Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) de ROS (espécies reativas de oxigênio) eliminação na vivo, nanoceria de imagens em tecidos vegetais por microscopia confocal e na vivo monitoramento de nanoceria ROS eliminação pela microscopia confocal.
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Artigo de método
Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Acumulação de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio é uma marca registrada da resposta ao estresse abiótico planta. ROS desempenham um papel duplo em plantas actuando como sinalização moléculas em níveis baixos e danificando moléculas em níveis elevados. Acumulação de ROS em plantas estressadas pode danificar metabolitos, enzimas, lipídeos e DNA, causando uma redução do crescimento das plantas e o rendimento. A capacidade de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) para eliminar cataliticamente ROS na vivo fornece uma única ferramenta para compreender e tolerância de estresse abiótico bioengineer planta. Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar e caracterizar nanoceria revestido poli (acrílico), ácido (PNC), interface as nanopartículas com plantas através de infiltração de lâmina de folha e monitorar sua distribuição e eliminação na vivo usando confocal de ROS microscopia. Atuais ferramentas moleculares para manipular a acumulação de ROS em plantas são limitadas a espécie de modelo e exigem métodos de transformação laborioso. Este protocolo para na vivo ROS eliminação tem potencial para ser aplicado ao tipo selvagem plantas com folhas largas e estrutura da folha como Arabidopsis thaliana.
Introdução
Nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) são amplamente utilizadas em organismos vivos, de pesquisa básica de bioengenharia, devido a suas espécies distintas catalítico reativas de oxigênio (ROS) eliminação de capacidade1,2,3. Nanoceria ter ROS eliminação habilidades devido a um grande número de vagas de superfície oxigênio que alternam entre dois oxidação Estados (Ce3 + e4 +Ce) 4,5,6. Os Ce3 + oscilação títulos efetivamente eliminar ROS enquanto ....
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Protocolo
1. cultivo de plantas da . thaliana
- A. thaliana semear em potes descartáveis 5 cm x 5 cm, preenchidos com mistura de solo padrão. Colocar 32 destes vasos em uma bandeja de plástico cheia de água (~ 0,5 cm de profundidade) e transferir a bandeja plástica com as plantas em uma câmara de crescimento de planta.
- Definir o crescimento câmara configurações como segue: 200 µmol/ms fotossinteticamente ativa radiação (PAR), 24 ± 1 ° C de dia e 21 ± 1 ° C à noite, 60% de umidade e regime de luz de dia/noite h 14/10, respectivamente.
- Diluir cada pote para deixar apenas uma planta individual após uma semana de germinação. ....
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Resultados
Caracterização e síntese PNC .
PNC foram sintetizados, purificada e caracterizada a seguir o método descrito na seção de protocolo 2. Figura 1 A mostra a coloração das soluções de nitrato de cério, PAA, a mistura de nitrato de cério e PAA e PNC. Uma mudança de cor do branco para amarelo claro é vista depois de PNC é sintetizado. Após a purificação com um filtro de 10 kDa, PNC foram caracterizados .......
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Discussão
Neste protocolo, descrevemos PNC síntese, caracterização, tintura fluorescente rotulagem e imagem latente confocal das nanopartículas dentro de células do mesofilo de vegetais para expor seu na vivo ROS eliminação atividade. PNC são sintetizados a partir de uma mistura de PAA solução de hidróxido de amónio e nitrato de cério. PNC caracterizam-se por spectrophotomery de absorção e a concentração de determinada usando a lei da cerveja-Lambert. Medições de potencial zeta confirmaram a superfície carregada negativam.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Riverside e USDA National Institute of Food e agricultura, projeto Hatch 1009710 para J.P.G. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. 1817363 de J.P.G.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nitrato de cério (III) hexahidratado | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Grau de Biologia Molecular Água, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 50 mL | VWR | 14-959-49A | |
| Poli (ácido acrílico) 1.800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Misturador de Vórtice Digital Fisherbrand Fisher | Scientific | 02-215-370 | |
| Acessório de Misturador de Vórtice Digital Fisherbrand, Retentor de Inserção | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Acessórios para Misturador Digital Vortex da Fisherbrand: Conjunto de Inserção de Espuma | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Solução de hidróxido de amônio | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduado, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrífuga 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Unidades de Filtro Centrífugo | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Centrífuga | de Bancada Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Filtro de seringa Whatman Anotop 10 | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD com pontas Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimetilsulfóxido, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titulação | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Seringa Air-Tite All-Plastic Norm-Ject | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Limpeza de Tarefas Delicadas | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning lâminas de microscópio, fosco de um lado, uma extremidade | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Broca de Cortiça Conjuntos com Alças | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Quadrado, Nº 1 | VWR | 48366-045 | |
| Microscópio Confocal de Varredura a Laser Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Diacetato de diclorofluorescina | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihidroetídio | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Medidor de clorofila | Konica Minolta | SPAD-502 |
Referências
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15(2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S.
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Reimpressões e permissões
