Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Resumo

A atividade elétrica das células em tecidos pode ser monitorizada por técnicas eletrofisiológicas, mas estas geralmente limitam-se a análise de células individuais. Desde que um aumento de cálcio intracelular (Ca^{2 +}) no citosol ocorre muitas vezes devido à atividade elétrica, ou em resposta a uma miríade de outros estímulos, esse processo pode ser monitorado pela imagem de células carregado com sensíveis ao cálcio fluorescente corantes.  No entanto, é difícil esta resposta em um tipo de célula individual dentro de todo tecido da imagem porque estas tinturas são aceites por todos os tipos de células dentro do tecido. Em contraste, os indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) podem ser expressa por um tipo de célula individual e fluorescem em resposta a um aumento de intracelular Ca^{2 +}, permitindo assim a imagem de Ca^{2 +} sinalização em populações inteiras de tipos de células individuais. Aqui, nós aplicamos o uso do GECIs GCaMP3/6 até a junção neuromuscular do mouse, uma sinapse tripartida entre os neurônios motores, músculo esquelético e terminal/perisynaptic células de Schwann. Vamos demonstrar a utilidade desta técnica em preparações do tecido clássico ex vivo . Usando um divisor ótico, realizamos imagem dual-comprimento de onda de Ca^{2 +} sinais dinâmicos e um rótulo estático da junção neuromuscular (JNM) em uma abordagem que poderia ser facilmente adaptada para monitorar duas células específicas Lino ou tensão geneticamente codificado indicadores (GEVI) simultaneamente. Finalmente, discutimos as rotinas usadas para capturar espacial de mapas de intensidade de fluorescência. Juntas, estas técnicas ópticas, transgênicas e analíticas podem ser empregadas para estudar a atividade biológica das subpopulações de células distintas para o MNJ em uma ampla variedade de contextos.

Introdução

O MNJ, como todas as sinapses, é composto por três elementos: um terminal pré-sináptica derivado de um neurônio, uma célula neurônio pós-sináptico/efetoras, e um perisynaptic glia celular^1,2. Enquanto os aspectos básicos de transmissão sináptica primeiro foram demonstrados neste de sinapse³, muitos aspectos deste processo permanecem desconhecidos, em parte devido a expressão das mesmas moléculas por elementos celulares distintas desta sinapse. Por exemplo, os receptores de ambos os nucleotídeos de adenina Purina ATP e acetilcolina (ACh), que são co liberados por neurônios motores no MNJ....

Protocolo

Pecuária e experimentos foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e o IACUC na Universidade de Nevada.

1. preparação dos diafragmas e nervos frênico de ratos transgênicos

1. Compre ratos transgénicos e primeiras demão do oligonucleotide genótipo estes ratos.
   Nota: Os primers são listados na página "Informações" para cada um destes ratos.
   1. Criar um mouse de 3 a 6 meses de idade, expressando uma cópia do apropriado transgénicos/TOC-no alelo Cre-motorista e zero cópias do alelo GCaMP3/6 condicional com um segundo mouse da mesma idade expre....

Resultados

Vários exemplos de mudanças de intensidade de fluorescência, mediadas por aumentos de intracelular Ca^{2 +} dentro de tipos de células definidas do MNJ, mostram a utilidade desta abordagem. Estes resultados são apresentados como mapas de intensidade de fluorescência espacial, que fornecem a localização das células de resposta, bem como a intensidade de suas respostas, permitindo, assim, para a avaliação de quantas células respondem e quanto cada célula responde a uma determinada e.......

Discussão

Aqui nós fornecemos alguns exemplos de Ca^{2 +} respostas em células específicas no tecido neuromuscular intacto, usando ratos Lino-expressando de medição. Para executar com êxito estes experimentos, é imperativo para não machucar o nervo frênico durante a dissecção. Para^{Ca 2 +} respostas nas células de Schwann em baixa ou alta potência (ou seja, 20 X ou 60 X) de imagem, é necessário usar BHC ou µ-conotoxina ao movimento do bloco. Para imagens de baixo consumo de energia de Ca^{2 +} res.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos Myf5-Cre	Jax	#007893	Impulsiona a expressão das células musculares já em E136
Wnt1-Cre camundongos	Jax	#003829	Impulsiona a expressão em todos  Células de Schwann em E13, mas não P209
Sox10-Cre camundongos	Jax	#025807	Impulsiona a expressão de células de Schwann em idades mais avançadas
Camundongos GCaMP3 condicionais	Jax	#029043	Expressa GCaMP3 de maneira específica da célula
Camundongos GCaMP6f condicionais	Jax	#024105	Expressa GCaMP6f de maneira
específica da célulaBHC (3-(N-butiletanimidoil)-4-hidroxi-2H-cromena-2-ona)	Hit2Lead	#5102862	Bloqueia a miosina do músculo esquelético, mas não a neurotransmissão6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Rotula aglomerados de receptores de acetilcolina em NMJ
µ-conotoxina GIIIb	Peptídeos Int'l	#CONO20-01000	Bloqueia o canal de sódio dependente de voltagem Nav1.48
Gel Dielétrico de Silicone; também conhecido como Adesivos Sylgard	Ellswoth	# Gel Sil Dielec .9KG	Permite a imobilização do diafragma por pinos minuciens
Pinos minutien (diâmetro de 0,1mm)	Ferramentas de Ciência Fina	26002-10	Imobiliza diafragma em gel dielétrico de silicone
Microscópio vertical Eclipse FN1	Nikon	MBA74100	Permite a preparação e observação de espécimes
Plataforma de Microscópio Fixo Básico com Tradutor de Microscópio Manual XY	Autom8	MXMScr	Permite o movimento da amostra
Micromanipulador manual	Narishige	M-152	Segura eletrodos de gravação e estimulação
Amplificador de microeletrodo	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Permite gravação eletrofisiológica intracelular de eletrodo afiado
Sistema de aquisição de dados de baixo ruído Microeletrodo	Molecular Devices	Digidata 1550	Permite a aquisição de dados eletrofisiológicos
Sistema de análise de dados de microeletrodos	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Realiza análise de dados eletrofisiológicos
Estimulador de onda quadrada	Grass	S48	Estimula o nervo para excitar o músculo
Unidade de Isolamento de Estímulo	Grass	PSIU6	Reduz  artefatos de estimulação Filamentos
de borosilicato, diâmetro externo de 1,0 mm, diâmetro interno de 0,5 mm	Sutter	FG-GBF100-50-15	Empala e registra potenciais musculares evocados por nervos Filamentos
de borosilicato, diâmetro externo de 1,5 mm, diâmetro interno de 1,17 mm.	Sutter	BF150-117-15	Alongado e usado para eletrodo de sucção
Extrator de Micropipeta		Sutter P-97	Puxa e prepara eletrodos de gravação
Câmera cMOS retroiluminada de 1200x1200 pixels	Photometrics	Prime 95b	Câmera sensível que permite imagens de alta resolução e alta velocidade
Fonte de luz	Lumencor	Spectra X	Fornece iluminação de LEDs para observação de fluorescência
Objetivas de imersão em água fluorescente corrigidas para o infinito, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Fornece longas distâncias de trabalho para visualização de espécimes
Iluminador de Fibra Óptica com lâmpada Halógena	Sumita	LS-DWL-N	Fornece iluminação para observação de campo claro
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projetos 1 par de imagens de comprimento de onda duplo separadas por uma câmera dicróica para uma única câmera
Filtros de Banda Única  (512/25-25 e 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permite imagens de banda dupla
560 nm Dicroic Beamsplitter de borda única	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Espelho dicróico que separa feixes de luz para permitir imagens de comprimento de onda duplo
Sistema de aquisição de dados de imagem	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Permite a aquisição de dados de imagem
Módulo de controle de comprimento de onda	Nikon	MQS41220	Módulo para dados de imagem aquisição
Módulo de hardware divisor de emissões	Módulo	Nikon MQS41410	para aquisição de dados de imagem
Sistema de análise de dados de imagem	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Permite a análise da intensidade de fluorescência e outros dados de imagem