Artigo de método

Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

DOI:

10.3791/58339

⸱

22 de outubro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Neste artigo

Resumo

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É descrito um método baseado em imagens que pode ser usado para identificar a fase S e analisar a dinâmica do ciclo celular no germline hermafrodita de c. elegans , usando a timidina EdU analógico. Este método não requer nenhum transgenes e é compatível com coloração imunofluorescente.

Resumo

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Análise de ciclo celular em eucariotos frequentemente utiliza a morfologia do cromossomo, expressão e/ou localização de produtos de genes necessários para várias fases do ciclo celular, ou a incorporação de análogos de nucleosídeos. Durante a fase S, polimerases de DNA incorporam os análogos da timidina como EdU ou BrdU no DNA cromossômico, marcando as células para análise. Para c. elegans, o nucleosídeo EdU analógico é alimentado para os vermes durante a cultura regular e é compatível com as técnicas de imunofluorescência. O germline de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose porque é transparente, geneticamente facile e prófase meiótica e diferenciação celular/gametogênese ocorrem em um forma de montagem, como linear. Estas características fazem EdU, uma ótima ferramenta para estudar aspectos dinâmicos de células mitotically ciclismo e desenvolvimento da linha germinal. Este protocolo descreve como com êxito preparar EdU bactérias, alimentá-los para o selvagem-tipo c. elegans hermafroditas, dissecar a gônada hermafrodita, mancha para incorporação de EdU no DNA, mancha com anticorpos para detectar vários ciclo celular e marcadores do desenvolvimento, a gônada de imagem e analisar os resultados. O protocolo descreve as variações no método e análise para a medição de fase S índice M-fase índice, G2 duração, duração do ciclo celular, taxa de entrada meiótica e taxa de progressão da prófase meiótica. Esse método pode ser adaptado para estudar o ciclo celular ou história de celular em outros tecidos, estágios, origens genéticas e condições fisiológicas.

Introdução

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No desenvolvimento do animal, centenas, milhares, milhões, bilhões ou mesmo trilhões de divisões celulares são necessários para formar o organismo adulto. O ciclo celular, o conjunto de eventos celulares compostas de G1 (gap), S (síntese), G2 (gap), e M (mitose) definir a série de eventos que são executados a cada divisão celular. O ciclo celular é dinâmico e melhor apreciada em tempo real, que pode ser tecnicamente difícil. As técnicas apresentadas neste protocolo permitem que se faça as medições das fases e o ciclo celular de imagens fixas.

Rotulagem com análogos de nucleosídeos como 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) ou 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) é o padrão-ouro para identificar a fase S nos estudos de dinâmica do ciclo celular no adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline hermafrodita1,2,3,4,5. EdU e BrdU tanto podem ser usado em quase qualquer fundo genético, como eles não dependem de qualquer construção genética. Visualizar BrdU requer tratamento químico áspero para expor o antígeno para o anticorpo anti-BrdU coloração, que muitas vezes é incompatível com a avaliação de outros marcadores celulares visualizados por coloração com anticorpos adicionais de co. Em contrapartida, Visualizar o EdU ocorre pela química clique em condições suaves e, portanto, é compatível com o anticorpo que mancha co6,7.

A especificidade do rótulo é clara, desde que os núcleos só incorporam os análogos (5-ethynyl-2'-desoxiuridina) de timidina DNA durante a fase S. Visualização ocorre no tecido fixo. O rótulo de EdU é invisível por si só até um corante contendo azida sódica ou fluoróforo covalentemente reage com o alkyne em EdU por clique cobre-catalisada química8. EdU rotulagem pode fornecer informação imediata, na qual os núcleos estão em fase S, usando um curto pulso de rotulagem. EdU também pode fornecer informações dinâmicas, usando o pulso-chase ou rotulagem contínua; por exemplo, em um experimento de pulso-perseguição, o rótulo é diluído em cada divisão celular ou propagadas como nondividing de células de progresso através de desenvolvimento.

O germline hermafrodita de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose. O adulto germline é uma linha de montagem polarizada com células-tronco encontradas na extremidade distal, seguida por entrada e progressão através da prófase meiótica, coordenado com as fases da gametogênese mais proximal (Figura 1). Na extremidade proximal, oócitos maduros, são ovularam e fertilizados e começam a embriogênese na útero9,10,11. A região de ~ 20 célula-diâmetro longo perto da célula de ponta distal, que inclui o tronco germline mitotically ciclismo, células progenitoras e meiose células em fase S, mas não as células na prófase meiótica, chama-se o progenitor zona2,4 , 9 , 12. as membranas celulares fornecem separação incompleta entre os núcleos no germline distal, mas células progenitoras zona passam por célula mitótica ciclismo em grande parte independente. A duração do ciclo de celular mitótica mediana do germline progenitoras de zona em jovens adultas hermafroditas é ~6.5 h; Fase G1 é curto ou ausente, e quiescência não é observada1,2,13. Diferenciação de células-tronco do germline ocorre através da modulação essencialmente direta e, portanto, carece de trânsito-amplificando divisões4. Durante a diferenciação na fase de paquíteno, aproximadamente 4 em 5 núcleos não formará oócitos, mas em vez disso, passam por apoptose, atuando como enfermeira células doando seu conteúdo citoplasmático para o desenvolvimento oócito12,14 , 15.

Além de rotulagem células em fase S com análogos de nucleosídeos, pode-se identificar as células em mitose e meiose usando anticorpos. Núcleos em mitose são imunorreativas para antifosfo-histona H3 (Ser10) Anticorpo (chamado pH3)7,16. Núcleos na meiose são imunorreativas para anticorpo antiele-3 (uma proteína de eixo de cromossomas)17. Núcleos na zona de progenitor podem ser identificados pela ausência de HIM-3, a presença de auxílio REC-8,18ou a presença de WAPL-119. WAPL-1 intensidade é maior na gônada somática, alta na zona de progenitor e baixa durante cedo meiótica prophases19. Várias medições de ciclo celular são possíveis, com algumas variações no protocolo: eu) identificar os núcleos na fase S e medir o índice de fase S; II) identificar núcleos em M-fase e medir o índice de M-fase; III) determinar se núcleos em S-fase mitótica ou meiótica; IV) medir a duração do G2; V) medir o duartion das fases G1 + G2 + M; VI) medir a taxa de entrada meiótica; VII) estimativa da taxa de progressão meiótica.

Pode-se fazer várias medições de ciclo celular de apenas alguns tipos de experimentos de laboratório-molhado. O protocolo abaixo descreve uma rotulagem de pulso de 30 min por alimentação c. elegans adultas hermafroditas com EdU rotulado de bactérias e células em fase M co rotulagem pela coloração com o progenitor e anticorpo anti-pH3 células zona por coloração com anticorpos anti-WAPL-1. Somente as alterações na duração do EdU alimentar (etapa 2.5), tipo de anticorpos empregados (etapa 5), e análises (passo 8.3) são necessárias para as medições adicionais.

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Protocolo

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1. preparação de bactérias EdU-etiquetado

  1. Cultivar uma cultura de acionador de partida de MG1693. Escherichia coli MG1693 (Escherichia coli) carrega uma mutação em thyA.
    1. Raia para fora de e. coli MG1693 de um estoque de glicerol congelado em um ágar de caldo (LB) lisogenia 120 mm placa de Petri. Cultura a 37 ° C durante a noite.
    2. Inocular de duas individuais Escherichia coli MG1693 colônias em dois tubos de 4 mL de líquido cultura lb a 37 ° C para ~ 16 h de duplicar.
      Nota: MG1693 cresce bem em LB sem suplementação com timina ou timidina.
  2. Cresce MG1693 de Escherichia coli em media mínimos suplementados com EdU.
    1. Um Erlenmeyer de 500 mL de autoclave.
    2. Use técnica estéril para adicionar 5 mL de glicose de 20%, 50 μL de 10 mg/mL de tiamina, 120 μL do thymidine 5 mM, 100 μL de 1m MgSO4, 200 μL de 10mm EdU, 100 mL de tampão de M9 e 4 mL de cultura recentemente cultivados de MG1693 durante a noite.
      Nota: A concentração final de EdU é 20 μM nesta cultura1,7. Esta concentração leva à prisão de danos e o ciclo celular de DNA se aplicado diretamente às células de mamíferos em cultura20. No entanto, apenas uma fração deste EdU é incorporada na Escherichia coli e, portanto, disponíveis para c. elegans. Há nenhuma evidência de detenção do ciclo celular e nenhuma mudança no tamanho da zona de progenitor ou índice M-fase após o tratamento de EdU de jovens adultos hermafroditas.
    3. Cultura durante a noite, mas não mais de 24 horas a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
  3. Concentre-se EdU-rotulado e. coli e aplicar a pratos de Petri ágar M9.
    1. Pré-fixe uma centrífuga de mesa para 4 ° C.
    2. Use técnica estéril para transferir a cultura para 2 – 4 estéril 50 mL tubos cónicos.
    3. Centrifugar as culturas a 3.000 x g a 4 ° C por 30 min para o EdU-rotulado Escherichia colide Pelotas.
      Nota: Elimine EdU-contendo sobrenadante de acordo com as directrizes locais e institucionais.
    4. Resuspenda as pelotas com 4 mL de fresco M9. Use a ponta da pipeta estéril 1 mL ou uma pipeta sorológica 5ml estéril. Resuspending as pelotas pode demorar vários minutos.
    5. Use a mesma pipeta para aplicar e espalhar ~ 8 gotas de ressuspensão EdU-rotulado Escherichia coli MG1693 para o centro da temperatura 60mm M9 pratos de Petri ágar. Um lote produz ~ 16 pratos.
    6. Permitir que os pratos secar durante várias horas ou durante a noite à temperatura ambiente e, em seguida, cada prato com uma tira de filme do laboratório do selo. Pratos podem ser armazenados a 15 ° C ~ 2 semanas e a 4 ° C ~ 2 meses. Use o mesmo lote de pratos do EdU para cada conjunto de experimentos.

2. alimentação EdU para c. elegans

  1. Sincronize a população por ovo cronometrado hipoclorito alcalino, leigos tratamento seguido de incubação em meio de S com o colesterol, ou escolhendo o estágio apropriado21. Crescem os animais ao estágio desejado (aqui, 24h post-L4) no meio de crescimento de nematódeo semeado com Escherichia coli OP50 a 20 ° C.
    Nota: Prepare 50 – 100 animais por experiência, como alguns não podem dissecar bem, e os outros serão perdidos no processo de lavagem e transferência.
  2. Permitir que os pratos de EdU aquecer a 20 ° C (ou a temperatura necessária para o experimento).
  3. Lave os animais de pratos NGM usando M9 ou tampão fosfato salino (PBS) para um tubo de 1,5 mL. Permitir que os animais a resolver brevemente por gravidade ou um breve spin numa microcentrifuga.
  4. Remover o sobrenadante e lavar os animais 1 – 2 vezes com ~ 1 mL de M9 ou PBS. Remova o sobrenadante.
  5. Use um pipeta Pasteur de vidro para transferir os animais em uma minúscula gota de M9 ou PBS no centro do gramado da EdU. Espere alguns minutos para que o líquido a ser absorvido e, em seguida, incubar a 20 ° C por 30 min (para medição direta da fase S) ou mais (para medir a história da fase S), conforme necessário.
    Nota: Sinal de EdU é detectável em núcleos germline depois de apenas 15 min do EdU alimentação1.
  6. Lave o prato EdU com ~ 2 mL de M9 ou PBS em um vidro dissecando prato os vermes.

3. dissecção e fixação do Germline de c. elegans

Nota: Este protocolo para a dissecação, fixação e coloração de anticorpo do germline de hermafrodita c. elegans é quase idêntico ao publicado por Gervaise e Arur (2016)22, exceto que os tubos de vidro de 1 mL podem ser centrifugados para acelerar lavagem de passos e um vidro chamou-out pipeta Pasteur pode ser usada para remover o líquido de tubos de vidro de 1 mL mais eficazmente.

  1. Lave e dissecar germlines c. elegans .
    1. Permitir que os animais repousar no fundo do prato dissecação, redemoinho para recolher os animais no centro e usar uma pipeta Pasteur longa para remover PBS. Lave 1 – 2 vezes com ~ 2 mL de PBS.
    2. Adicione 2 mL de PBS e 4 μL de 100mm levamisole para imobilizar os animais. Agite o prato novamente para recolher os animais no centro do prato.
      Nota: Imobilização pode demorar entre alguns segundos e a poucos minutos. Imobilização completa não é necessária para dissecação bem sucedida. Algumas pessoas têm sucesso melhor quando dissecando incompleta imobilizada animais.
    3. Dissecar os animais com um par de agulhas 25 5/8" cortando à frente (aproximadamente entre os dois bulbos da faringe) ou a cauda. Tome cuidado para não cortar o laço do germline. Intestino e germline deve "saltar" da cavidade do corpo devido à pressão interna, mas permanecem ligados. Este protocolo é semelhante ao publicado anteriormente Gervaise e Arur (2016)22.
      Nota: Manter o tempo de dissecação para ~ 5 min, certamente não mais que 15 min. tempos mais longos de dissecação podem resultar na perda de sinal de coloração de anticorpo (Sudhir Nayak, comunicação pessoal) e fome em PBS pode afetar a fisiologia dos animais. Aprender a dissecar rapidamente e com precisão pode levar um pouco de prática.
    4. Se necessário, para coletar os animais dissecados no centro do redemoinho e usar uma pipeta Pasteur longa para remover tanto PBS quanto possível.
  2. Corrigir e desidratar tecidos
    1. Adicione 2 mL de 3% paraformaldeído (PFA) em solução de PBS. Cubra o prato frouxamente com filme de laboratório e loja num banco ou numa gaveta por 10 min.
      Nota: Descongelar solução PFA em um 37 ° C água de banho e depois arrefecer à temperatura antes da germlines de dissecação.
      Atenção: A solução PFA é moderadamente tóxica e um provável carcinogênico e teratógeno. Emissores de soluções paraformaldeído de vapores são inflamáveis. Use luvas de nitrilo. Dilua o PFA de 16% para 3% em uma coifa de química. Quando se trabalha fora da coifa, manter todos os recipientes cobertos.
    2. Transferi as gônadas cuidadosamente para um tubo de centrífuga de vidro limpo 5 mL.
    3. ~ 3 ml de PBSTw (PBS com 0.1% Tween-20) para o prato que continha as gônadas para ajudar a recuperar o restante das gónadas e diluir a solução PFA.
    4. Spin-down em uma centrífuga clínica a 870 x g ~ 1 min.. Younger ou animais menores exigem tempos de rotação mais do que animais mais velhos ou maiores.
    5. Utilizando uma pipeta de vidro longo, transfira o sobrenadante para copo de material indesejado para eventual descarte em garrafa de material indesejada no bairro química.
    6. Adicionar 2 mL de metanol de primeira qualidade, pre-refrigerado a-20 ° C. Cobrir o tubo de centrifugação firmemente com filme de laboratório.
      Nota: O uso de metanol frescos de alta qualidade "gold label" é essencial para morfologia adequada com determinados anticorpos.
      Atenção: O metanol é um líquido altamente inflamável e vapor, que é tóxico se ingerido, inalado ou permissão para entrar em contato com a pele. Use luvas e equipamento de protecção adequado. Use um freezer adequado para pequenos volumes de materiais inflamáveis.
    7. Guarde no congelador-20 ° C por 1 h, mesmo durante a noite ou até vários meses.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Re-hidratar Germlines

  1. Encha o tubo de centrifugação de vidro topo com PBSTw para diluir o metanol e Re-hidratar as gônadas. Spin para baixo em uma clínica centrifugar 870 x g por ~ 1 min.
  2. Usando um copo longo pipeta Pasteur, transfira o sobrenadante para copo de material indesejado para eventual descarte em garrafa de material indesejada no bairro química.
  3. Lave as gônadas 3 vezes usando ~ 5 mL de PBSTw, girando para baixo em uma clínica centrifugar 870 x g por ~ 1 min cada tempo. Remova o sobrenadante.
  4. Lave um tubo de vidro de borosilicato de pequena 1 mL e um copo longo pipeta Pasteur com PBSTw.
  5. Adicionar ~ 700 μL de PBSTw e usar o vidro longo pipeta Pasteur para transferir as gônadas para o pequeno tubo. Use algumas gotas adicionais de PBSTw para garantir que todas as gônadas são transferidas.
  6. Spin para baixo em uma centrífuga clínica a 870 x g ~ 1 min. usando um copo longo elaborada pipeta Pasteur, remover tanto líquido quanto possível, sem perturbar as gônadas. Embora não mais de 50 μL.
    Nota: Se de anticorpos não é necessário, vá para a etapa 6.

5. detectar antígenos com anticorpos

  1. Dilua os anticorpos no soro de 30% em PBS. No presente exemplo, anticorpo anti-WAPL-1 é 1:2,000 diluído e anticorpo anti-pH3 é diluído 1: 500. Centrifugue o soro fresco descongelado por 10 min em uma microcentrífuga a 20.000 x g a 4 ° C para remover as partículas. Use o sobrenadante, que pode ser armazenado a 4 ° C por vários dias. Use o soro apropriado para coincidir com o organismo hospedeiro de anticorpos secundários (soro de cabra é usado aqui). Uma etapa de bloqueio opcional pode ser adicionada antes da adição de anticorpos primários.
  2. Aplica 100 μL do anticorpo primário diluído a cada tubo de vidro pequeno. Incube a temperatura ambiente durante 4 h.
    Nota: Tempos de incubação variam pelo anticorpo. Para alguns anticorpos, 2 h à temperatura ambiente é suficiente. Incubação do mais longa (ex., durante a noite) são possíveis, mas pode aumentar o fundo.
  3. Encha os tubos para top com PBSTw e spin para baixo em uma centrífuga clínica a 870 x g por ~ 1 min.
  4. Lave as gônadas 3 vezes usando ~ 1 mL de PBSTw. Incubar por ~ 5 min por lavagem para permitir que o anticorpo primário excesso de lavagem se espalham. Usando um chamou-out longa pipeta Pasteur de vidro, remover tanto líquido quanto possível, sem perturbar as gônadas. Embora não mais de 50 μL.
  5. Dilua os anticorpos secundários em 30% de soro de cabra em PBS. No presente exemplo, cabra-anticoelho-594 e cabra-antirato-647 são cada diluídos a 1: 400.
    Nota: Selecione anticorpos secundários cuidadosamente para certificar-se de corantes são distintos da tintura no kit de EdU. No presente exemplo, o EdU kit continha um corante de excitação 488 nm.
  6. Aplica 100 μL do anticorpo secundário diluído para cada tubo de vidro pequeno. Incube no escuro à temperatura de 2 h.
    Nota: Tempos de incubação variam pelo anticorpo. Para alguns anticorpos secundários, 1h à temperatura ambiente é suficiente. Incubação do mais longa (ex., durante a noite) são possíveis, mas pode aumentar o fundo.
  7. Lave as gônadas 3 vezes usando ~ 1 mL de PBSTw. Incubar por ~ 5 min por lavagem para permitir que o anticorpo secundário excesso de lavagem se espalham. Usando um chamou-out longa pipeta Pasteur de vidro, remover tanto líquido quanto possível, sem perturbar as gônadas. Embora não mais de 50 μL.
    Nota: Gônadas podem ser armazenadas em 100 µ l de PBS após esta etapa, se necessário, embora isto pode reduzir o sinal. Remova o PBS antes de prosseguir.

6. realizar a reação de EdU clique para detectar EdU

Nota: Executar o EdU clique reação antes o anticorpo que mancha passos (executar a etapa 6 antes do passo 5) é possível, dependendo os anticorpos utilizados7. No entanto, os reagentes de clique podem interferir com determinados antígenos (EG., REC-8 anticorpo é sensível à fixação e permeabilização). A ordem aqui apresentada resulta brilhante anticorpo que mancha com o REC-8, WAPL-1, 3-HIM, pH3, bandeira e CYE-1 anticorpos utilizados, entre outros.

  1. Prepare o clique EdU cocktail8 fresco, adicionando o seguinte para um tubo limpo 1,5 mL. A ordem das adições é importante. Proteger da luz e manter todos os reagentes no gelo. Esta receita rende o suficiente para uma amostra (100 μL); multiplica a receita conforme necessário.
    1. Adicione 2 mL de água ultrapura para o buffer de aditivo. Isso faz com que 10 x aditivo de reserva, que deve ser diluído a 1 x imediatamente antes da utilização.
    2. Adicione 8,5 μL de tampão de x 10 para 76.5 μL de água ultrapura. Misture bem.
    3. Adicione 4 μL de 100mm CuSO4 (pode ser rotulada como componente E). Misture bem.
    4. Adicione 0,25 μL da tintura 488 nm azida. Devem ser descongelado à temperatura ambiente, como seu solvente, dimetilsulfóxido, é sólido a 4 ° C. Misture bem e proteger da luz.
    5. Mix 9 μL de água ultrapura com 1 μL do buffer aditivo na tampa do tubo. Pipeta de PAC para adicionar ao coquetel restante e misture bem pipetando para cima e para baixo.
  2. Realize a reação de clique de EdU.
    1. Adicione ~ 100 μL de clique EdU cocktail para as gônadas no tubo pequeno. Cubra com filme de laboratório e incube por 30-60 min à temperatura ambiente.
    2. Lave uma vez com 100 μL de tampão de lavagem de reação.
    3. Lave as gônadas 4 vezes usando ~ 1 mL de PBSTw. Incubar por ~ 15 min por lavagem para permitir que excesso EdU cocktails componentes difusa na lavagem. Usando um chamou-out longa pipeta Pasteur de vidro, remover tanto líquido quanto possível, sem perturbar as gônadas. Embora não mais de 50 μL.

7. mancha de DNA e preparar Slides

  1. Adicione 1 gota (~ 25 μL) de meio de montagem antidesgaste com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, usado para visualizar o DNA) para as gônadas. Aguarde alguns minutos para que ele pode resolver e misturar com as gônadas.
    Nota: Alternadamente, numa diluição de 1:1,000 de DAPI (a partir de um estoque de 0,1 mg/mL) em PBS pode ser aplicada por 5 min, seguido por 20 μL de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) em 90% de glicerol, ou meio de outra montagem antidesgaste.
  2. Prepare uma grande almofada de agarose 2,5% em um padrão de vidro de microscópio.
  3. Uso um novo limpo livre de poeira vidro longo pipeta Pasteur para transferir as gônadas para a almofada de agarose. Manter todos os líquidos e gônadas no fundo estreito da pipeta para minimizar a perda das gônadas.
    Nota: Gônadas preso ao tubo de vidro pequeno ou em vidro longo pipeta Pasteur pode ser "resgatada" por lavagem com PBSTw, recolher o líquido em um prato de dissecação e vamos buscar animais individuais para o slide com um cílio.
  4. Usar uma pestana (ou um laço de cabelo fino) colado a um palito de dente para distribuir as gônadas sobre a almofada de agarose e remover as partículas de poeira.
  5. Uma lamela de vidro retangular. Baixa lentamente de um lado para evitar bolhas de ar. Use um lenço para remover a solução em excesso, evitando assim a lamela de mover-se livremente.
    Nota: Escolha as lamelas que correspondem ao microscópio que será usado. #1 e #1.5 lamelas funcionam bem.
  6. Permitir que os slides para se estabelecer e secar ligeiramente durante a noite em temperatura ambiente ou 4 ° C. Isso ajuda a achatar ligeiramente as gônadas. Slides devem ser armazenadas a 4 ° C.
  7. Opcional: Sele as bordas da lâmina com esmalte ou outro aferidor de slide. Selando os cantos primeiro, então os lados, impede que a lamela deslocando.

8. análise e imagem confocal

  1. Imagem a gônada distal com um microscópio fluorescente confocal disco de fiação equipado com uma fonte de luz de alta energia, plano-apocromático objectivos e uma câmera de microscópio de alta eficiência. Capture as imagens com 1 μm ou espaçamento mais apertado entre pilhas de z. Tome nota do tempo de exposição, sensibilidade e poder do laser para todos os canais.
    1. Use o seguinte: 405 nm laser linha excitação com um filtro de emissão 485 nm (W60) para DAPI, 488 nm laser linha excitação com um filtro de emissão 527 nm (W55) para EdU, 561 nm laser linha da excitação com um filtro de emissão nm (W70) 615 para WAPL-1 e um 640 nm laser linha excita ção com um filtro de emissão 705 nm (W90) para pH3.
      Nota: Variará a intensidade do sinal e intensidade de fundo. Da mesma forma, os tempos de exposição necessário variará, possivelmente até 10-fold.
  2. Use o plug-in do contador de célula23 em Fiji24,25 a contagem manualmente cada núcleo. Etiquete cada núcleo individual de acordo com a presença e ausência de pH3, EdU e WAPL-1. Use as classes dos núcleos descritos na tabela 1 e Figura 2, como estas facilitará todos os cálculos descritos abaixo.
    Nota: Experimentalistas hábil podem contar com precisão todos os núcleos em uma imagem 3D sem dupla contagem ou faltando qualquer núcleos. Alternadamente, um pode contar cada núcleo em cada plano z, e o roteiro de marcas-de-células R3 pode ser usado para remover núcleos multiplicar-contados.
  3. Calcule o número de células e frequências compreendidas entre as contagens acima, dependendo do tipo de ciclo celular medida necessária. Os tipos de núcleos são definidos na tabela 1 e Figura 2. Os cálculos estão sumarizados na tabela 2.
    1. (Variação eu) Para identificar os núcleos na fase S, alimente os animais EdU por 30 min. Qualquer núcleos exibindo EdU rótulo são núcleos da fase S. Para calcular, leve os núcleos soma de A e C, veja a tabela 1 e Figura 2.
      Nota: Em um pulso de EdU em adultos hermafroditas selvagem-tipo de 30 min, EdU todos rotulados núcleos são co rotulado com o progenitor de marcadores de zona1.
    2. Para medir a zona do progenitor, mancha com um marcador de zona de progenitor como anticorpo REC-8 ou WAPL-1. A zona de progenitor é definida aqui como todos auxílio REC-8,18 ou núcleos de imunorreativas germline WAPL-1. Para calcular, somar todos os núcleos de imunorreativas WAPL-1 (A + B + C + D, ver tabela 1 e Figura 2).
      Nota: WAPL-1 também rotula o DTC e núcleos de gônada somática que não devem ser contados. Núcleos somáticos são fáceis de identificar por sinal extremamente intenso de WAPL-1, posição ligeiramente fora do germline e uma morfologia de "ovo frito" dos núcleos.
    3. Para medir o índice de fase S, realizar um experimento de EdU de 30 min e co etiqueta com anticorpo REC-8 ou WAPL-1. O índice de fase S é definido como a proporção da zona progenitor que é na fase S. Para calcular, contar todos os núcleos de fase S e depois dividir pelo número total de núcleos de zona do progenitor (A + C / A + B + C + D, ver tabela 1 e Figura 2).
    4. (Variação II) Para identificar os núcleos na fase M, mancha com anticorpo pH3. Qualquer núcleos imunorreativas pH3 são núcleos M-fase. Isso funciona independentemente da duração de alimentar o EdU. Para calcular, levar a soma da e núcleos de B, ver tabela 1 e Figura 2.
      Nota: WAPL-1 também rotula o DTC e núcleos de gônada somática que não devem ser contados. Núcleos somáticos são fáceis de identificar por sinal extremamente intenso de WAPL-1, posição ligeiramente fora do germline e uma morfologia de "ovo frito" dos núcleos.
    5. Para medir o índice de M-fase, co etiqueta com pH3 e REC-8 ou anticorpos WAPL-1. O índice de M-fase é definido como a proporção da zona progenitor que está numa fase de M. Para calcular, contar todos os núcleos de M-fase e depois dividir pelo número total de núcleos de zona do progenitor (A + B / A + B + C + D, ver tabela 1 e Figura 2).
    6. (Variação III) Núcleos em S-fase mitótica e meiótica ambos etiqueta com EdU. Para dizer as duas populações separadas, determine se a fase S foi seguida por mitose ou meiose. Para determinar se os núcleos estão em fase S mitótica ou meiótica, alimentar EdU por 4h e co etiqueta para pH3 (um marcador de M-fase) e HIM-3 (uma proteína de eixo de cromossomas) por anticorpos. Gravar os núcleos que exibem tanto EdU e pH3 (tipo A, ver tabela 1 e Figura 2) como S-fase mitótica enquanto núcleos que exibir EdU e HIM-3 (tipo E, ver tabela 1 e Figura 2) como S-fase meiótica.
    7. (Variação IV) Calcule a duração da fase G2.
      Nota: G2-fase separa fase S M-fase. Embora nenhum marcador tem sido relatada a etiqueta G2 no germline de c. elegans , um pode calcular a duração da fase G2, combinando dados de vários experimentos que rotulam M-fase (na época da dissecação) e S-fase (a partir de vários h antes dissecação). Uma célula que exibe marcadores da fase S e M-fase concluída G2-fase durante o curso do experimento. Uma célula que exibe somente o marcador de M-fase e não o marcador de fase S não estava na fase S durante o experimento.
      1. Para calcular a duração da fase G2, alimente EdU por 2h e co etiqueta com anticorpo pH3. Examine a único núcleos que rotulam com pH3 (esses são em M-fase aquando da dissecação) a presença de EdU (estes eram na fase S durante o rótulo de EdU 2 h antes da dissecação). Calcular a fração de núcleos de M-fase que completou a fase G2 (A / A + B, ver tabela 1 e Figura 2).
      2. Repita esta experiência com um rótulo de EdU de 3h e novamente com um rótulo de EdU 4h (e, opcionalmente, um rótulo de EdU 5h). Traça a porcentagem de pH3 núcleos positivos que são EdU positivo no eixo y e a duração do EdU rótulo no eixo x, como mostrado na Figura 3A.
      3. Calcule a duração mediana do G2-fase conectando os pontos no gráfico e determinar onde a linha cruza a 50%, conforme mostrado na Figura 3A.
      4. Calcule a duração máxima da fase G2 conectando os pontos no gráfico e determinar onde a linha cruza a 99%, conforme mostrado na Figura 3A.
    8. (Variação V) Calcule o duraion do G1 + G2 + M.
      Nota: No germline de c. elegans , fase G1 é extraordinariamente curto. Embora nenhum marcador tem sido relatado para rotular G1 no germline de c. elegans , um pode estimar a duração da soma da fase G1, G2 e M e então comparar este tempo com o tempo de G2-fase descrito acima. A duração máxima do G1 + G2 + M é estimada a partir da percentagem de todos os núcleos de zona de progenitor (WAPL-1 imunorreativas) que permanecem EdU negativo (não sejam submetidos a fase S) depois EdU rotulagem durante várias horas.
      1. Para calcular a duração do G1 + G2 + M, alimente EdU por 2h e co etiqueta com anticorpo REC-8 ou WAPL-1. Determinar a fração da zona progenitor que passou por fase S durante este tempo (A + C / A + B + C + D, ver tabela 1 e Figura 2).
      2. Repita esta experiência com um rótulo de EdU de 3h e novamente com um rótulo de EdU 4h (e, opcionalmente, um rótulo de EdU 5h). Traça a porcentagem de REC-8 ou WAPL-1 núcleos positivos que são EdU positivo no eixo y e a duração do EdU rótulo no eixo x, como mostrado na Figura 3B.
      3. Calcule a duração máxima do G1 + G2 + M conectando os pontos no gráfico e encontrar onde a linha cruza a 99%, conforme mostrado na Figura 3B.
        Nota: É possível realizar os experimentos para determinar a duração do G2 e G1 + G2 + M como um único conjunto de 2, 3, 4 e 5 h EdU experimentos por co etiquetando com anticorpos tanto coelho-anti-WAPL-1 e antirato-pH3.
    9. (Variação de VI) Para identificar os núcleos que replicados na zona de progenitor, mas desde então, entrou meiose, alimente os animais EdU para 10 h e rótulo co com anticorpos REC-8 ou WAPL-1. Qualquer núcleos exibindo EdU rótulo foram na fase S durante esses 10 h. Qualquer núcleos que não exibem coloração auxílio REC-8 ou WAPL-1 foram na meiose. Simplesmente contar os núcleos com EdU rotulagem que não exibem rotulagem com o marcador de zona de progenitor (E, ver tabela 1).
      Nota: Por outro lado, se gônadas estão manchadas para o marcador de prófase meiótica HIM-3 com anticorpos anti-HIM-3, contagem do número de núcleos com EdU rotulagem que são também positivos para HIM-3.
    10. Para calcular a taxa de entrada meiótica, realize o experimento acima com um rótulo de 5 h, 10 h e 15 h de EdU. Plotar o número de núcleos que inseriu meiose no eixo y e a duração do EdU rótulo no eixo x, como mostrado na Figura 3. Em seguida, use uma regressão linear simples para calcular a inclinação (meiose núcleos entrados por h) de y = mx + b.
      Nota: É fundamental usar uma regressão linear para calcular a taxa de entrada meiótica. Seria incorrecto é só dividir o número de núcleos que inseriu a meiose pela duração do rótulo do EdU, porque a intercepção de y não é zero.
    11. (Variação VII) Medir a taxa de progressão meiótica.
      Nota: Desde que EdU covalentemente é incorporado no DNA, ele pode ser usado para controlar uma população de células através da diferenciação. As células que foram submetidos a fase S na zona de progenitor retêm o rótulo de EdU como eles entram em meiose, progresso através de meiose e submeter-se a ovogênese. Um experimento de pulso-chase com EdU pode ser usado para medir a taxa de progressão meiótica.
      1. Bactérias de EdU-etiquetado alimentação aos animais para 4h (o "pulso"). Transferir os animais para sem rótulo OP50 bactérias por 48h (a "perseguição"), em seguida, dissecar e co rotular com um marcador de zona de progenitor como REC-8 ou WAPL-1 (ou um marcador de prófase meiótica como HIM-3), se desejado.
      2. Quando a imagem, procure a posição do núcleo EdU-rotulados mais proximal. A taxa de progressão meiótica é a distância (em diâmetros de célula da extremidade da zona de progenitoras) viajou pelo EdU mais proximal rotulado núcleo durante a perseguição de 48 h.

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Resultados

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Como a síntese de DNA é necessária para incorporar o EdU, pode-se concluir que EdU-rotulado núcleos passou por fase S durante a janela de tempo de criação de etiquetas de EdU. Um pode interpretar os núcleos esse rótulo em uma alimentação de 30 min com EdU rotulado bactérias como núcleos em fase S no momento da dissecação. Núcleos que rotular em uma mais EdU contínua alimentação experimento podem ter rotulado cedo na janela de tempo e desde a fase S esquerdo, ou podem ter identificado na p...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preparação de bactérias EdU-rotulado (etapa 1) é fundamental para este protocolo e o primeiro ponto para solução de problemas. Rótulo de tipo selvagem jovens adultos hermafroditas muito confiável em um EdU-pulso, inventando um controle útil para cada novo lote de bactérias EdU-rotulado de 4h. Além disso, intactas EdU-rotulado de bactérias que entram no intestino (em animais mais velhos ou certos mutantes defeituosos faringe/moedor) irão rotular com química clique e aparecem como partitura oblonga brilhante no intestino. ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos gratos ao centro de estoque de Escherichia coli para MG1693; Wormbase; o centro de genética Caenorhabditis que é financiado pelos institutos de saúde escritório de pesquisa infra-estrutura programas nacionais (P40OD010440) para cepas; Zach Pincus para consultoria estatística; Aiping Feng para reagentes; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner para treinamento, aconselhamento, apoio e discussão útil; e os laboratórios Kornfeld e Schedl para feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 à KK, R01 GM100756 TS] e uma bolsa predoctoral National Science Foundation [DGE-1143954 e DGE-1745038 de ZK]. O National Institutes of Health, nem a National Science Foundation tinha qualquer papel no desenho do estudo, coleção, análise e interpretação dos dados, nem por escrito o manuscrito.

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Materiais

E. coli O metanol de de filme de laboratório de 4 polegadas de largura de 60 mm de diâmetrosorológicasErlenmyerde alumínio305122de vidro Sistema confocal de disco giratório

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411padrão não suplementado
OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de ImagemThermo Fisher ScientificC10337
5-Etinil-2′-desoxiuridinaSigma900584-50MGou use EdU fornecido no kit
GlicoseSigmaD9434-500GD-(+)-Dextrose
Tiamina (Vitamina B1)SigmaT4625-5GGrau Reagente
TimidinaSigmaT1895-1GBioReagente
Sulfato de magnésio heptahidratadoSigmaM1880-1KGMgSO4,
Fosfato de sódio de grau reagente, dibásico, anidroFisherBP332-500GNa2HPO4
Fosfato de potássio, monobásicoSigmaP5379-500GKH2PO4
Cloreto de amônioSigmaA4514-500GNH4Cl, Reagente Plus
Ágar bacteriológicoUS BiológicoC13071058
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigmaC3881-500GCaCl
LB Caldo (Miller)SigmaL3522-1KGusado em 25g / L
LevamisolSigmaL9756-5G0,241g / 10ml
Fosfato tamponado solução salinaCalbiochem Omnipur6506PBS caseiro funciona tão bem
Tween-20SigmaP1379-500ML
16% Paraformaldeído, ampolas de grau EMMicroscopia Eletrônica Ciências1571010ml ampolas
100% metanolThermo Fisher ScientificA454-1LGold-label é crítico para a morfologia adequada com certos anticorpos
Soro de cabraGibco16210-072Lote 1671330
coelho-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002Lote G3048-179A02, usado em 1:2000
clone de camundongo-anti-pH3 3H10Millipore05-806Lote#2680533, usado em 1:500
cabra-anti-coelho conjugado com IgG Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lote 1256147, usado a 1:400
cabra-anti-camundongo IgG-conjugado Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lote 1511347, usado a 1:400
Meio de montagem antifade Vectashield contendo 4',6-Diamidino-2-Fenilindol Dicloridrato (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200o meio de montagem sem DAPI pode ser usado em seu lugar, seguindo um esmalte de incubação DAPI separado
Wet n WildDTC450Bqualquer esmalte transparente deve funcionar
S-mediumváriosver wormbook.org para o
protocolo M9 bufferváriosver wormbook.org para protocolo
M9 ágarváriasmesmas receitas que o buffer M9, mas adicionar 1,7% ágar
Meio de crescimento de nematóidesvários, consulte wormbook.org para o protocolo
de dissecação do vidro do relógioCarolina Biological42300
Parafilm filme de laboratórioPechiney Plastic PackagingPM-996Placas
Petri
Pipetas Pasteur de vidro longo
Tubos de centrífuga de 1mlMidSci Avant2926
Pontas
Pipetas
500 mL Frasco
Folha
25G Agulhas de 5/8"BD PrecisionGlide 
tubo de centrífuga de vidro de 5mlPyrex 
Tubos de vidro borossilicato 1ml
lâminas
nº 1 lamínulas 22 x 40 mmnº 1,5 podem funcionar, também
37 &graus; C Agitador incubadora
Centrífuga de mesa Centrífuga
clínicaIEC428com 6 rotores de caçamba oscilante
Mini Centrífuga
20 ° C incubadora
4 ° C geladeira-20
° Microscópio C freezer
Observer Z1Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 lente objetiva de imersão em óleoZeiss
Ultraview VoxPerkinElmer O sistema confocal de disco giratório da Nikon também funciona muito bem, conforme descrito aqui: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
cresce bem em LB

Referências

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