Muitos tratamentos e mutações genéticas impactam o momento da maturidade sexual e fertilidade. Este protocolo descreve um método não-invasivo para avaliar o início puberal em camundongos e ratos antes da criação de um estudo de fertilidade em animais sexualmente maduros.
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Artigo de método
Determinação da competência reprodutiva, confirmando o início puberal e realizando um ensaio de fertilidade em camundongos e ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Avaliação da competência reprodutiva é fundamental para a compreensão do impacto de um tratamento ou manipulação genética do eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. O eixo reprodutivo é um integrador de chave de entrada interna e ambiental adapta a fertilidade de condições favoráveis para a reprodução. Antes de embarcar em um estudo de fertilidade em ratos e ratos, a maturidade sexual é avaliada para excluir a possibilidade de que os fenótipos reprodutivos observados são causados por atraso ou ausência de início puberal. Este protocolo descreve uma abordagem não-invasivo para avaliar o início puberal em machos através da determinação da separação prepucial e nas fêmeas através da abertura vaginal e do primeiro estro. Após a confirmação da conclusão da puberdade e a consecução da maturidade sexual, um estudo de fertilidade pode ser iniciado. O procedimento descreve as condições de reprodução ideal para ratos e ratos, como configurar um estudo de fertilidade e quais os parâmetros para avaliar e determinar se o tratamento ou supressão do gene tem um impacto sobre a fertilidade.
Introdução
A transição da puberdade é necessário para atingir a maturidade sexual e reprodutiva competência. A transição da puberdade e a manutenção da fertilidade na idade adulta é regulada pelo eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (Figura 1). O calendário de início puberal e manutenção da fertilidade é fortemente regulamentados por fatores internos, bem como ambientais para aumentar as chances de sobrevivência da prole e os pais de1,2. Este protocolo fornece uma abordagem não-invasivo para determinar o início puberal em camundongos e ratos para confirmar a maturidade sexual antes da criação de um estudo de fertilidade para avaliar a competência reprodutiva.
Um estudo de fertilidade é executado em animais sexualmente maduros e pode ser iniciado depois que os animais passaram pela puberdade. Antes início puberal, o eixo reprodutivo é quiescente, e o principal motor da maturação sexual, hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), é liberado para a hipófise em quantidades insuficientes para iniciar a puberdade (Figura 1). Início puberal é um processo complexo que resulta em maior liberação de GnRH na eminência da mediana. GnRH promove o hormônio luteinizante (LH) e folículo-estimulante de secreção de hormônio (FSH) da hipófise, dois hormônios essenciais para a maturação gonadal e função reprodutiva (Figura 1)3,4,5 .
Insultos ao eixo reprodutivo resultam em redução da fertilidade e podem também início puberal adiantamento ou atraso. Condições conhecidas para influenciar o momento do início puberal e competência reprodutiva incluem a exposição a endócrinos produtos químicos6,7,1,do peso de corpo aumentou/diminuiu8, mudanças na comprimento de dia2,9 e mutações genéticas10,11,12,13,14,15.
O início da maturidade sexual é um passo crítico que precisa ser concluído antes da criação de um ensaio de fertilidade. As vantagens de determinar o início puberal através de separação prepucial, abertura vaginal e o primeiro estro, são as características não-invasivo desses procedimentos, que não requerem a coleta de sangue ou sacrifício do animal16, 17.
Após início puberal é determinado, corretamente, configurando um estudo de fertilidade irá fornecer informações importantes sobre a integridade do eixo reprodutivo e geralmente tem a segunda vantagem de gerar animais experimentais para estudos adicionais (refinamento) 18. a instalação de estudo de fertilidade descrita neste protocolo pode detectar pequenos e grandes déficits em competência reprodutiva em machos e fêmeas. Principais parâmetros avaliados incluem 1) tempo para a primeira ninhada, 2) número de ninhadas gerado em um determinado tamanho de tempo e maca 3). Finalmente, as recomendações para o tipo de acompanhamento de estudos, que pode ser realizado para identificar a causa de deficiência de fertilidade estão incluídas.
O protocolo descrito refere-se aos ratos e os dados representativos refletem o trabalho realizado em ratos transgénicos. No entanto, todos os protocolos incluídos são igualmente válidos em ratos.
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University e conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. determinar o início puberal
- Siga as orientações institucionais para a roupa, no mínimo, é necessário usar um jaleco limpo e luvas esterilizadas. Sempre lidar com ratos usando luvas limpas.
- Prepare a área de trabalho, colocando uma almofada em cima da mesa.
- Coloque um top de gaiola limpa do mouse com a grade virada para cima no teclado.
- Configure uma escala na área de trabalho. Coloque um copo limpo 500 – 1000 mL sobre a escala e a Tara.
- Coloque uma folha ao lado da área de trabalho para registro de peso e separação prepucial, abertura vaginal ou primeiro estro.
- Identifica os ratos para o estudo. Realizar inspecções diárias para início puberal até que seja atingida a puberdade. Execute a inspeção ao mesmo tempo do dia ao longo do estudo. Início puberal pode ocorrer tão cedo quanto pós-Natal dia 11-12,19, no entanto, em configurações mais experimentais, monitoramento de início puberal inicia em ~ 22 dias.
- Coloque a gaiola do rato na área de trabalho (etapa 1.2). Abra a jaula e coloque a tampa, garrafa de água e titular de comida na mesa.
- Determinar a separação prepucial em ratos masculinos.
- Mantendo o mouse pela cauda, coloque-o sobre o topo de gaiola do rato limpo da etapa 1.2.1. Enquanto suavemente, segurando a cauda, deixe o mouse explorar a grade do topo da gaiola para ~ 5 s.
- Puxe delicadamente a cauda para trás; Isso geralmente resulta em seguir em frente, mantendo-se para a grade com suas patas dianteiras o animal. Abordagem a outra mão sobre a pele para fechar o pescoço e orelhas.
- Segure a pele solta entre os ombros e o pescoço com o polegar e o indicador. É importante para obter uma boa preensão da pele, como irá impedir que o mouse virar sua cabeça para morder.
- Pegue a pele na parte de trás com os restantes dedos e segure-a pressionando contra a mão. Segure firmemente sem obstruir a respiração, músculos de fluxo, ou prejudiciais, ossos, sangue ou pele. Vire a mão para expor a barriga do rato, apoiando as costas do mouse dentro da palma da mão.
- Com a mão livre, delicadamente empurre para trás a pele ao redor do pênis sem forçar. Na separação prepucial, a pele prepucial desliza para trás, expondo a glande do pênis (Figura 2A, seta mostrando separação prepucial). Registre a presença ou ausência de separação prepucial.
- Pesar o mouse, suavemente, colocando-o no copo de 500-1000 mL da etapa 1.2.2 e registar o peso.
- Reintroduzir o rato na gaiola habitação, segurando o copo 0-2 cm sobre o piso da gaiola e tombar lentamente o copo permitindo o mouse para sair por conta própria. Limpar o copo com água e detergente neutro e secá-lo bem antes de devolvê-lo à escala e Tarar a balança.
- Determinando a abertura vaginal em ratos fêmeas.
- Coloque uma bola de algodão, copo e uma garrafa de água estéril na área de trabalho (etapa 1.2). Despeje a água no copo. Umidificar a bola de algodão com água estéril e colocá-lo ao lado da parte superior da gaiola da etapa 1.2.1.
- Coloque a gaiola do mouse na área de trabalho (etapa 1.2) e transferir o mouse de sua gaiola em casa para o topo da gaiola (etapa 1.2.1) segurando-o na base da cauda. Suavemente, puxe a cauda para incentivar um movimento do mouse.
- Levante a cauda apoiando os quadris com os dedos grátis. Permitir que os membros traseiros manter contato com a parte superior da gaiola. Se o mouse se move muito, segure na mão conforme descrito em etapas 1.5.1-1.5.4.
- Limpe suavemente a vulva com a bola de algodão umidificado água da etapa 1.6.1. Use uma bola de algodão limpo umidificado para cada rato. Para determinar a abertura vaginal, examinar a vulva e determinar se a vagina está completamente aberto (Figura 2A, abertura vaginal feminina).
- Recorde se ocorreu a abertura vaginal. Pesar o mouse e devolvê-lo para a gaiola em casa, conforme descrito em etapas 1.5.6-1.5.7.
- Primeiro estro, um indicador de primeira ovulação.
- Coloca um copo com água estéril, uma lâmina de vidro rotulado e uma pipeta de 200 µ l, com uma ponta limpa na área de trabalho (etapa 1.2).
- Segure a fêmea conforme descrito no passo 1.6.2-1.6.3. Coloque a ponta da pipeta contendo ~ 50 µ l de água estéril na abertura vaginal.
- Lave delicadamente as células da parede vaginal introduzindo e reabsorvendo ~ 50 µ l de água 2 - 4 vezes. Esfregaço do conteúdo da ponta da pipeta numa lâmina de microscópio de vidro rotulado.
- Observar cuidadosamente a morfologia celular em um microscópio de brightfield usando um 10 X ou 20 X de objectivo ou deixe-o muito de esfregaço para ~ 1 h e depois counterstain com uma solução de azul de metileno 0,1% (dissolvida em ddH2O) (Figura 2B). Para counterstain, mergulhe o slide secado para a solução de azul de metileno 0,1% para ~ 30 s. Deixe o ar de slide secar por 1h.
- Observe os slides da etapa 1.7.4 em um microscópio de campo claro em 10x ou 20x. Estabelece o estágio do ciclo estral (Figura 2B)20 , observando a morfologia celular que permite distinguir as quatro fases distintas do ciclo estral (Figura 2B).
Nota: Metestrus é caracterizada por uma mistura de células epiteliais escamosas cornificadas e leucócitos, diestro por leucócitos, proestro por uma mistura de leucócitos e células epiteliais nucleadas e estro por células epiteliais cornificadas (Figura 2B) 20. - Registrar o peso do corpo e retornar o mouse para sua gaiola em casa, conforme descrito em etapas 1.5.6-1.5.7. Esfregaços vaginais são finalizados no dia em que o mouse tem seu primeiro estro (Figura 2B).
2. desejável a criação de condições de sala
- Certifique-se de que a sala de reprodução tem uma temperatura de ~ 20-24 ° C, com 55 ± 10% de humidade e homogénea de quarto luz de uma intensidade de ~ 300-400 lux aproximadamente 1 m acima do piso21. Esta intensidade de luz permite que a intensidade da luz desejável meio da gaiola de 25-80 lux. Para testar a intensidade da luz, use um medidor de luz.
- Use um sistema automatizado para controlar a iluminação na sala de reprodução para garantir o sincronismo adequado de iluminação ao longo do experimento. Condições ideais de dia-comprimento para avaliar a fertilidade no intervalo de roedores de um dia de 12h (12 h luz e escuridão de 12 h, LD12:12), "verão-como" condições com 14 h de luz e 10 h de escuridão (LD14:10)21.
- Prepare as gaiolas de criação.
- Prepare uma gaiola do rato limpo com tampa, água, comida, roupa de cama e ninhos por casal reprodutor.
- Preencher os cartões de gaiola com todas as informações necessárias, incluindo o sexo, data de nascimento, cepa de rato e a data quando o acasalamento é setup.
3. estudo de fertilidade
- Identifica os animais a ser usado para o estudo de fertilidade. Certifique-se de que os animais são sexualmente maduros (etapa 1). Uma gama de idade normalmente usadas para configurar um estudo de fertilidade em ratos é de 10-16 semanas de idade, uma idade onde maturação sexual foi concluída em condições mais experimentais.
- Sobre uma mesa limpa, coloque a gaiola de reprodução, preparada no passo 2.3.
- Pegar e segurar o mouse.
- Lentamente, introduza uma mão enluvada da gaiola do rato. Deixe a mão na gaiola por um curto período de tempo (~ 5-30 s), permitindo que os ratos adaptar-se ao cheiro da luva e mão. Evite movimentos espasmódicos e agitados.
- Abaixe a mão em concha perto do fundo da gaiola e abordá-lo lentamente para os ratos. Eles vão fugir. Quando eles correm sobre a mão, prenda o rabo de um rato entre o polegar e o dedo indicador.
- Levante o mouse pela cauda para 2-3 s. Se o mouse precisa ser mantido por mais, segurar a cauda e posicione o mouse na mão em concha mantendo a espera na cauda.
- Transferi 1 masculino e, posteriormente, 1 fêmea para a gaiola de reprodução por segurando-os pela cauda (passo 3.3). Certifique-se de que as fêmeas estão na mesma fase estral ao configurar o ensaio de fertilidade. Determine a fase estral das fêmeas através da realização de um esfregaço vaginal conforme descrito na etapa 1.7.
- Fechar a gaiola e certifique-se de que os ratos têm comida, água e assentamento do material. Anexe o titular do cartão de gaiola com o cartão da gaiola para a gaiola.
- Coloque a gaiola de reprodução na prateleira a habitação. Deixe a gaiola de reprodução tão intacta quanto possível por toda a duração do estudo da fertilidade. Conduza o estudo de fertilidade por 30 dias. Para cada par de reprodutores, manter registros detalhados e Nota 1) a data que do acasalamento está configurado, 2) a data ninhadas nascem e 3) o número de filhotes nascidos, incluindo filhotes mortos e vivos. Execute verificações de lixo diariamente ao longo do estudo.
- Prolongar a fertilidade do estudo para um adicional de 30-60 dias se não ou um fraco impacto na fertilidade é estabelecido no passo 3.6.
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Resultados
Os resultados apresentados são de dois modelos de mouse diferente de transgênicos, onde o fator dos transcrição, nomeadamente a homeobox anterior Ventral 1 (Vax1) foi excluído em todo o corpo em um alelo, aqui referido como heterozigoto ratos (HET)13, ou Vax1 foi condicionalmente excluído dentro de GnRH neurônios22, aqui denominado KO condicional (cKO). Antes de configurar o estudo de fertilidade, é importante confirmar o i...
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Discussão
O bem-estar geral dos ratos é fundamental para um ensaio de fertilidade bem sucedida21. Ao realizar um ensaio de fertilidade, é importante verificar fisicamente não nos ratos todos os dias pois isso pode causar estresse. Mais Evite mudanças frequentes de gaiola, como estas também são estressantes. Idealmente as alterações gaiola serão feitas não mais do que 1 - 2 vezes por semana. Exposição à luz durante a fase de escura impacta negativamente reprodutores em roedores noturnos. Não ligue as luzes n...
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Divulgações
O autor não tem nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradeço os autores que contribuem para o trabalho inicial, que é a base desta publicação. Graças a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan e Erica L. Schoeller para ajudar a preparar o manuscrito. Graças a Jessica Lee de Sora e queixo de Austin para assistência técnica com o manuscrito. H.M.H. foi apoiado por Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R00HD084759.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bolas de algodão estéreis | Fisher | 22456885 | |
| Protetor de superfície | Fisher | 1420637 | |
| Medidor de luz | VWR | 21800-014 | |
| Azul de metileno | Lâminas de Microscópio Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Genesee Scientific | 29-101 | ||
| Suporte Optimouse com gaiolas | Cesta de | C89100 | |
| Sistemas AnimalCare | C61011 | ||
| Tampos de gaiola filtrados | Sistemas AnimalCare | C78210 | |
| Alimentador padrão Optimice | Sistemas AnimalCare | C40100SG | |
| Porta-cartões de gaiola | Sistemas AnimalCare | C43251 | |
| Cartões de gaiola | Sistemas AnimalCare | M52010 | |
| Garrafa Assambley | Sistemas | AnimalCare | |
| Cama R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Cama de Espiga de Milho | A | 8B | |
| Teklad | 7904 (7004) | ||
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Copo de polipropileno | Fisher | 14-955-111F |
Referências
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Reimpressões e permissões
