imagem final de trabalho (Figura 2-última imagem e Figura 5 A). Um segundo exemplo de uma perinexus mais irregulares pode ser encontrado no arquivo suplementar S3.

Identificação de linha de centro. O gradiente da imagem trabalho final pode ser quantificado por um derivado espacial, como contagem de dilatação valores de borda a borda alteram de alta para baixa a alta novamente (Figura 5A esquerda para a direita). Considerando apenas a magnitude da derivada espacial (Figura 5B), o contorno e a linha de centro, destacada com setas brancas, são imediatamente identificáveis como áreas de descontinuidade. Nesses locais, a direção do gradiente muda de crescente para decrescente, ou vice-versa. Aplicar um limite (Figura 5C) produz uma imagem binária da linha central e contorno, e subtrair o contorno original produz a linha central isolado (Figura 5-D). Enquanto este método de isolar a linha central é computacionalmente eficiente, o limiar aplicado para a derivada espacial cria lacunas na linha central resultante. Estas lacunas (inserirFigura 5D,) devem ser preenchidas para fornecer uma medição precisa da distância a partir da GJ e para garantir que o perinexus é medido em sua totalidade. Primeiro, a linha central está dilatada para preencher quaisquer lacunas (Figura 5E), seguidas de uma erosão (Figura 5-F) e uma função de "bwmorph" (operação = 'skel', n = inf) para eliminar o máximo de pontos possível, deixando um linha contínua central, aumentando assim a eficiência computacional de um algoritmo de pathfinding subsequentes desenvolvido por Wasit Limprasert e disponível no MATLAB Central⁹. Esta função de dilatação-erosão produz a linha central concluída, que é combinada com a imagem do trabalho final (Figura 5G). No entanto, esta linha central é muitas vezes mais do que um pixel de espesso e, portanto, não é um isolamento preciso da linha de centro.

O algoritmo de pathfinding Wasit Limprasert é usado para determinar a linha de centro de perinexus. O algoritmo de pathfinding é capaz de controlar os valores mais altos - neste caso os valores mais próximos ao centro que permaneceu un-dilatado por mais iterações ao longo da linha central (Figura 5G, inserir). O resultado é um rastreamento automático da linha de centro, conforme mostrado na Figura 6. Ao isolar a linha central, perinexal largura pode ser apresentada como uma função da distância entre a extremidade do GJ, como mostrado na Figura 6B (superior), ou como a largura média de uma região especificada de interesse.

Análise de kernel. É importante notar que imagens digitalizadas são baseadas em matrizes quadradas e miolo de dilatação baseiam-se igualmente a matrizes quadradas. Isto significa que a distância de dilatação, uma diagonal é maior que ortogonais. Portanto, procuramos seguir determinar se o kernel afetou os resultados do algoritmo. A fim de quantificar a variabilidade do kernel específico, foram analisadas cinco formas de kernel diferente: "Plus" (a forma usada nas análises acima), "X", "caixa" e "linha", conforme descrito na Figura 7A. O kernel é aplicado em cada ponto de não-zero de uma imagem binária. A estrela em cada núcleo da Figura 7A representa o centro, onde é um valor de 1 branco e preto é um valor de 0 para o kernel de dilatação.

Influência do cada kernel na medição média_p W de uma única imagem de perinexal aproximadamente horizontal (Figura 7B, top), quantificada por um usuário experiente, determinou-se por rodar a imagem com o comando de "imrotate" do Matlab e computação W_p em passos de 10 °. Os valores de medição de_p W (Figura 7B, inferior) flutuarem com a orientação da imagem de forma senoidal retificada com um Plus em forma do kernel. Os menores valores ocorrem quando um perinexus relativamente reto é orientado verticalmente ou horizontalmente. O X, caixa, nem linha miolo fornecido qualquer vantagem sobre o kernel em forma de adição. Os kernels X e caixa produziram resultados idênticos, mas os valores de significam W_p estavam fora de fase com th_e kernel Plus por 45 °. O kernel de linha não conseguiu dilatar totalmente a imagem em certos ângulos, como pode ser visto pela ausência de dados no rastreamento de verde para imagens giradas a menos de 30 ou mais de 145 °. Assim, o kernel de dilatação ortogonal Plus superestimou a separação de membrana quando dilatar um perinexus com um eixo orientado na diagonal por exemplo a aproximadamente 45 °, e os kernels X e caixa subestimaram significa W_p quando o eixo longitudinal do perinexus foi também a 45°. Com base nesta análise, desenvolvemos um fator de correção aplicado aos valores gerados a partir de dilatação com o kernel em forma de adição. A conta para a superestimação da separação de membrana associada com a orientação da imagem, esse fator de correção, multiplicado pelo valor medido largura dependendo da orientação da imagem (equação 1).

Se θ < 45°
     W_{p corrigido} = cosd(θ) * W_{p medido}
Se θ ≥45 °
     W_{p corrigido} = cosd(θ) * W_{p medido} (equação 1)

Nesta equação, W_p medido é o valor de_p W original gerado pelo algoritmo acima e θ é o ângulo calculado da horizontal, em graus. Θ é calculado tomando-se a tangente inversa da mudança total na direção horizontal, dividida pela mudança total na direção vertical da linha central do perinexal. A correção acima se aproxima o ângulo médio, em relação à horizontal, da perinexus (Figura 8A, esquerda-superior) e resulta em uma medida de como se obtidos de um perinexus horizontal (Figura 8A, esquerda-inferior). A lógica por trás desta equação vem do fato de que o kernel em forma de plus (Figura 7A) é essencialmente dois em forma de linha núcleos dispostos ortogonalmente uns aos outros. Como tal, abaixo de 45° (mais perto de horizontal), as dilatações ocorrem verticalmente e, portanto, multiplicando o cosseno do ângulo dá a medida correta. Por outro lado, para ângulos acima (mais perto de vertical), dilatações de 45° ocorrem na horizontal e o seno é usado para determinar a medida correta. Precisamente a 45 °, o seno e cosseno são iguais. Arquivo suplementar S4 fornece uma representação deste conceito. Observe que essa correção se baseia o ângulo médio e cautela deve ser usada quando analisando formas substancialmente não-linear. Este processo foi repetido em 20 perinexi selecionados aleatoriamente e as medições corrigidas fortemente correlacionaram com medidas obtidas manualmente girando e re-analisando as imagens (Figura 8A, direito). Para confirmar a correção exata para a orientação da imagem, dois conjuntos de bordas fantasmas foram gerados (Figura 8B, à esquerda) e girada 180 °. Com a correção trigonométrica, o algoritmo retornado com precisão o valor correto em cada orientação, independentemente da resolução espacial ou tamanho da imagem (Figura 8B, direita).

Aplicação analítica e reprodutibilidade com orientação correção. Recordando que estudos anteriores usando segmentação manual relatório estatisticamente significante significa diferenças de_p W maiores que ou igual a 3 nm, foi importante para determinar se ao algoritmo poderia ser usado para recapitular as conclusões anteriores usando um conjunto de dados completo. Usando o novo algoritmo, dois observadores - experientes e inexperientes com análise de perinexal (Obs. 1 e 2 de Obs, respectivamente)-analisaram as mesmas imagens de um estudo anterior⁶ , que incluiu 12 pacientes que foram diagnosticados com atrial Fibrilação (AF) antes da coleta de tecido e 29 pacientes que não tinham AF pre-existente (não-AF). O usuário experiente descobriu que o W_p era significativamente maior em pacientes com AF do que sem AF (21.9±2.5 e 18.4±2.0 nm, respectivamente, Figura 9A). Esses valores com o fator de correção aplicado são similares para aqueles relatados anteriormente (24.4±2.2 nm e 20.7±2.4 nm, respectivamente)⁶. Importante, o usuário inexperiente encontrou a mesma diferença significativa (22.1±2.8 nm e 20.1±2.6 nm, respectivamente) entre os Estados de doença com o programa automatizado. Além disso, o desvio-padrão dos valores de_p W não mudou com o fator de correção, indicando que o desvio padrão de 2-3 nm não é um artefato do algoritmo, mas da estrutura em si e o processamento do tecido. Estes resultados demonstram que o método automatizado proposto é capaz de sintetizando os resultados de estudos anteriores.

Importante, a perinexus é uma estrutura definida recentemente e não tem um consenso sobre a gama de valores absolutos da separação de membrana adjacente ao GJ^2,3. Desde que a largura GJ-membrana-para-exterior-membrana externa foi anteriormente estimada em 20 nm¹³, procuramos determinar a eficácia do algoritmo medindo também largura GJ. Ambos os observadores não encontrados nenhuma diferença significativa entre as larguras de junção de gap (GJW) de pacientes com ou sem AF pré-existentes (Figura 9B). Valores GJW absolutos para AF e AF não pacientes eram 20,5 ± 2,5 nm e 20,3 ± 1,9 nm, respectivamente, para o observador experiente e 21,0 nm ± 3,1 e 20,0 ± 2,2 nm para o observador inexperiente, semelhante ao que foi relatado anteriormente.

Para determinar se o algoritmo automatizado necessário menos tempo para analisar os dados de segmentação manual, tanto o usuário experiente e inexperiente gravou o tempo necessários para quantificar um 10-imagem de treinamento conjunto (arquivo suplementar S5). A tabela 1 demonstra que o usuário experiente e inexperiente diminuiu o tempo de análise por 4.7 - e 8.3 vezes respectivamente, usando o algoritmo automatizado em relação a abordagem de segmentação manual, com aproximadamente 43-fold aumento espacial resolução ao longo do perinexus.

Algoritmo de solução de problemas. O erro mais comum quando a execução do algoritmo ocorre quando a linha central do final não termina na borda da imagem. Em tais casos, não bastante pontos foram selecionados do mapa derivado espacial, fazendo com que o programa falhar e produzir uma mensagem de erro avisando o usuário para selecionar uma área maior de colheita ou aumentar o limiar de derivativos espacial. Desenho de uma caixa de colheita a maior irá melhorar a confiabilidade do programa em alguns casos, como as alterações espaciais derivadas drasticamente perto das bordas da figura, que pode interromper os pathfinding ou borda algoritmos de detecção.

Também é possível para o algoritmo de pathfinding a falhar identificar correctamente a linha central, mesmo que a linha central atinge a borda da imagem, particularmente se o limite de gradiente é muito baixo(Figura 2). Se o limite de gradiente é definido muito alto, haverá mais pontos desnecessários incorporados o algoritmo de pathfinding (Figura 2B), diminuindo a eficiência computacional. Se o usuário é capaz de determinar um limite adequado, a matriz de imagem "GMag" (Figura 2C), que é gerado pelo programa e pode ser encontrado na área de trabalho, pode ajudar o usuário determinar o limiar. Encontrar pontos ao longo da linha central e definir o limite ligeiramente acima de seu valor de índice para garantir que estes pontos são selecionados. No exemplo dado, um limite adequado seria superior a ~5.1 (Figura 2C, inserir).

O ponto de partida também pode falhar ao atingir o início da perinexus (Figura 2D). Nesse caso, execute novamente o programa e definir o valor do Manual Start para 1. Depois que a linha central tem sido isolada, o usuário seleciona um ponto fora o perinexus e o ponto da linha central mais próximo do pixel selecionado (Figura 2,E, Praça vermelha) será definido como o ponto de partida. O resultado é a completa linha central (Figura 2-F).

Figura 1 : Imagens de temperatura com processos de quantificação. O processo de segmentação manual (A) requer que o usuário executar 12 medições intermembranar individuais enquanto Estimando a linha de centro. O processo automático (B) requer um traço manual, contínuo do contorno do perinexus. O ponto vermelho em cada imagem representa o final do GJ-usuário identificado e o início da perinexus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 2 : Solução de linha de centro. Dois modos principais de falha para a identificação da linha central e suas soluções: cada imagem é rotulada com o nome de matriz em Matlab. Se o limite de gradiente é muito baixa (A, o limite de 0,2), o algoritmo de linha central pode falhar. Configurando o limite muito alto (B, limite 70) pode reduzir a eficiência computacional do algoritmo de pathfinding. Um limite de gradiente apropriado pode ser determinado da matriz GMag (C, inserir). Se a central não consegue chegar ao fim do começo da perinexus (D), o usuário pode optar por seleccionar manualmente o ponto de partida. Após o "Iniciar aponte" opção é definida como 1 na abertura GUI, o usuário então seleciona um ponto fora do perinexus de interesse (E). O resultado final deve ser uma linha de centro que retrata com precisão a totalidade da perinexus (F). Todos os rótulos em citações (A-F) correspondem os nomes de variáveis em Matlab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Seleção de Perinexus. A cultura do perinexus, clique e segure para arrastar uma caixa em torno dela (a ferramenta Corte Demarcado estiver selecionada automaticamente), como indicado pela seta azul. Esta caixa pode ser ajustada usando-se os quadrados sobre os lados e cantos para torná-lo maior ou menor. O Arqueiro Verde representa o fim do perinexus, que o usuário deve assegurar que permanece "aberto". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Dilatações imagem serial. O contorno binário é repetidamente dilatado em incrementos de um pixel (A-D) e adicionado à imagem do trabalho (forma não-binários da imagem, E-H) após cada dilatação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: pathfinding e isolamento da linha central. Um derivado espacial é calculado a partir da imagem final de trabalho (A) e a magnitude do que derivado espacial (B) é usada para isolar o contorno e a linha central (setas brancas). Um limite definido pelo usuário identifica o contorno e linha de centro e subtraindo o contorno original produz a linha de centro (D). No entanto, as lacunas aparecem na linha central como resultado o limiar (D - inserir). A fim de produzir uma linha contínua, uma dilatação secundária é realizada na linha central isolado (E), seguido por uma erosão secundária para aumentar a eficiência computacional de um algoritmo de pathfinding subsequentes. Esta imagem erodida (F) é então combinada com a imagem final do trabalho, permitindo a identificação de uma contínua, um pixel-espessura da linha central (G - inserir). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Apresentação de dados final. O programa gera o contorno final em cima da imagem original de temperatura (A). A linha é codificados por cores verde para 0-150 nm, azul para a região definida pelo usuário de interesse e vermelho para a área além de 150 nm. Além disso, o programa gera um gráfico Color-coded da mesma forma que representa W_p em função da distância desde o início da perinexus e para a região de interesse (B), bem como a média de W_p (baixo-relevo no respectivo gráfico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Análise de forma dilatação do kernel. Formas para kernels de dilatação (A): a estrela no meio representa os pixels dilatados. Caixas brancas são pixels afectadas a dilatação, na forma de um plus, X, caixa ou linha. Um perinexus de aproximadamente horizontal (B, top, com uma linha vermelha indicando 0°) foi girado no sentido horário de 0 a 180° em passos de 10° e repetidamente dilatada usando as formas diferentes do kernel (B, inferior). Plus e linha-em forma de sementes produzem resultados semelhantes, embora o kernel linha falha em determinadas orientações, enquanto os núcleos em forma de caixa - e X estão fora de fase em 45 °. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8 : Orientação de correção de imagem. Para correta para a orientação da imagem, o ângulo médio do perinexus é calculado a partir das posições do início - e end - points (A, deixada, início e fim de linha preta). A tangente inversa da mudança na direção y (uma, linha verde, à esquerda) dividida pela mudança em rendimentos a direção x (uma, linha vermelha, à esquerda) o ângulo de correção, θ (, à esquerda, amarela). O objetivo é então, corrigir o valor médio de_p W para dar a distância mínima entre as bordas, como se o perinexus tivesse sido fotografada aproximadamente horizontalmente (abaixo, esquerda). A aplicação do factor de correcção descrita pela equação 1 foi comparada com manualmente cada um dos 15 selecionados aleatoriamente imagens rotativas pelo θ calculado antes da análise. Os valores corrigidos fortemente correlacionaram com os valores da imagem girada (R² = 0.991, A, direita), indicando a equação 1 é um factor de correcção válido para orientação da imagem. Para confirmar que o fator de correção é apropriado, dois fantasmas foram geradas das bordas perfeitamente paralelo com uma distância conhecida entre eles (B, esquerda). Fantasma 1 e 2 de Phantom possuem resoluções espaciais de 2,833 pixels / mm. e 71,6 pixels/pol., respectivamente. Conforme mostrado pelos diamantes azuis e quadrados vermelhos em B, bem, o algoritmo com precisão calcula suas larguras em 180 graus de rotação de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9 : Reprodutibilidade algoritmo. Usando o processo automático com correção de orientação da imagem, o observador experiente e inexperiente encontrado diferenças significativas entre AF e AF não grupos (A), consistentes com um estudo anterior, detectando uma diferença mínima de 2,6 nm. Além disso, nenhum observador encontrou uma diferença significativa em GJW (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Manual	Automático
Tempo - Obs 1 (s)	205±11	44±14
Tempo - Obs 2 (s)	248±18	30±5
Resolução espacial (medições/nm)	0.08	3.45

Tabela 1: comparação de processos manuais e automáticos. Ambos os observadores necessário menos tempo por imagem para traçar o contorno do que to executar o processo de segmentação manual para um conjunto de treinamento 10-imagem. Além disso, o processo automático tem uma maior frequência de amostragem, gravação 3,45 medições por nm, em comparação com uma média de 1 medida cada 12.5 nm para o processo manual. As imagens de treinamento conjunto encontram-se em suplementar arquivo S5, juntamente com contornos e medições como realizado por um usuário experiente.

Discussion

O algoritmo usa dilatações imagem serial para contar o número de pixels entre duas arestas opostas de 2D em uma imagem binária, que neste caso é a separação de membrana inter do perinexus^2,3,14. Um derivado espacial e um algoritmo de pathfinding são usados para isolar a linha central, seguida por uma sequência de dilatação e erosão secundária para preencher as lacunas na linha central, semelhante ao que foi feito antes de¹⁵. A linha central é então combinada com a imagem de dilatação-contagem final para representar a largura de perinexal em função da distância do início da separação de borda, neste caso, o fim do GJ e o início do perinexus¹⁶.

Quatro parâmetros primários são definidos pelo usuário em uma GUI no início do programa:

1. Limite de gradiente
2. Escala
3. Região de intervalo de interesse
4. Iniciar o método de seleção de ponto (manual ou automático)

O mecanismo mais comum de falha para o algoritmo é o fracasso da linha de centro para alcançar a borda da imagem, que é como o ponto de extremidade é determinado para o algoritmo de pathfinding. Para corrigir um problema, o usuário pode aumentar o limiar de gradiente descrito na etapa 3.3.1, que fará com que o programa selecionar mais pontos fora a imagem espacial de derivativos, que irá aumentar o tempo de computação necessário pelo algoritmo de pathfinding. Portanto, este algoritmo requer um compromisso entre a integridade de velocidade e a linha central de computação. É importante observar que enquanto todos os pontos da linha de centro são identificados a partir da derivada espacial, juntamente com um ponto de partida adequado, o limiar de derivativos espacial não terá efeito sobre a medição de separação de borda.

Orientação de imagem parece afetar valores de dilatação, porque o kernel dilata em passos de 90 graus, o que podem introduzir um erro se a maioria da região de interesse é em um ângulo de 45° para os eixos de matrizes de dilatação. Consequentemente, a contagem de dilatação não pode ser sempre uma representação exata do espaço entre as bordas. Essa limitação tem sido abordada por um fator de correção trigonométrica, mas potencialmente poderia ser ignorada, se todas as imagens em um dataset são alinhadas na mesma orientação. Além disso, o cuidado deve ser usado na interpretação de resultados, como é possível que os planos de corte não são perfeitamente perpendiculares às duas membranas. Figura 9B, usamos GJW para sugerem que nossas imagens perinexus no plano. Ainda assim, é imperativo que os tamanhos de amostra ser suficientemente grande para conta para qualquer corte variações entre imagens. Além disso, nossas medições de largura de perinexal não devem ser interpretadas para refletir na vivo espaços, mas esta abordagem é usado para medir diferenças de largura de perinexal em relação a algum estado de intervenção ou doença.

O algoritmo atual também exige um contorno manualmente tracejamento das bordas como uma entrada. É importante notar que enquanto a escala é definida corretamente, resolução espacial não tem efeito sobre as medições do algoritmo, como demonstram as diferentes resoluções de imagens na Figura 6 e uma imagem de baixa resolução adicional em suplementar arquivo S6. O próximo passo para melhorar o algoritmo está removendo a intervenção humana de geração de contorno juntamente com uma ferramenta que pode selecionar a área de interesse. Estas características provavelmente iria melhorar a precisão da medição e reduzir o viés de usuário.

Este algoritmo computacionalmente eficiente fornece um método mais rápido, que requer aproximadamente um quinto as horas de trabalho, de quantificar o perinexus sem pena detectável de reprodutibilidade quando comparado com o processo de segmentação manual. Além disso, o processo de segmentação manual utiliza uma medição cada 15 nanômetros para quantificar a largura de perinexal, que pode levar a sob amostragem como a separação de membrana da perinexus pode mudar substancialmente dentro do intervalo 15 nm. Em contraste, o programa automatizado tem uma igual da modalidade de imagem, neste caso 2,9 pixels por nanômetros, o comprimento do perinexus, portanto, entregando uma média mais finamente resolvida de perinexal largura de resolução espacial.

Enquanto as aplicações no campo da biologia estrutural cardíaca são promissores e excitante, usos deste algoritmo não se limitam às imagens TEM. Qualquer campo que exijam uma medição precisa, de alta resolução de duas bordas 2D quase paralelas pode usar desse algoritmo. O algoritmo pode ser usado para rastrear qualquer coisa a partir de padrões de erosão e inundação de margem de imagens de satélite para desenvolvimento vascular com microscopia brightfield ou fluorescente. Uma das mais promissoras aplicações potenciais é no campo da Cardiologia e medir a fração de ejeção ventricular (EF) com ecocardiografia cardíaca point-of-care. Atualmente, a norma técnica é o método de biplano de discos¹⁷, embora um algoritmo mais recente, AutoEF, atualmente é o método de vanguarda EF-quantificando^18,19. Para método de biplano de discos, a câmara em questão é traçada manualmente e quantificados usando o método de um modificado de Simpson, pelo qual volume global é automaticamente calculado pelo somatório de discos empilhados de elípticos. A principal limitação deste método é que ele pode retornar apenas a área transversal total da câmara desejada, com nenhuma resolução para identificar regiões específicas de interesse e também exige especialização e substancial entrada humana. O método mais recente, AutoEF, identifica e descreve a borda do ventrículo usando um algoritmo de salpicar 2D e depois calcula a área de seção transversal ventricular. Neste processo, enquanto precisos e eficientes para medir a área bruta ventricular, também tem uma semelhante limitação inerente de apenas medir a área de seção transversal total. Este inconveniente principal limita as capacidades de diagnóstico e tratamento clínicos. Em contraste, o algoritmo apresentado neste manuscrito pode identificar uma linha média e tem uma resolução igual à resolução da modalidade de imagem para identificar regiões específicas de interesse. Isto é importante porque scanners de ultra-som com resolução espacial de micrômetro são comercialmente disponíveis^20,21, implicando que este algoritmo poderia detectar anormalidades de movimento de parede localizada na resolução de micrômetros em vez de centímetros. Enquanto este aplicativo precisa ser validado experimentalmente, é uma das aplicações mais imediatamente promissoras deste algoritmo. Na verdade, ele poderia facilmente ser combinado com o salpico recursos de AutoEF de controle ou os traços manuais utilizaram em planimetria manual para fornecer informações de alta resolução em paralelo com dados EF convencionais.

Tão versátil e aplicável, como é o algoritmo atual, ele foi desenvolvido para imagens 2D. No entanto, como tecnologias de imagem continuam a melhorar, há uma crescente demanda por tecnologias de quantificação de D 3 e 4. Portanto, a próxima iteração do algoritmo é adaptar-se a mesma abordagem, dilatando serialmente uma imagem binária, para um objeto 3-dimensional, onde automaticamente definir uma linha de centro é atualmente além das capacidades dos programas de imagem atuais. Tal algoritmo teria aplicações largas tanto clinicamente e experimentalmente no campo cardíaco sozinho, incluindo 3D ecocardiogramas cardíaca^22,23, microscopia de elétron 3D^{24,25, 26}e 3D ressonância magnética de^28,de^27,29.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monitor Touchscreen	Dell	S2240T	Precisa de caneta de ponta macia
Desktop	Dell	Precision T1650	8GB RAM
Sistema operacional	Microsoft	Windows 7 Enterprise	SO de 64 bits
Plataforma do programa	Mathworks	Matlab R2015b	O programa pode ser incompatível com versões mais recentes/antigas do Matlab