É descrito um método baseado em imagens que pode ser usado para identificar a fase S e analisar a dinâmica do ciclo celular no germline hermafrodita de c. elegans , usando a timidina EdU analógico. Este método não requer nenhum transgenes e é compatível com coloração imunofluorescente.
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Artigo de método
Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Análise de ciclo celular em eucariotos frequentemente utiliza a morfologia do cromossomo, expressão e/ou localização de produtos de genes necessários para várias fases do ciclo celular, ou a incorporação de análogos de nucleosídeos. Durante a fase S, polimerases de DNA incorporam os análogos da timidina como EdU ou BrdU no DNA cromossômico, marcando as células para análise. Para c. elegans, o nucleosídeo EdU analógico é alimentado para os vermes durante a cultura regular e é compatível com as técnicas de imunofluorescência. O germline de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose porque é transparente, geneticamente facile e prófase meiótica e diferenciação celular/gametogênese ocorrem em um forma de montagem, como linear. Estas características fazem EdU, uma ótima ferramenta para estudar aspectos dinâmicos de células mitotically ciclismo e desenvolvimento da linha germinal. Este protocolo descreve como com êxito preparar EdU bactérias, alimentá-los para o selvagem-tipo c. elegans hermafroditas, dissecar a gônada hermafrodita, mancha para incorporação de EdU no DNA, mancha com anticorpos para detectar vários ciclo celular e marcadores do desenvolvimento, a gônada de imagem e analisar os resultados. O protocolo descreve as variações no método e análise para a medição de fase S índice M-fase índice, G2 duração, duração do ciclo celular, taxa de entrada meiótica e taxa de progressão da prófase meiótica. Esse método pode ser adaptado para estudar o ciclo celular ou história de celular em outros tecidos, estágios, origens genéticas e condições fisiológicas.
Introdução
No desenvolvimento do animal, centenas, milhares, milhões, bilhões ou mesmo trilhões de divisões celulares são necessários para formar o organismo adulto. O ciclo celular, o conjunto de eventos celulares compostas de G1 (gap), S (síntese), G2 (gap), e M (mitose) definir a série de eventos que são executados a cada divisão celular. O ciclo celular é dinâmico e melhor apreciada em tempo real, que pode ser tecnicamente difícil. As técnicas apresentadas neste protocolo permitem que se faça as medições das fases e o ciclo celular de imagens fixas.
Rotulagem com análogos de nucleosídeos como 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) ou 5-bromo-2'-desoxiur....
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Protocolo
1. preparação de bactérias EdU-etiquetado
-
Cultivar uma cultura de acionador de partida de MG1693. Escherichia coli MG1693 (Escherichia coli) carrega uma mutação em thyA.
- Raia para fora de e. coli MG1693 de um estoque de glicerol congelado em um ágar de caldo (LB) lisogenia 120 mm placa de Petri. Cultura a 37 ° C durante a noite.
- Inocular de duas individuais Escherichia coli MG1693 colônias em dois tubos de 4 mL de líquido cultura lb a 37 ° C para ~ 16 h de duplicar.
Nota: MG1693 cresce bem em LB sem suplementação com timina ou timidina.
- Cresce MG1693....
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Resultados
Como a síntese de DNA é necessária para incorporar o EdU, pode-se concluir que EdU-rotulado núcleos passou por fase S durante a janela de tempo de criação de etiquetas de EdU. Um pode interpretar os núcleos esse rótulo em uma alimentação de 30 min com EdU rotulado bactérias como núcleos em fase S no momento da dissecação. Núcleos que rotular em uma mais EdU contínua alimentação experimento podem ter rotulado cedo na janela de tempo e desde a fase S esquerdo, ou podem ter identificado na p.......
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Discussão
Preparação de bactérias EdU-rotulado (etapa 1) é fundamental para este protocolo e o primeiro ponto para solução de problemas. Rótulo de tipo selvagem jovens adultos hermafroditas muito confiável em um EdU-pulso, inventando um controle útil para cada novo lote de bactérias EdU-rotulado de 4h. Além disso, intactas EdU-rotulado de bactérias que entram no intestino (em animais mais velhos ou certos mutantes defeituosos faringe/moedor) irão rotular com química clique e aparecem como partitura oblonga brilhante no intestino. .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Estamos gratos ao centro de estoque de Escherichia coli para MG1693; Wormbase; o centro de genética Caenorhabditis que é financiado pelos institutos de saúde escritório de pesquisa infra-estrutura programas nacionais (P40OD010440) para cepas; Zach Pincus para consultoria estatística; Aiping Feng para reagentes; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner para treinamento, aconselhamento, apoio e discussão útil; e os laboratórios Kornfeld e Schedl para feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 à KK, R01 GM100756 TS] e uma bolsa predoctoral National Science....
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Materiais
E. coli O metanol de de filme de laboratório de 4 polegadas de largura de 60 mm de diâmetrosorológicasErlenmyerde alumínio305122de vidro Sistema confocal de disco giratório
cresce bem em LB
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | padrão não suplementado |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de Imagem | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Etinil-2′-desoxiuridina | Sigma | 900584-50MG | ou use EdU fornecido no kit |
| Glicose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Tiamina (Vitamina B1) | Sigma | T4625-5G | Grau Reagente |
| Timidina | Sigma | T1895-1G | BioReagente |
| Sulfato de magnésio heptahidratado | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, |
| Fosfato de sódio de grau reagente, dibásico, anidro | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Fosfato de potássio, monobásico | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Cloreto de amônio | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagente Plus |
| Ágar bacteriológico | US Biológico | C13071058 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Caldo (Miller) | Sigma | L3522-1KG | usado em 25g / L |
| Levamisol | Sigma | L9756-5G | 0,241g / 10ml |
| Fosfato tamponado solução salina | Calbiochem Omnipur | 6506 | PBS caseiro funciona tão bem |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldeído, ampolas de grau EM | Microscopia Eletrônica Ciências | 15710 | 10ml ampolas |
| 100% metanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label é crítico para a morfologia adequada com certos anticorpos |
| Soro de cabra | Gibco | 16210-072 | Lote 1671330 |
| coelho-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lote G3048-179A02, usado em 1:2000 |
| clone de camundongo-anti-pH3 3H10 | Millipore | 05-806 | Lote#2680533, usado em 1:500 |
| cabra-anti-coelho conjugado com IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lote 1256147, usado a 1:400 |
| cabra-anti-camundongo IgG-conjugado Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lote 1511347, usado a 1:400 |
| Meio de montagem antifade Vectashield contendo 4',6-Diamidino-2-Fenilindol Dicloridrato (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | o meio de montagem sem DAPI pode ser usado em seu lugar, seguindo um esmalte de incubação DAPI separado |
| Wet n Wild | DTC450B | qualquer esmalte transparente deve funcionar | |
| S-medium | vários | ver wormbook.org para o | |
| protocolo M9 buffer | vários | ver wormbook.org para protocolo | |
| M9 ágar | várias | mesmas receitas que o buffer M9, mas adicionar 1,7% ágar | |
| Meio de crescimento de nematóides | vários | , consulte wormbook.org para o protocolo | |
| de dissecação do vidro do relógio | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm filme de laboratório | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Placas |
| Petri | |||
| Pipetas Pasteur de vidro longo | |||
| Tubos de centrífuga de 1ml | MidSci Avant | 2926 | |
| Pontas | |||
| Pipetas | |||
| 500 mL Frasco | |||
| Folha | |||
| 25G Agulhas de 5/8" | BD PrecisionGlide | ||
| tubo de centrífuga de vidro de 5ml | Pyrex | ||
| Tubos de vidro borossilicato 1ml | |||
| lâminas | |||
| nº 1 lamínulas 22 x 40 mm | nº 1,5 podem funcionar, também | ||
| 37 &graus; C Agitador incubadora | |||
| Centrífuga de mesa Centrífuga | |||
| clínica | IEC | 428 | com 6 rotores de caçamba oscilante |
| Mini Centrífuga | |||
| 20 ° C incubadora | |||
| 4 ° C geladeira-20 | |||
| ° Microscópio C freezer | |||
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 lente objetiva de imersão em óleo | Zeiss | ||
| Ultraview Vox | PerkinElmer | O sistema confocal de disco giratório da Nikon também funciona muito bem, conforme descrito aqui: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
Referências
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J.
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Reimpressões e permissões
