Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.
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Artigo de método
Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A análise da célula-célula ou célula-patógeno interação na vivo é uma ferramenta importante para compreender a dinâmica da resposta imune à infecção. Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) permite a observação das interações célula no tecido profundo em animais vivos, minimizando o fotobranqueamento gerado durante a aquisição de imagens. Até à data, têm sido descritos diferentes modelos para 2P-IVM dos órgãos linfoides e não linfoides. No entanto, a imagem de órgãos respiratórios permanece um desafio devido ao movimento associado com o ciclo de respiração do animal.
Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar na vivo celular imune interações na traqueia de camundongos infectados com o vírus da gripe usando 2P-IVM. Para este fim, nós desenvolvemos uma plataforma de imagem personalizada, que incluía a exposição cirúrgica e intubação da traqueia, seguida pela aquisição de imagens dinâmicas de neutrófilos e células dendríticas (DC) no epitélio da mucosa. Além disso, nós detalhados os passos necessários para realizar a gripe intranasal infecção e fluxo cytometric análise de células do sistema imunológico na traqueia. Finalmente, analisamos neutrófilos e motilidade DC, bem como suas interações no decurso de um filme. Este protocolo permite a geração de imagens de 4D estável e brilhante necessário para a avaliação de interações célula-célula na traqueia.
Introdução
Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) é uma técnica eficiente para tempo real de imagens de célula para célula interações que ocorrem em seu ambiente natural1. Uma das principais vantagens deste método é que permite o estudo de processos celulares em uma maior profundidade de amostra (500 µm a 1 mm) comparado com outros tradicionais de técnicas de imagem2. Ao mesmo tempo, o uso de dois fótons de baixa energia gerada pelo laser dois fotões minimiza o foto-dano no tecido normalmente associado com o processo de aquisição de imagem2. Durante a última década, 2P-IVM foi aplicada para estudar dife....
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Protocolo
Todos os procedimentos de animais envolvendo ratos foram realizados em conformidade com as orientações de veterinário Federal suíço e protocolos de animais foram aprovados pelas autoridades locais do veterinário.
1. gripe infecção de ratos CD11c-YFP
- Biossegurança
Nota: A cepa de rato adaptado da gripe H1N1 de Rico/8/34 A/Puerto (PR8) foi cultivada em ovos fertilizados, purificada e titulada como descrito anteriormente,21. Todos os passos que envolvem animais infectados ou amostras biológicas foram realizados sob uma armário de acordo com o nível de biossegurança (BSL) de biossegurança 2 ....
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Resultados
Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para estudar na vivo a motilidade e as interações entre os neutrófilos e DC durante a infecção da gripe na traqueia murino (Figura 3A). Para esta finalidade, isolamos neutrófilos PCP+ (92% de pureza; Figura 3B) de CK6-ECFP ratos e nos enviaram transferindo-os para um rato de CD11c-YFP infectado com gripe. Depois disso, foram realizadas 2P-IVM da traqueia no di.......
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Discussão
Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para a geração de imagens de 4D, mostrando a migração de neutrófilos enviaram transferidos e suas interações com DC durante uma infecção de gripe na traqueia do mouse. O modelo descrito 2P-IVM será relevante para estudar a dinâmica de células imunes durante uma infecção nas vias aéreas.
Recentemente, vários modelos com base na visualização da dinâmica celular das vias aéreas têm sido desenvolvidos9,
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da Fundação Nacional Suíço (SNF) (176124, 145038 e 148183), o Europeu Comissão Marie Curie reintegração Grant (612742) e o SystemsX.ch de uma subvenção para D.U.P (2013/124).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gigasept instru AF | Schü lke & Camundongos Mayr GmbH | solução a 4% | |
| CD11c-YFP | Jackson Laboratories | 008829 | camundongos foram criados internamente |
| camundongos CK6-ECFP | Laboratories | camundongos 004218 | foram criados internamente |
| 1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco modificada sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modificado sem Cloreto de Cálcio e Cloreto de Magnésio | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Armazene em 4° C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Loja na RT, loja em 4 & C quando em solução de mistura ket/xila |
| Rompun 2% (Xilazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Armazenar em RT, armazenar em 4 &graus; C quando em solução de mistura ket/xyl |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G, 0,3 mL BD Seringas de Insulina Micro-Fina | BD 324826 | ||
| Falcon 40 µ m Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Seringas de 2 mL | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x agulhas de 18 G | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (cateter) | Braun | 4251652.01 | |
| Conjunto de Cultura de Células de 6 Poços | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Loja em 4° C |
| Liberase TL Grau de Pesquisa | Roche | 5401020001 | Store a -20 ° Mistura de C / colagenase (I e II) |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Armazenar a -20 &graus; C |
| CellTrace Mancha violeta | ThermoFisher Scientific | C34557 | Armazenar a -20 ° C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco | 10270-106 | Armazene a -20 ° C |
| PE-10 Micro Tubo Médico | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Fita Plástica Cirúrgica | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Loja Lomb | na RT | |
| Plasticina | Ohropax | ||
| de Cobertura de Vidro de Alta Tolerância 15 mm Redonda | Warner Instruments | 64-0733 | |
| Sistema de Anestesia Animal Portátil SomnoSuite | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (bancada de anestesia gasosa e aquecimento) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | Universidade de Berna | ||
| TrimScope II Microscópio de dois fótons | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 objetiva de imersão em água | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube& A câmara de incubação e o controlador de temperatura da | caixa Serviços | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Software de imagem | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Software estatístico |
Referências
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M.....
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Reimpressões e permissões
