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Artigo de método

Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos

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DOI:

10.3791/58373

⸱

26 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) de ROS (espécies reativas de oxigênio) eliminação na vivo, nanoceria de imagens em tecidos vegetais por microscopia confocal e na vivo monitoramento de nanoceria ROS eliminação pela microscopia confocal.

Resumo

Acumulação de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio é uma marca registrada da resposta ao estresse abiótico planta. ROS desempenham um papel duplo em plantas actuando como sinalização moléculas em níveis baixos e danificando moléculas em níveis elevados. Acumulação de ROS em plantas estressadas pode danificar metabolitos, enzimas, lipídeos e DNA, causando uma redução do crescimento das plantas e o rendimento. A capacidade de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) para eliminar cataliticamente ROS na vivo fornece uma única ferramenta para compreender e tolerância de estresse abiótico bioengineer planta. Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar e caracterizar nanoceria revestido poli (acrílico), ácido (PNC), interface as nanopartículas com plantas através de infiltração de lâmina de folha e monitorar sua distribuição e eliminação na vivo usando confocal de ROS microscopia. Atuais ferramentas moleculares para manipular a acumulação de ROS em plantas são limitadas a espécie de modelo e exigem métodos de transformação laborioso. Este protocolo para na vivo ROS eliminação tem potencial para ser aplicado ao tipo selvagem plantas com folhas largas e estrutura da folha como Arabidopsis thaliana.

Introdução

Nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) são amplamente utilizadas em organismos vivos, de pesquisa básica de bioengenharia, devido a suas espécies distintas catalítico reativas de oxigênio (ROS) eliminação de capacidade1,2,3. Nanoceria ter ROS eliminação habilidades devido a um grande número de vagas de superfície oxigênio que alternam entre dois oxidação Estados (Ce3 + e4 +Ce) 4,5,6. Os Ce3 + oscilação títulos efetivamente eliminar ROS enquanto as cepas de treliça em nanoescala promovem a regeneração destes sites de defeito através de redox reações7de ciclismo. Nanoceria também têm sido usados recentemente para estudar e engenharia planta função8,9. Plantas sob estresse abiótico experimentam acúmulo de ROS, causando danos oxidativos de lipídios, proteínas e DNA10. Em plantas da . thaliana , nanoceria catalítico eliminação de ROS na vivo leva a fotossíntese da planta melhorada sob alta luz, calor e refrigeração salienta8. Aplicação nanoceria para o solo também aumentos atirar rendimento da biomassa e o grão de trigo (Triticum aestivum)11; as plantas de canola (Brassica napus) tratadas com nanoceria têm maior biomassa de plantas sob estresse sal12.

Nanoceria oferecer bioengineers e biólogos da planta uma ferramenta baseada em nanotecnologia para compreender as respostas de estresse abiótico e aumentar a tolerância de estresse abiótico de planta. Na vivo ROS eliminação capacidades do Nanoceria são independentes das espécies de plantas, e a entrega fácil nos tecidos vegetais tem o potencial para permitir ampla aplicação fora de organismos modelo. Ao contrário de outros métodos baseados em geneticamente, nanoceria não exigem gerando linhas de planta com a superexpressão de enzimas antioxidantes para ROS maior eliminação de capacidade13. Infiltração de lâmina de folha de nanoceria de plantas é uma abordagem prática para a pesquisa em laboratório.

O objetivo geral do presente protocolo é para descrever 1) a síntese e caracterização de poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) a entrega e rastreamento de PNC em toda as células da folha e 3) a vigilância de eliminação ROS PNC-habilitado em vivo. Neste protocolo, poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) são sintetizados e caracterizada pelo seu espectro de absorção, diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta. Nós descrevemos um método de infiltração de lâmina de folha simples para lançar PNC para fábrica de tecidos da folha. Para imagens em vivo de nanopartículas distribuição dentro das células do mesofilo, uma tintura fluorescente (DiI) foi usada para rotular PNC (DiI-PNC) e observar as nanopartículas através de microscopia de fluorescência confocal. Finalmente, vamos explicar como monitorar na vivo PNC ROS eliminação através de microscopia confocal.

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Protocolo

1. cultivo de plantas da . thaliana

  1. A. thaliana semear em potes descartáveis 5 cm x 5 cm, preenchidos com mistura de solo padrão. Colocar 32 destes vasos em uma bandeja de plástico cheia de água (~ 0,5 cm de profundidade) e transferir a bandeja plástica com as plantas em uma câmara de crescimento de planta.
    1. Definir o crescimento câmara configurações como segue: 200 µmol/ms fotossinteticamente ativa radiação (PAR), 24 ± 1 ° C de dia e 21 ± 1 ° C à noite, 60% de umidade e regime de luz de dia/noite h 14/10, respectivamente.
  2. Diluir cada pote para deixar apenas uma planta individual após uma semana de germinação. Tome nota para manter as mudas com tamanho similar em cada vaso.
  3. Água os potes deitando água de torneira diretamente na bandeja de plástico uma vez a cada dois dias. Crescem as plantas durante quatro semanas. A. thaliana plantas estão prontas para utilização posterior.

2. síntese e caracterização de PNC

  1. Pesar de 1,08 g de nitrato de cério (III) e dissolvê-lo em 2,5 mL de água de grau biologia molecular em um tubo cónico de 50 mL.
  2. Pesa 4,5 g de ácido poli (acrílico) e dissolvê-lo em 5 mL de água de grau biologia molecular em um tubo cónico de 50 mL.
  3. Misture estas duas soluções completamente a 2.000 rpm durante 15 minutos usando um mixer digital de vórtice.
  4. Transferi 15 mL de solução de hidróxido de amônio (7,2 M) para um copo de vidro de 50 mL.
  5. Ao agitar a 500 rpm, adicionar a mistura de passo 2.3 gota a gota para a solução de hidróxido de amônio e agitar a 500 rpm, à temperatura ambiente durante 24 horas em uma coifa.
  6. Cubra o copo com um pedaço de papel para evitar a perda substancial de solução durante a reação durante a noite.
  7. Após 24 h, transferir a solução resultante para um tubo cónico de 50 mL e centrifuga-lo a 3.900 x g, durante 1 h remover quaisquer detritos possíveis e grandes aglomerados.
  8. Transferir este 22,5 mL da solução sobrenadante em três filtros de 15 mL 10 kDa e preencher o restante do filtro com água molecular da classe tornar-se uma diluição total de 45 mL.
  9. Purificar a solução sobrenadante de polímeros grátis e outros reagentes com uma centrífuga de bancada, adicionando o sobrenadante para um filtro de 15 mL 10 kDa e centrifugar 3.900 x g por 15 min. Repita este passo pelo menos seis vezes.
  10. Medir a absorvância de eluente em cada ciclo com um espectrofotômetro UV-VIS de 220-700 nm para não garantir nenhuma enciclopédia polímeros e outros reagentes estão presentes na solução final PNC.
  11. Pegue a solução PNC coletada para a seringa de 5 mL e filtrá-la contra um filtro de seringa de tamanho de poro de 20 nm. Recolha a solução PNC filtrada em um tubo cónico de 50 mL.
  12. Pegue uma solução diluída de PNC final em uma cubeta plástica e medir a absorvância com o espectrofotômetro UV-VIS de 220-700 nm. Pico de absorbância PNC é a 271 nm.
  13. Calcule a sua concentração, usando a lei de Beer-Lambert: A = εCL. A é a absorvância do valor de pico para uma determinada amostra, ɛ é o coeficiente de absorção molar do PNC (cm-1 M-1), L é o comprimento do percurso óptico (largura da cubeta, neste método de 1 cm) e C é a concentração molar de nanopartículas medidas.
  14. Medir o diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta do PNC sintetizado usando uma partícula tamanho e zeta potencial analisador (Figura 1).
  15. Armazene a solução final do PNC no frigorífico (4 ° C) até utilização posterior.
    Nota: Por favor, consulte Wu et al. 8 para mais detalhes do protocolo sobre caracterização de PNC.

3. rotulagem PNC com corante fluorescente DiI

  1. Misture a 0,4 mL de 5mm (58 mg/L) PNC com 3,6 mL de biologia molecular da classe água em um frasco de vidro de 20 mL e agitar a 500 rpm.
  2. Adicionar 24 µ l 1 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine solução de tintura de perclorato (DiI, 2,5 mg/mL; diluído em DMSO) em µ l 176 de DMSO (Dimetilsulfóxido) para fazer a solução de tintura de DiI.
  3. Adicione o corante DiI gota a gota à solução de PNC, agitando a 1.000 rpm por 1 min à temperatura ambiente.
  4. Transfira esta mistura resultante em um filtro de kDa 15 mL 10 e encher o tubo até o topo com água de grau biologia molecular para fazer a diluição total 15 mL.
  5. Purifica o DiI rotulado solução PNC (DiI-PNC) de DMSO e qualquer tintura de DiI livre possível por uma centrifugação de bancada com o filtro de kDa 15 mL 10 a 3.900 x g por 5 min.
    1. Repita a etapa 3.5 pelo menos cinco vezes.
  6. Filtre as soluções DiI-PNC finais através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 20 nm.
  7. Medir a absorvância da final DiI-PNC por espectrofotometria UV-VIS e calcular sua concentração de acordo com a lei de Beer-Lambert (Figura 2). Consulte Passo 2.13 para mais detalhes.
  8. Armazená-lo em um refrigerador a 4 ° C para utilização posterior.

4. infiltração da planta deixa com PNC

  1. Adicionar 0,1 mL de infiltração buffê (100mm TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado pelo HCl) em 0,9 mL de solução PNC ou DiI-PNC de 0,5 mM e vórtice-lo. Use uma solução de 10 mM de tampão de infiltração TES como controlo negativo.
  2. Transferência de 0,2 mL da solução de infiltração de PNC ou DiI-PNC a uma seringa de agulhas esterilizadas 1ml. Torneira para remover quaisquer bolhas de ar possível.
  3. Recupere a planta da câmara de crescimento antes de infiltração com nanopartículas para evitar o fechamento de estômatos possível sob condições de luz do quarto.
  4. Antes da infiltração, medir o teor de clorofila das folhas da . thaliana com tamanho similar usando um medidor de clorofila. Medir cada folha com três repetições (cada replicação consistindo de pelo menos três medições)14. Escolha que a a. thaliana deixa com conteúdo de clorofila semelhante para o experimento de infiltração.
  5. Infiltrar as folhas lentamente com a solução recentemente preparada de PNC ou DiI-PNC pressionando suavemente a ponta da seringa auto-injeções contra a parte inferior da lâmina da folha (abaxial lado) e pressione o êmbolo(Figura 3).
  6. Gentilmente Limpe a excesso solução que permanece na superfície da lâmina de folha (Figura 3B) usando um limpador de delicada tarefa (Figura 3C) e rotular a planta. Utilize toalhetes de delicada tarefa nova para cada grupo de folhas.
  7. Mantenha os infiltrados a. thaliana plantas no banco para adaptação de folha e incubação com PNC ou DiI-PNC para 3h.
    Nota: Plantas infiltradas a. thaliana então estão prontas para utilização posterior (Figura 3-D).

5. preparação de amostras de folha para a microscopia Confocal

  1. Rolo uma quantidade do tamanho de ervilha de observação do gel para um raio de 1 cm(Figura 4)e então espalhe até 1 mm fina sobre uma lâmina de vidro (Figura 4B).
  2. Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,3 cm) para cortar uma secção circular no centro do gel observação sobre a lâmina de vidro (Figura 4C).
  3. Enchem o corte bem inteiramente perfluorodecalin (PFD) para resolução de imagem mais profunda e melhor confocal nos tecidos da folha.
  4. Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,2 cm) coletar os discos de folha do DiI-PNC adaptado se infiltrou a. thaliana plantas (Figura 4-D).
  5. Montar o disco de folha no PFD preenchido Encare o lado infiltrado (abaxial) da folha.
  6. Colocar uma lamela quadrada em cima do disco de folha e pressione suavemente sobre a lamela de slide uniformemente para selá-lo com o poço do gel de observação e garantir que não há bolhas de ar permanecem presos (Figura 4E).

6. imaging DiI-PNC em tecidos de folha por microscopia Confocal

  1. Use uma lente de objetiva 40 X em um laser invertido microscópio confocal de varredura.
  2. Deixe duas a três gotas de DDQ2O na parte superior a 40 X da lente objetiva.
  3. Coloque o slide de amostra de folha DiI-PNC infiltrou-se preparado em cima o invertido 40 X lente objetiva.
    1. Certifique-se de lado a lamela, mas não o vidro deslizar contato diretamente com o ddH2O na lente.
  4. Encontre uma região de interesse na amostra ao microscópio com luz laser ou campo brilhante.
  5. Inicie o software do microscópio e ligue o laser de argônio (fixado em 20%).
  6. Defina o pinhole para coletar uma fatia óptica inferior a 2 µm e uma média de linha de 4.
  7. Imagem da amostra com as configurações do microscópio confocal: excitação de laser 514 nm (30%); Espessura de corte de Z-pilha: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (para a imagem latente de DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (para a imagem latente do cloroplasto).
  8. Leve imagens confocal representante de amostras de folhas de indivíduos diferentes, um mínimo de três repetições biológicas.

7. imaging PNC na vivo ROS eliminação por microscopia Confocal

  1. Preparar 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, um corante para indicar uma ROS geral) e dihydroethidium de 10 µM (DHE, um corante para indicando o anião superóxido) corantes em buffer de infiltração de TES (pH 7,5) em tubos de microcentrifuga de 1,5 mL, separadamente.
  2. Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,2 cm) para coletar a folha discos do PNC adaptado se infiltrou a. thaliana plantas.
    1. Use a ponta afiada da pinça para fazer três ou quatro furos nos discos folha para acelerar o processo de carregamento de tinta.
  3. Transferência da folha discos para tubos microcentrifuga com H2DCFDA e DHE separadamente e incube por 30 minutos sob a escuridão.
  4. Após a incubação, enxágue a folha discos com DDQ2O três vezes e montar ele no vidro deslizar com observação gel (ver protocolo seção 5).
  5. Colocar o slide no microscópio confocal e manualmente o foco para uma região de células do mesofilo de folha. Consulte o protocolo seção 6 para obter detalhes.
  6. Expor os discos de folha para o UV-A (405 nm) laser para 3 min gerar ROS e registrar a mudança de intensidade do sinal ROS em séries temporais ("xyt") por disco de folha.
  7. Imagem do disco de folha com as configurações do microscópio confocal: 40 X água objetivo; excitação de laser 496 nm; PMT1: 500-600 nm (DHE DCFDA corante detecção e); PMT2: 700-800 nm (para a deteção de cloroplastos). Use uma planta infiltrada com solução de tampão só da infiltração como controlo negativo.

8. PNC eliminação de H2O2em vitro

  1. Realizar a atividade mimética CAT (catalase) do sintetizado PNC em vitro , seguindo os métodos em publicações anteriores3,8,15
  2. Adicionar 45,4 µ l de 1 x TES de infiltração de buffer (10mm TES, 10 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado pelo HCl), PNC (60 nM, 3 µ l) e H2O2 (2 µM, 1 µ l) em um poço (prato bem fundo redondo branco 96) e misture suavemente pipetando.
  3. Adicionar 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine (trabalho concentração 100 µM, 0,5 µ l) e a peroxidase de rábano (HRP; concentração de trabalho 0,2 U/mL, 0,1 µ l) dentro do poço, delicadamente misturar pipetando e incube-lo por 30 min. 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reage com o H2O2 e é convertido em resorufin na presença de HRP.
    1. Embrulhe o prato com papel de alumínio para evitar a luz durante a incubação.
    2. Prepare um controlo negativo usando amortecedor da reação ou água para substituir o H2O2.
    3. Exceto para a solução-mãe, prepare todas as outras soluções à temperatura ambiente.
  4. Após a incubação, com um leitor de placas, monitorar a absorvância a 560 nm usar resorufin para indicar o nível de H2O2. Regime de tempo definido em 0, 2, 5, 10, 20 e 30 min.

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Resultados

Caracterização e síntese PNC .
PNC foram sintetizados, purificada e caracterizada a seguir o método descrito na seção de protocolo 2. Figura 1 A mostra a coloração das soluções de nitrato de cério, PAA, a mistura de nitrato de cério e PAA e PNC. Uma mudança de cor do branco para amarelo claro é vista depois de PNC é sintetizado. Após a purificação com um filtro de 10 kDa, PNC foram caracterizados ...

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Discussão

Neste protocolo, descrevemos PNC síntese, caracterização, tintura fluorescente rotulagem e imagem latente confocal das nanopartículas dentro de células do mesofilo de vegetais para expor seu na vivo ROS eliminação atividade. PNC são sintetizados a partir de uma mistura de PAA solução de hidróxido de amónio e nitrato de cério. PNC caracterizam-se por spectrophotomery de absorção e a concentração de determinada usando a lei da cerveja-Lambert. Medições de potencial zeta confirmaram a superfície carregada negativam...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Riverside e USDA National Institute of Food e agricultura, projeto Hatch 1009710 para J.P.G. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. 1817363 de J.P.G.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nitrato de cério (III) hexahidratadoSigma-Aldrich238538-100G
Grau de Biologia Molecular Água, CorningVWR45001-044 
Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 50 mLVWR14-959-49A
Poli (ácido acrílico) 1.800 MwSigma-Aldrich323667-100G
Misturador de Vórtice Digital Fisherbrand FisherScientific02-215-370
Acessório de Misturador de Vórtice Digital Fisherbrand, Retentor de InserçãoFisher Scientific02-215-391
Acessórios para Misturador Digital Vortex da Fisherbrand: Conjunto de Inserção de EspumaFisher Scientific02-215-395
Solução de hidróxido de amônioSigma-Aldrich05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduado, CorningVWR13912-149 
RCT basicIKA3810001
Eppendorf Microcentrífuga 5424VWR80094-126
Amicon Ultra-15 Unidades de Filtro CentrífugoMillipore-SigmaUFC901024
Allegra X-30 Series Centrífugade Bancada Beckman CoulterB06314
UV-2600 SptecrophotometerShimadzuUV-2600 120V
Filtro de seringa Whatman Anotop 10Sigma-AldrichWHA68091102
BD com pontas Luer-LokFisher Scientific14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina percloratoSigma-Aldrich42364-100MG
Dimetilsulfóxido, ACSVWRBDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1Green Island Distributors, Inc5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES, >99% (titulaçãoSigma-AldrichT1375-100G
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM8266-1KG
Seringa Air-Tite All-Plastic Norm-JectFisher Scientific14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Limpeza de Tarefas DelicadasFisher Scientific06-666A
Carolina Observation GelCarolina132700
Corning lâminas de microscópio, fosco de um lado, uma extremidadeSigma-AldrichCLS294875X25-72EA
Broca de Cortiça Conjuntos com AlçasFisher ScientificS50166A
PerfluorodecalinSigma-AldrichP9900-25G
Micro Cover Glasses, Quadrado, Nº 1VWR48366-045
Microscópio Confocal de Varredura a Laser Leica TCS SP5Leica MicrosystemsTCS SP5
2′,7′-Diacetato de diclorofluorescinaSigma-AldrichD6883-250MG
DihidroetídioSigma-AldrichD7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Uvette cuvettesSigma-AldrichZ605050-80EA
Medidor de clorofila Konica MinoltaSPAD-502
Seringas descartáveis

Referências

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