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Artigo de método

Um modelo de Mouse hiperandrogénicas para estudar a síndrome do ovário policístico

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DOI:

10.3791/58379

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2 de outubro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Descrevemos o desenvolvimento de um modelo de mouse SOP, como magro com diidrotestosterona pelota para estudar a fisiopatologia da síndrome do ovário Policístico e a prole dessas barragens, como síndrome do ovário Policístico.

Resumo

Hyperandrogenemia desempenha um papel crítico na função reprodutiva e metabólica em mulheres e é a marca da síndrome do ovário policístico. Desenvolvimento de um modelo de rato de SOP, como magro que imita as mulheres com SOP é clinicamente significativa. Neste protocolo, descrevemos um modelo deste tipo. Inserindo um comprimento de 4 mm de pelota de pó de cristal DHT (dihidrotestosterona) (comprimento total da pelota é 8 mm), e substituí-lo mensalmente, somos capazes de produzir um modelo do rato de SOP, como com dobra de soro níveis 2 DHT mais elevado do que os ratos não implantados com DHT (n-DHT). Observamos uma disfunção metabólica e reprodutiva sem alterar o peso corporal e composição corporal. Enquanto exibindo um elevado grau de infertilidade, um pequeno subconjunto destes ratos fêmeas de SOP, como posso engravidar e sua prole puberdade atrasada e testosterona aumentada de adultos. Este modelo de rato magra como SOP é uma ferramenta útil para estudar a fisiopatologia da síndrome do ovário Policístico e a prole dessas barragens, como síndrome do ovário Policístico.

Introdução

Hiperandrogenismo é a marca da síndrome do ovário policístico (SOP) de acordo com os critérios do NIH e do excesso de andrógenos e síndrome do ovário Policístico (SOP-AE) da sociedade. Mulheres com SOP têm dificuldade em engravidar e tem aumentado o risco de complicações de gravidez1. Mesmo se elas engravidam, sua prole feminina tem um resultados de saúde adversos2,3. Modelos animais foram desenvolvidos utilizando várias estratégias4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e exibindo muitas características da síndrome do ovário Policístico (anovulação, e ou tolerância deficiente de glicose e insulina) com aumento de peso e obesidade associada com hiperplasia dos adipócitos de tamanho e peso do aumento dos adipócitos. Existem duas estratégias principais para produzir modelos animais que são usados para estudar a síndrome do ovário Policístico. Um é o tratamento com níveis elevados de andrógenos diretamente (injeção/inserção de andrógenos exógenos) ou indiretamente (por exemplo, bloqueando a conversão de andrógeno em estrógeno com inibidor de aromatase) após nascimento13. Outra é por hyperexposure fetal de andrógenos durante gestação14,15 estudar a prole. Por exemplo, a prole fêmea de macaco rhesus16,17, ovelha18e roedores expostos a níveis masculinos de andrógeno durante o período intra-uterino desenvolve traços de SOP, como mais tarde na vida. Estes modelos aprimorado significativamente nossa compreensão de efeitos de andrógeno elevado, programação fetal e uterinos efeitos ambientais. No entanto, estes modelos têm suas próprias limitações: 1) animais desenvolvem obesidade e, por conseguinte, é difícil separar os efeitos da hyperandrogenemia de obesidade induzida reprodutivos e disfunções metabólicas; 2) antes da gravidez, as mulheres com SOP já apresentam níveis elevados de andrógenos, assim oócitos foram expostos a andrógeno em excesso antes de fertilização; 3) as doses farmacológicas de testosterona (T) ou dihidrotestosterona (DHT) usado após o nascimento ou durante a gestação podem não refletir o ambiente de andrógeno de SOP. Foram medidos os níveis de testosterona e DHT no fluido folicular ovariano e/ou soro, e a testosterona e os níveis DHT são 1.5 para 3,9 vezes maior em mulheres com SOP5,19,20,21 ,22,23 , quando comparadas com mulheres não afetadas. Criamos um rato adulto modelo23,24,25 que desenvolve disfunção metabólica e reprodutiva dentro de duas semanas a contar do início da exposição crônica de DHT de inserção de um pellet com 4 mm de comprimento de pó de cristal DHT (comprimento total da pelota é 8mm). Este modelo produz níveis séricos DHT que são cerca de 2 dobras superior (designado 2xDHT) do que o de ratos controle sem tratamento de DHT. Os ratos 2xDHT não apresentam alterações de estradiol basal soro, testosterona, LH e não desenvolver obesidade e mostrar o peso ovariano semelhante, os níveis séricos de colesterol, ácidos graxos livres, leptina, TNFa e IL-623,24, 25 , relativo a controla mesmo até 3,5 meses após a inserção de DHT23,24,25. Além disso, pelo acasalamento de fêmeas que já desenvolveram características da síndrome do ovário Policístico, podemos estudar o impacto de um ambiente de hiperandrogénicas materna sobre a saúde reprodutiva e metabólico da prole15.

Neste novo paradigma (relevante para os critérios NIH e sociedade AE-SOP) modela a doença através da produção relativamente semelhantes níveis de andrógenos para aqueles das mulheres com SOP 2 - a 3 vezes mais testosterona ou níveis DHT, quando comparados com mulheres não afetadas. No entanto, este modelo é mantido por DHT exógena contínua e não de hiperandrogenismo endógeno programado uma vez DHT é retirado. O objetivo geral deste artigo é se concentrar em 1) como fazer a pelota DHT; 2) como gerar um SOP-incline-se como um modelo do rato; 3) estratégias para avaliar a prole fêmea dessas barragens. Outras medições e avaliação dos fenótipos não são abordados neste manuscrito, mas podem ser encontradas em5,15,23,24,25,26.

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Protocolo

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para inserção e preparação de sedimento DHT e para testes metabólicos e reprodutivos. Os ratos utilizados neste estudo foram um fundo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e foram mantidos com comida e água ad libitum em um ciclo de luz/escuridão h 14/10 a 24 ° C na instalação de animal Broadway edifício de investigação para o Johns Hopkins University School of Medicina. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal do Johns Hopkins University.

1. criar o modelo de SOP, como Mouse

  1. Preparação de pelota DHT
    1. Tubulação de silastic autoclave para esterilizar. Corta tubos de silastic para um comprimento de 15 mm com uma lâmina de barbear;
    2. Sele um lado injetando silicone adesivo médico dentro do tubo com uma agulha cega de 20g, ligada a uma seringa de 3 mL. Êmbolo deve ser retirado a seringa e, em seguida, adesivo inserida no reservatório. O êmbolo é reinserido e adesivo empurrado para baixo, até que começa a emergir da agulha. A agulha cega é feita por um corte do lado da ponta afiada da agulha 20g com qualquer tesoura forte. O comprimento de silício no tubo deve ser superior a 2 mm para permitir a filtragem de pós-produção;
    3. Secar durante a noite; Verifique se há bolhas de ar no lado selado. Aqueles com nenhuma bolha de ar são utilizados para pelotas DHT. Outras podem ser usadas para pelotas de controle não-DHT.
    4. Use luvas, máscara, óculos e jaleco antes de fazer a DHT-sedimento em uma capa para evitar a exposição DHT para a pele.
    5. Pó DHT despeje em um plástico peso barco e pressione o lado aberto do adesivo tampado tubos (produzidos na 1.1) em pó a DHT.
    6. Pó DHT pode ser tamped para baixo com um clipe de papel grande que é alisado.  Continue até DHT atinge uma altura de 4 mm (ou comprimento desejado). Verificar o comprimento do DHT com uma régua e selar o lado aberto com silício, seco durante a noite.
    7. Corte cada lado selado para fazer o comprimento de silicone de 2 mm de comprimento. O comprimento total do pellet será de 8 mm.
    8. Selo de ambos os lados do tubo silastic vazio como pelota de controle (não-DHT).
    9. Manter pelotas em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado com papel alumínio (para evitar a exposição à luz) em temperatura ambiente até o uso. As pelotas DHT mantenham plena eficácia pelo menos 3 meses de armazenagem.
  2. Substituição e inserção de DHT
    1. Até 20 DHT pelotas ou pelotas de controle estão submergidas separadamente em um tubo cónico de 50 mL com 30 mL 0,9% soro fisiológico estéril por 24 h a 37 °C para equilibrio apenas antes da inserção.
    2. Antes da cirurgia, as superfícies e luvas são desinfetadas com clidox e as superfícies de trabalho são cobertas com papel absorvente apoiado plástico limpo (bloco cirúrgico).  Todos os instrumentos que entram em contacto com animais são descontaminados antes de entrar a facilidade animal em autoclave.  Instrumentos poderão seco e fresco antes da utilização.
    3. ratos fêmeas de 2 meses de idade são utilizados (4 – 5 ratos/gaiola). Os ratos são injectados intraperitonealmente com xilazina (3,5 mg/kg bw) e cetamina (78,8 mg/kg bw) utilizando uma seringa de insulina. Cálculos para mistura e dosagem de anestesia está na tabela 1.
    4. Após anestesia adequada é alcançada, como medido pela perda do reflexo de dedo do pé e retardou a respiração, o mouse vai ser preparado para a cirurgia.
    5. Desinfectar a pele da área com betadine usando gaze esterilizada e limpar com álcool 70%.  A área será pintada novamente com betadine.
    6. Corte um buraco de cerca de 5 mm comprimento com tesoura debaixo da pele perto do pescoço. Usando um bisturi 10 G, faça um pequeno túnel (15 mm) na direção rostral. A pelota é inserida dorsalmente com o bisturi.
    7. A abertura é então selada com adesivo cirúrgico. Manualmente aproximada a ferida bordas com fórceps e traços de escovagem suaves para aplicar uma fina camada de adesivo líquido para as bordas da ferida aproximadas. Camadas finas de acúmulo 3 de adesivo para garantir que o adesivo é uniformemente distribuído sobre a ferida. O adesivo deve estender a 1 cm de cada lado das bordas da ferida aposto. Suturas ou grampos cirúrgicos também podem ser usados para fechar o buraco. Colocar ratos de volta na gaiola, alojada individualmente, com uma almofada de calor para a recuperação. Substitua a pelota em 4 semanas para manter um nível constante de exposição de andrógeno. A pelota original será removida e sedimento novo será inserido conforme descrito em A1.15 na posição semelhante.
    8. Testar o simbolo estral após 3 dias de inserção de DHT. Fase do ciclo estral é avaliada pela citologia vaginal.  Células vaginais são coletadas por 16 dias consecutivos usando uma pipeta p10 esguinchar solução salina estéril (cerca de 10 µ l) na cavidade vaginal e depois retirar o soro fisiológico com a ponta da pipeta estéril mesmo.  Células vaginais sobram da parede vaginal misturam com soro fisiológico e são coletadas.
    9. Espalhe a solução salina com células numa lâmina rotulada. Cada slide pode conter seis amostras. Slides são etiquetados para indicar qual amostra é colocada em cada um dos seis locais.
    10. Após o soro fisiológico completamente secou no slide, colocar slides em um recipiente com 100% de etanol para consertar as células. Slides devem ser fixados para pelo menos 5 min, mas podem permanecer no fixador indefinidamente até utilização posterior.
    11. Coloque slides em soluções de coloração para 1 min para tampão B e slides C. Wash com água da torneira e seco à temperatura ambiente.
    12. Examine a morfologia celular sob um microscópio de luz objetiva de 10 X.  Morfologia da célula para distinguir (P) de proestro, estro (E), metestrus (M) e diestro (D) é descrita em referências de28,de27,29.
    13. Contagem dos dias em cada fase e dividido pelo número total de dias para calcular o tempo por cento em cada estágio.
    14. Teste tolerância à glicose em 21 dias após a inserção de DHT pelo jejum os ratos durante a noite (16 h) e injeção de 2 g/kg de peso corporal de 20% dextrose intraperitonealmente. Por exemplo, se um peso de corpo do rato é 25g, este rato será injetado com 250 µ l de dextrose 20% com uma seringa de insulina 50 cc (0,5 mL). Níveis de glicose são avaliados pelas tiras de glicosímetro e teste por amostragem de sangue da veia da cauda em 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Isto é descrito em detalhe em outro lugar30.
  3. Coleta de sangue
    1. Colher o sangue em vários dias após a inserção de DHT (limitar volume de coleção para 100 µ l de esteroide e 30ul para ensaio de LH/FSH) entre 9 e 10:00 por submandibular veia sangrando com lanceta. Isto é descrito em11.
    2. Centrifugar o sangue a 6.000 x g a 4 ˚C por 10 min e recolher a camada de soro em outro tubo de 1,5 mL que pode ser armazenado a-80 °C até ensaio.

2. avaliar reprodutiva perfis da prole feminina de DHT cronicamente inserido barragens

  1. Acasalamento
    1. O rato fêmea a ser testado é movido para a gaiola com um macho fértil comprovada (que anteriormente teve filhotes com um rato fêmea) 15 dias após a inserção da pelota.
    2. Documente o peso do corpo da barragem toda semana para determinar se o mouse está grávido. Barragem de aumentos de peso de mais de 3 g em uma semana indica gravidez.
    3. Colete sangue de barragens na segunda semana depois observamos aumento de peso de barragens superior a 3 g na semana anterior.
  2. Puberdade, avaliada pela abertura vaginal e do primeiro estro
    1. Verificar a abertura vaginal por inspeção visual todos os dias depois que filhotes são desmamados em 21 dias pós-parto (PND), medir a distância anogenital e gravar a idade da abertura vaginal.
    2. Uma vez que a vagina se abre, colete células vaginais diariamente, conforme descrito em 1.2.8–1.2.11 para verificar o simbolo estral.
    3. Observar a morfologia celular como 1.2.12 descrito, e o primeiro estro é definido como a data que todas as células são células epiteliais cornificadas.
  3. Corpo peso e orelha punch
    1. Mergulhe a ponta da lanceta na pasta de tatuagem e marcar cada filhote com tatuagem no dedo, conforme descrito na referência12 no PND 7 e pesar ratos a cada 7 dias até 70 dias de idade.
    2. Ratos de soco de orelha para numerá-los usando o sistema na Figura 1 entre 12 a 16 PND. Para distinguir o sexo, examine o lado ventral do corpo, as fêmeas terá mamilos visíveis.
    3. Coletar o sangue no 21, 26, 70 PND após o nascimento, conforme descrito acima no 1.3.1
  4. Ensaio hormonal
    1. Os níveis DHT no soro sanguíneo são medidos por ambos os ensaio imunoenzimático (ELISA) e pelo conjunto de cromatografia líquida de massa espectrometria (LC-MS)23,24,31,32. T é medido por LC-MS, ou um rato/mouse ELISA validado pelo Universidade de Virgínia ligante ensaio núcleo no centro de pesquisa em reprodução23,24.

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Resultados

Os níveis DHT de soro e teste de tolerância à glicose

Os níveis DHT foram medidos de soro coletado por ambos ELISA e por LC-MS de acordo com o protocolo 1.24 – 1,25 e 2.9, 3.0. Os valores absolutos DHT são diferentes entre a espectrometria de massa e ELISA, no entanto, a dobra relativa (cerca 2 vezes) de DHT vs inserção n-DHT é semelhante de ambos os ensaios e através dos experimentos de15,

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Discussão

Hiperandrogenismo é uma característica fundamental da síndrome do ovário Policístico. A DHT sérica (duas vezes mais alto nos ratos DHT do que nos ratos não-DHT) usada neste protocolo é inferiores aos relatados por outros pesquisadores em estudos anteriores e é calibradas para imitar proporcionalmente as mulheres com SOP5,19, 20,21. Ao contrário de outros modelos, este modelo DHT 2 vezes não al...

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Divulgações

Nada de divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R00-HD068130 subsídios para S.W.) e o centro de pesquisas de Diabetes de Baltimore: pilotos e viabilidade Grant (S.W.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pó cristalino 5α-DHTSigma-AldrichA8380-1G
Dow Corning Tubulação SilasticFisher Scientific11-189-15D0,04 pol / 1 mm de diâmetro interno x0,085 pol / 2,15 mm de diâmetro externo
silicone adesivo médicoII, InC.A-100
Óculos, jalecos, luvas e máscaras.
10 µ L pontas de pipeta sem filtroUSA Scientific11113700
lâmina de microscópio para esfregaçoFisher Scientific12-550-003
Diff Quik para coloração de célulasFisher ScientificNC9979740
LancetFisher ScientificNC9416572
Seringa de 3 mLBecton, Dickinson and Company (BD),30985
agulha anexada: 20 GBD305176
Régua: qualquer comprimento que 10 cm com escala milimétrica.
XylazineVet one AnnSeA LA, MWI, BoiseNDC13985-704-10100 mg/mL
Cloridrato de CetaminaHospira, IncNDC 0409-2051-05100 mg/mL
Grampo cirúrgicoAutoClip® Sistema, Fine Science Tool12020-00
Seringa de insulinaBD3294611/2 CC, seringa de insulina U-100 de baixa dose
TrocarteInnovative Research of AmericaMP-182
MicroscópioCarl Zeiss Primo Star415500-0010-001Alemanha
Perfurador de orelhaFisher Scientific13-812-201
Testosterona rato/camundongo ELISA kitIBLB79174
DHT ELISA kitAlpha Diagnostic International1940
One touch ultra glicosímetroLife Scan, Inc.
Listras de teste ultra de um toqueLife Scan, Inc.
Tubo EppendorfFisher Scientific05-402-18
Lâmina de barbearFisher Scientific12-640
ClidoxFisher ScientificNC0089321
resguardo cirúrgicoFisher Scientific50587953Fabricante: Andwin Scientific 56616018
Solução Antisséptica BetadineWalgreens
3M Vetbond (n-butilcianoacrilato)Ciência 3M. Aplicado à Vida
Fator de

Referências

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