Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Summary

Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.

Abstract

Microscopia de fluorescência é uma poderosa ferramenta para detectar moléculas biológicas em situ e monitorar suas dinâmicas e interações em tempo real. Além de microscopia convencional epi-fluorescência, várias técnicas de imagem foram desenvolvidas para alcançar objetivos específicos experimentais. Algumas das técnicas amplamente utilizadas incluem único-molécula fluorescência ressonância transferência de energia (smFRET), que pode relatar mudanças conformacionais e interações moleculares com resolução de angstrom e único-molécula detecção-baseado Super resolução (SR) de imagem, que pode aumentar a resolução espacial de aproximadamente dez a vinte vezes em comparação com microscopia difração limitada. Aqui nós apresentamos um sistema integrado de cliente-projetada, que mescla vários métodos de imagem em um microscópio, incluindo imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado SR imagem e deteção do único-molécula multi cor, incluindo smFRET de imagem. Diferentes métodos de imagem podem ser conseguidos facilmente e reproducibly elementos ópticos de comutação. Esta montagem é fácil adotar por qualquer laboratório de pesquisa em ciências biológicas com uma necessidade de rotina e diversos experimentos de imagem a um custo reduzido e espaço relativo para construir microscópios separados para fins individuais.

Introduction

Microscópios de fluorescência são ferramentas importantes para a pesquisa moderna ciência biológica e imagem fluorescente é realizada rotineiramente em muitos laboratórios de biologia. Marcando biomoléculas de interesse com fluorophores, podemos diretamente visualizá-las sob o microscópio e gravar as alterações dependentes de tempo na localização, conformação, interação e conjunto de estado em vivo ou em vitro. Microscópios de fluorescência convencional tem uma resolução espacial de difração limitada, que é ~ 200-300 nm no sentido lateral e ~ 500-700 nm no sentido axial^1,2e são, portanto, lim....

Protocol

1. montagem e Design de microscópio

1. Caminho de excitação
   Nota: O caminho da excitação inclui lasers, componentes de interferência diferencial (DIC) de contraste, o corpo do microscópio e seu braço de iluminação.
   1. Prepare uma mesa óptica isolada de vibração. Por exemplo, uma tabela de amortecimento estrutural de 48 x 96 x 12 ' dá espaço suficiente para todos os componentes.
      Nota: Construa o set-up em uma sala com controle de temperatura (por exemplo, 21,4 ± 0,55 ° C). Estabilidade de temperatura é fundamental para manter o alinhamento óptico.
   2. Instalar um corpo de microscópio equipado com um braço de iluminaçã....

Results

Este microscópio permite flexível e reprodutível de alternar entre diferentes métodos de imagem. Aqui nós mostramos imagens de amostra coletadas com cada módulo de imagem.

A Figura 5 demonstra o PSF da molécula piscando-na durante a aquisição do SR. Milhares de tais imagens são reconstruídos para gerar a imagem final do SR (Figura 5E). Figura 5E

Discussion

Este sistema de microscópio híbrido elimina a necessidade de adquirir vários microscópios. O custo total para todas as partes, incluindo a mesa óptica, trabalho de instalação de mesa, software e estação de trabalho, é de cerca de US $230.000. Peças usinadas personalizado, incluindo o mag lente e lente 3D, custam cerca de US $700 (o custo varia de acordo com as cargas reais nos diferentes institutos). Típico comercialmente disponíveis sistemas integrados para microscopia de SR de detecção-baseado de único-molécula custou .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suporte para microscópio Nikon Ti-E	Lente objetiva Nikon	Ti-E
	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Software de imagem microscopia	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC inclui o módulo "JOBS", o módulo de aquisição programada sendo usado para imagens SR.
O braço de iluminação	Nikon	Ti-TIRF-EM Unidade de Iluminador Motorizado M	Este braço tem um slot para uma lente de ampliação
Bloco de análise	Nikon	Ti-A	Isso é instalado na torre do filtro.
Sistema de correção de desvio Z	Nikon	PFS	Este sistema é composto pelo motor de passo no revólver objetivo, LED IR e um detector.
Tampo de mesa óptico	TMC	783-655-02R
Bases de mesa óptica	TMC	14-426-35
647 nm laser	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Diodo laser modulado 647nm 120mW incl. cabeça de laser, caixa de controle CDRH, cabo USB e PSU (fonte de alimentação)
Laser de 561 nm	1280721 coerente		OBIS 561nm LS 150mW Sistema de laser
488 nm	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Diodo Laser Modulado 488nm 60mW incl. cabeça de laser, caixa de controle CDRH, cabo USB e PSU (Unidade de Fonte de Alimentação)
Cristalizador	de laser de 405 nm	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular, M2 < 1.3, de baixo nível de ruído, CW, TTL até 20MHz. 2 conectores de BNC para TTL & Ajuste analógico
Dissipador de calor	Cobolt	11658 (HS-03)	Duas unidades, Dissipador de calor sem ventilador HS-03, Dissipador de calor para lasers de 647 nm e 488 nm
Dissipador de calor	Coerente	1193289	Obis com ventilador, 165 x 50 x 50 mm para o laser de 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Duas unidades, cabo de comunicação para lasers de 647 nm e 488 nm
alumínio para ajuste de altura	McMaster-Carr	9146T35	Multipurpose 6061 Alumínio, Barra Retangular, 4MM X 40MM, 1' Longo para elevação de 561 nm laser
alumínio para ajuste de altura	McMaster-Carr	8975K248	Multipurpose 6061 Alumínio, 1-1/4" Espessura X 3" Largura X 1' Comprimento para elevação Cabo BNC laser 405 nm
	L-com	CC58C-6	RG58C Cabo Coaxial, BNC Macho / Macho, 6.0 ft
Adaptador BNC	L-com	BA1087	Adaptador Coaxial, Anteparo BNC,
Adaptador SMA para BNC Aterrado	HOD	SMA-870	Os lasers Cobolt MLD têm interface SMA, portanto, este adaptador é usado para conexão BNC.
Adaptador SMB para BNC	Fairview Microwave	FMC1638316-12	SMB Plug para BNC Cabo de Anteparo Fêmea RG316 Coaxial em 12 Polegadas para lasers Obis Coerentes
Placa de Aquisição	Dados National Instruments	PCI-6723	13-Bit, 32 Canais, 800 kS/s Dispositivo de Saída Analógica para controle de lasers, LED DIC, e etc
Controlador de Roda de Filtro de Barreira	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Trocador
de Filtro ÓpticoDivisor de Emissão	Cairn	OptoSplit III
Divisor de feixe dicróico	Chroma	T640LPXR-UF2	Divisor de feixe dicróico que separa a emissão vermelha da emissão verde no OptoSplit III
Divisor de feixe dicróico	Chroma	T565LPXR-UF2	Divisor de feixe dicróico que separa a emissão verde e vermelha da emissão azul no OptoSplit III
Filtro de emissão	Chroma	ET700/75M	Duas unidades, Filtro de emissão para emissão vermelha (como Alexa Fluor 647) em OptoSplit III, bem como na roda de filtro de barreira
Filtro de emissão Chroma		ET595/50M	Duas unidades, Filtro de emissão para emissão amarela/verde (como Cy3B) em OptoSplit III, bem como na roda de filtro de barreira
Filtro de emissão Chroma		ET525/50M	Duas unidades, Filtro de emissão para emissão azul (como Alexa Fluor 488/GFP) em OptoSplit III, bem como na roda de filtro de barreira
Filtro de emissão	Semrock	FF02-447/60-25	Filtro de emissão para emissão violeta (como DAPI/Alexa Fluor 405), instalado na roda de filtro de barreira
Dichroic beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Divisor de feixe dicróico multibanda para excitações a laser de 647, 561, 488 e 405 nm dentro do corpo do microscópio
Conjunto de filtros DAPI	Chroma	49000	instalado no corpo do microscópio Cubo
filtro a laser/TIRF da Nikon	Chroma	91032
Filtro passa-longo 590	Chroma	T590LPXR-UF1	para combinar laser de 647 nm e laser de 561 nm
Filtro passa-longo 525	Chroma	T525LPXR-UF1	para combinar lasers já combinados de 647 nm e 561 nm com laser de 488 nm
Filtro passa-longo 470	Chroma	T470LPXR-UF1	para combinar lasers já combinados de 647 nm, 561 nm e 488 nm com laser de 405 nm
Filtro de limpeza a laser (647)	Chroma	zet640/20x	para limpar outros comprimentos de onda do laser de 647 nm
Filtro de limpeza a laser (488)	Semrock	LL01-488-25	para limpar outros comprimentos de onda da fonte luminosa do diodo emissor de luz do laser de 488 nanômetro
	Excelitas	X-Cite120LED	usado somente para a imagem latente de DAPI
Montagem do espelho	Newport	SU100-F3K
Postes óticos	Newport	PS-2
Medidor de potência	Newport	PMKIT	para medir a potência do laser
Montagem do combinador de feixe dicróico	Edmund Optics	58-872	C-Mount Kinematic Mount, para segurar combinadores de feixe dicróicos no conjunto de excitação do laser
Anel de retenção	Thorlabs	CMRR	usado para montagens de combinadores de feixe dicróicos
Placa adaptadora de fibra	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Placa adaptadora de fibra com montagem translacional externa do eixo Z SM1 (1.035"-40)
	de Translação do Eixo Z	Thorlabs	SM1Z
Lente Doublet Acromática	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø 5 mm, Gibões Acromáticos Montados, Revestidos AR: 400 - 700 nm
Placa de Gaiola	Thorlabs	CP1TM09	Placa de Gaiola de 30 mm com Roscas Internas M9 x 0.5, Haste de Montagem de Gaiola de Torneira 8-32
	Haste de Montagem de Gaiola Thorlabs	ER4	, 4" de Comprimento, Ø
	Thorlabs	CP02B	Suporte de Montagem de Gaiola de 30 mm
Fibra óptica monomodo Cabo de	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	, PM, FC/PC para FC/APC, 405 nm, Panda, fibra
óptica multimodo	Thorlabs	M42L01	Ø 50 µ m, 0.22 NA, cabo de remendo de fibra FC/PC-FC/PC
, lente acromática de 1 m (lente magnética)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø Gibão Acromático de 1/2", ARC: 400-700 nm, uma lente côncava na "lente magnética"
Lente Dupla Acromática (lente magnética)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø Gibão Acromático de 1/2", ARC: 400-700 nm, uma lente convexa na "lente magnética"
Anel de retenção	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Anel de retenção de plástico para Ø Tubos e suportes de lente de 1/2", para "lente magnética"
Parafuso com ponta de nylon	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Parafuso de fixação com ponta de nylon, 6 mm de comprimento, para segurar "lente 3D"
Lente 3D	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, lente cilíndrica retangular
Câmera EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
100 nm contas multicanal	Thermo	T7279, TetraSpeck microesferas
corante vermelho	Thermo	Alexa Fluor 647
corante verde-amarelo	GE Healthcare	Cy3
corante verde	GE Healthcare	Cy3B
corante azul	Thermo	Alexa Fluor 488