Artigo de método

Um modelo de romance In Vitro de explosão traumatismo crânio-encefálico

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DOI:

10.3791/58400

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21 de dezembro de 2018

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1Anaesthetics, Pain Medicine and Intensive Care Section, Department of Surgery and Cancer, Imperial College London, 2Royal British Legion Centre for Blast Injury Studies, Department of Bioengineering, Imperial College London, 3Department of Bioengineering, Imperial College London, 4Department of Life Sciences, Imperial College London, 5Department of Anaesthetics, Royal Berkshire Hospital NHS Foundation Trust, 6Royal Centre for Defence Medicine, Medical Directorate Joint Force Command

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um novo modelo de traumatismo crânio-encefálico explosão primária. Um tubo de choque conduzido de ar comprimido é usado para expor em vitro culturas hippocampal fatia de rato a uma única onda de choque. Este é um protocolo simples e rápido, gerando uma lesão de tecidos do cérebro podem ser reproduzidos com um alto throughput.

Resumo

Lesão cerebral traumática é das principais causas de morte e de invalidez em populações civis e militares. Resultados de lesão cerebral traumática explosão de detonação de explosivos, no entanto, os mecanismos que fundamentam o dano cerebral resultante da exposição de sobrepressão de explosão não são totalmente compreendidos e são acreditados para ser exclusivo para este tipo de lesão cerebral. Modelos pré-clínicos são ferramentas cruciais que contribuem para entender melhor a lesão cerebral induzida por explosão. Foi desenvolvido um modelo TBI romance em vitro explosão usando um tubo de choque em aberto para simular ondas de explosão de campo aberto de vida real, modeladas pela forma de onda de Friedlander. Culturas de fatias hippocampal do rato C57Bl/6N organotypic foram expostas a ondas de choque única e o desenvolvimento de lesões caracterizou-se até 72 h usar iodeto de propidium, um marcador fluorescente bem estabelecido de danos celulares que somente penetra as células com comprometida com membranas celulares. Fluorescência de iodeto de propidium foi significativamente maior nas fatias expostas a uma onda de choque quando comparado com fatias de Souza durante toda a duração do protocolo. A lesão do tecido cerebral é muito reprodutíveis e proporcional a sobrepressão de pico da onda de choque aplicada.

Introdução

Explosão traumatismo cranioencefálico (TCE) é um tipo complexo de lesão cerebral que resulta da detonação de explosivos,1,2. Explosão TBI tem emergido como um importante problema de saúde nos últimos 15 anos com os recentes conflitos militares no Iraque e Afeganistão2,3. No geral, estima-se que entre 4,4% e 22,8% dos soldados que voltam do Iraque e Afeganistão sofreram TCE leve, uma grande proporção destes sendo relacionado a explosão, com uma maior taxa relatada de explosão TBI nas forças dos EUA em comparação com as forças britânicas4 ,5.

O uso de dispositivos explosivos improvisados tem sido responsável pela maioria do trauma associado a explosão, incluindo a explosão TBI, suportado por forças militares6. A detonação de uma carga explosiva que resulta em um muito rápida — mas transitória — aumento da pressão, ocorrendo em milissegundos. A onda de sobrepressão resultante de uma explosão de campo livre de vida real é modelada pela função Friedlander, com um aumento súbito da sobrepressão de pico seguido de um decaimento exponencial7,8. A gama de forças extremas e seu curso rápido tempo visto em um evento de explosão não geralmente são experientes em traumas não-explosão1,9. A sobrepressão de pico, que é a pressão máxima da forma de onda e a duração da onda positiva são acreditados para ser importantes contribuintes para a lesão cerebral de explosão e estas dependem da carga explosiva e a distância entre a detonação10, 11.

O trauma que os resultados de uma explosão explosiva é classificado como quatro componentes discretos, designados como primário, secundário, terciário e quaternário explosão lesão10,12,13,14. Cada um desses componentes está associado com mecanismos específicos de lesão. Lesão de impacto resulta da ação direta da onda de sobrepressão em órgãos e tecidos de2,13. Resultados de lesão de explosão secundária do impacto dos fragmentos do projétil, causando penetrante e não-penetrante feridas2,15. Lesão terciária explosão ocorre quando o corpo da vítima é deslocado contra o solo ou objetos circundantes e está associado a forças de aceleração/desaceleração1,10,13. Lesão de explosão quaternária descreve um grupo heterogêneo de lesões relacionadas diretamente à explosão não abrangidos pela primeira três lesão mecanismos descritos12,13. Isso inclui (mas não limitado a) lesões térmicas, inalação de fumaça, radiação, ondas eletromagnéticas e efeitos psicológicos adversos13,15. Mais TBI associada a explosão resultante diretamente os três primeiros mecanismos de lesão, enquanto os quaternários mecanismos de lesão de explosão são normalmente associados com lesões sistêmicas13. Os efeitos das forças de aceleração/desaceleração (por exemplo, whiplash), sem corte e penetrante traumatismo crânio-encefálico têm sido muito estudados em relação a outros tipos de TCE (por exemplo, acidentes de automóvel, quedas, ferimentos balísticos). No entanto, a onda de sobrepressão de explosão primária é exclusiva para lesão de explosão e seus efeitos no tecido cerebral são muito menos bem compreendido16. Os mecanismos de lesão de impacto, associados a uma onda de sobrepressão, são a primeira das forças mecânicas para interagir com o cérebro.

Numerosos modelos TBI pré-clínicos foram desenvolvidos nas últimas décadas que tem sido inestimável para entender explosão TBI mecanismos de lesão e fisiopatologia e investigar potenciais novos tratamentos, que caso contrário seria impossíveis fazer exclusivamente na clínica a definição17,18,19. Embora nenhum único modelo pré-clínico pode reproduzir a complexidade de um trauma cerebral clínico explosão, normalmente, diferentes modelos pré-clínicos de TBI replicam aspectos distintos do humano TBI. A ação prejudicial das forças associadas com uma explosão de explosão pode ser estudada de forma isolada ou em combinação em modelos TBI explosão tanto in vitro e in vivo . In vitro os modelos têm a vantagem de permitir um controlo apertado do ambiente experimental (tecido condições fisiológica e biomecânica da lesão), que reduz a variabilidade biológica e melhora a reprodutibilidade, permitindo o estudo de molecular específico cascatas sem os confundidores presentes no animal modelos20. Nosso objetivo foi desenvolver um modelo in vitro para investigar os efeitos de impacto no tecido cerebral. Visamos desenvolver um modelo com uma onda de choque supersônica, com um representante de forma de onda de Friedlander de uma explosão de campo livre como a produzida por um dispositivo explosivo improvisado (IED).

Protocolo

Os experimentos descritos neste manuscrito foram feitos em conformidade com o Reino Unido animais (procedimentos científicos) Act de 1986 e tenham sido aprovados pelo Animal Welfare & ética revisão corpo do Imperial College de Londres. Cuidados com animais foi em conformidade com as diretrizes institucionais do Imperial College de Londres.

1. cultura e preparação hippocampal Organotypic fatia

Nota: Este protocolo permite a produção de fatias hippocampal organotypic de acordo com o método de interface descrita por Stoppini e colegas com pequenas modificações21,22,23. Idealmente, não mais que três animais devem ser sacrificados e dissecados em uma sessão para garantir que cada passo é feito rapidamente e para evitar comprometer a qualidade das fatias. Utilize técnica asséptica ao longo.

  1. Garantir que as seguintes etapas sejam tomadas antes de iniciar o protocolo de dissecação.
    1. Preparar e filtro esterilizar todas as soluções com antecedência, usando um filtro de 0,22 µm.
    2. As soluções a 4 ° C, durante o armazenamento e ao longo da dissecação cerebral e preparação de fatias hippocampal mantendo os recipientes de armazenamento e placas de Petri sobre um metal do dissipador de calor continuar sentada no gelo molhado em todos os momentos.
    3. Autoclave todos de metal instrumentos, anéis e tecidos de papel.
    4. Certifique-se de todos os instrumentos e materiais a serem utilizados para cada etapa do protocolo estão prontos para usar, estabelecidos com antecedência e pulverizado com etanol a 70%. Certifique-se de que eles têm permissão para esfriar e secar.
  2. Eutanásia em um dia de 5-7-velho C57BL/6N filhote de rato por deslocamento cervical e brevemente, limpe a superfície de pele inteira com tecido de papel estéril embebido em etanol 70%. Pat a pele seca e decapitar o filhote usando uma tesoura de Mayo.
  3. Cortar a pele do couro cabeludo com uma tesoura de íris ao longo da linha mediana da cabeça começando na região occipital e acabar perto do focinho e recolhê-la lateralmente.
  4. Inserir a ponta da Tesoura Vannas no foramen magnum e faça dois pequenos cortes laterais no osso ao longo dos seios transversais, em seguida, cortar o crânio ao longo da linha mediana até o bulbo olfativo e faça dois pequenos cortes perpendicularmente à sua mediana nesta região.
  5. Usando bem aponte Pinca curvada, retrair as abas de osso lateralmente longe da linha mediana, cuidadosamente remova o cérebro com uma espátula pequena e transferi-lo para uma 90mm do silicone revestido de elastômero de Petri contendo "meio de dissecação".
    Nota: O meio de dissecação é que gey balanceamento de solução salina (5 mg/mL, D-glicose, solução antimicótico antibiótico 1%, com 10.000 unidades/mL penicilina, a estreptomicina 10 mg/mL e a anfotericina B de 25 µ g/mL).
  6. Remover o cerebelo e separar os hemisférios cerebrais ao longo da linha mediana usando uma lâmina de barbear. Use uma espátula para transferir os hemisférios cerebrais de um novo silicone de 90mm elastómero revestida de Petri cheia de meio fresco dissecação gelada. Se mais de um animal é para ser usado em uma sessão, repita os passos 1,2 – 1,6.
  7. Sob um estereomicroscópio, cortar o bulbo olfativo e a ponta do córtex frontal com uma lâmina de barbear e separar o córtex cerebral do resto do tecido cerebral usando pinças de ponta fina. Esta etapa deixa o hipocampo exposto na superfície medial do tecido cortical. Desta etapa em diante, use um capuz de cultura de tecidos de fluxo laminar (ultravioleta esterilizados e limpos com solução de etanol a 70%).
  8. Aplique meio de dissecação gelada para um disco de corte plana de plástico e, usando uma espátula, posicione o tecido cerebral no disco tal que a superfície medial do córtex é voltada para cima e o eixo do hipocampo é perpendicular ao eixo da lâmina picar.
  9. Remova o máximo possível do meio de dissecação do desbastamento disco usando uma pipeta Pasteur de ponta fina.
  10. Cortar o cérebro em 400 µm fatias usando um helicóptero de tecido a uma velocidade de corte de 50% e força.
    Nota: É muito importante que esta etapa é feita tão rapidamente quanto possível, o tecido cerebral não é submersa em meio de dissecação.
  11. Substitua o meio de dissecação em de Petri revestida de elastômero de silicone com meio gelado fresco.
  12. Uma vez terminado, o helicóptero de tecido cuidadosamente mergulhe o tecido cerebral em meio fresco dissecação e transferir o tecido cortado para a de 90 mm do silicone revestido de elastômero Petri usando um bisturi de lâmina reta.
  13. Sob um estereomicroscópio, separe com cuidado as fatias corticais utilizando pinças de ponta fina. Para cada fatia, inspecione o hipocampo para morfologia e potencial dano tecidual resultante a dissecação ou corte.
  14. Separe o hipocampo do córtex entorhinal e da fímbria usando pinças de ponta fina e pequena Tesoura Vannas. Normalmente, cerca de 6 a 8 fatias hippocampal são geradas por hemisfério.
  15. Transferir até 6 fatias hippocampal para uma inserção de cultura de tecidos utilizando um corte pipeta Pasteur e lugar dentro um 35mm Petri dish. Certifique-se de que as fatias são espalhadas alguns milímetros de distância (isto irá assegurar que cada fatia pode ser fotografada individualmente).
  16. Imediatamente adicione gelada "crescimento médio" para o fundo de cada prato de Petri, em inserir a cultura de tecidos, apenas abaixo do topo da cultura tecido inserir borda.
    Nota: O meio de crescimento contém 50% mínima essencial média águia, 25% Hanks equilibrada solução de sal, 25% de soro de cavalo, 5 mg/mL, D-glicose, 2 mmol/L, L-glutamina, antibiótico antimicótico solução a 1% e 10 mmol/L HEPES, titulado pH 7.2 com hidróxido de sódio.
  17. Altere o meio de crescimento o dia após a dissecação e então a cada 2 a 3 dias depois disso (uso crescimento médio a 37 ° C). Certifique-se de que o meio de crescimento é adicionado em quantidade suficiente, mas não tanto que ele transborda sobre a membrana de inserção de cultura de tecidos, que poderia comprometer a viabilidade das fatias de tecido.
  18. Manter as fatias de tecido em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono no ar por 12 a 14 dias antes de serem utilizados em experimentos.

2. preparação das fatias Hippocampal Organotypic para o protocolo TBI explosão Experimental

Nota: Todas as etapas desta seção, exceto a imagem latente, realizam-se em uma capa de cultura de tecidos de fluxo laminar.

  1. Inserir os anéis de aço inoxidável sob medidos em um prato bem 6 (uma por bem).
    Notas: Os anéis têm um aro com um entalhe (que deve sentar-se na posição 12:00) e caber confortavelmente dentro dos poços, enquanto a cultura de tecido insere facilmente encaixa este aro. Certifique-se que os anéis são lavados com um desinfetante bactericido, completamente enxaguados com água filtrada, esterilizada e permitidos refrigerar para baixo com antecedência.
  2. Encher o poço da placa de 6-poços com pré-aquecido (37 ° C) isento de soro «suporte experimental» com iodeto de propidium.
    Nota: É meio Experimental com iodeto de propidium: 75% mínima essencial média águia, 25% Hanks equilibrada solução de sal, 5 mg/mL, D-glicose, 2 mmol/L L-glutamina, antibiótico antimicótico solução a 1%, 10 mmol/L HEPES e iodeto de propidium 4.5 µmol/L, pH titulada a 7.2 com hidróxido de sódio.
  3. Certifique-se de que o nível do meio não chega acima a ranhura do anel. Transferi a placa de 6 com os anéis de volta para a incubadora para 1h garantir que o meio é a 37 ° C, imediatamente antes das inserções de cultura de tecidos são transferidas.
  4. Transferi as inserções de cultura de tecidos com as fatias de organotypic desde os pratos de Petri 35mm para a placa de 6 com os anéis e médio experimental com fórceps.
  5. Fazer um ponto sobre a borda de inserção na posição 03:00 com uma caneta de tinta permanente.
    Nota: As inserções vão ser retirados da placa de 6 durante o experimento e este passo facilita retornando a inserção à posição original depois de exposição a ondas de choque e de facilmente acompanhar cada fatia em todo o protocolo.
  6. Rotular cada placa de 6 com um nome exclusivo & data e fazer um mapa de poços de cada placa, nomeando cada poço (EG., A, B, C, etc.) e cada fatia em cada poço (EG., 1, 2, 3, etc.), de modo que cada fatia tem um identificador exclusivo ( por exemplo., A1, A2, A3, etc.).
  7. Transferi a placa de 6 para a incubadora para 1 h assegurar que as fatias são a 37 ° C, imediatamente antes de imagem.
    Nota: Evitar excesso de médio ou quaisquer bolhas de ar por baixo a cultura de tecido inserir membrana, que pode comprometer a viabilidade das fatias.
  8. 1 h após a transferência para meio experimental, imagem cada fatia individualmente, usando um microscópio de fluorescência (2 X objectivo at 0,06) equipado com um filtro de emissão (LP 610 nm) e excitação adequada (BP 535/50 nm) para avaliar a saúde de fatia antes da lesão protocolo é realizado.
    Notas: As frações que apresentam áreas de densa vermelho mancha nesta fase devem ser consideradas para apresentar viabilidade comprometida e devem ser excluídas da análise adicional (geralmente representam menos de 10% do número total de fatias gerado). Certifique-se de que a imagem é executada de forma sequencial e tão rapidamente quanto possível para minimizar o tempo que as fatias são fora da incubadora (geralmente 6 poços devem levar apenas abaixo dos 30 min imagem).
  9. Manter a tampa da placa de 6-poços todos os momentos. Alguma condensação pode acumular-se no interior da tampa. Se isso acontecer, brevemente, use um secador de cabelo sobre a configuração baixa.
  10. Certifique-se de que todas as condições de imagem são idênticas em dias diferentes e entre as experiências.
    Nota: O objetivo da imagem é quantificar a fluorescência de tecido, portanto, esta etapa é importante para garantir a reprodutibilidade dos resultados e permitir a comparação dos dados obtidos.

3. submersão e transporte de cultura de tecido insere-se com as fatias Hippocampal Organotypic

  1. Imediatamente após a imagem, em uma capa de fluxo laminar, tome uma inserção de cultura de tecido fora a placa de 6 usando o fórceps.
  2. Cuidadosamente a transferência a inserção de um saco de polietileno estéril (3 "x 5") pré-preenchido com 20 mL de meio experimental quente (37 ° C) recém borbulhava com 95% oxigênio e 5% de dióxido de carbono.
    Nota: Certifique-se de que o oxigênio e dióxido de carbono enriquecido meio experimental era borbulhava pelo menos 40 min com 95% oxigênio e 5% de dióxido de carbono usando um borbulhador de scintered de vidro dentro de uma garrafa de Dreschel e transferido para os sacos de polietileno estéril dentro um fluxo laminar capô de cultura de tecidos utilizando uma seringa de 20 mL com um filtro bacteriano e um tubo de enchimento estéril (127 mm) anexado. Selar os sacos imediatamente e transferi-los para uma incubadora de 37 ° C pelo menos 1h antes da cultura de tecidos inserir a transferência.
  3. Certifique-se de que cada saco estéril seja rotulado corretamente (com a placa e a identificação do bem). Repita esta etapa para cada inserção de cultura de tecidos. Exclua as bolhas de ar cuidadosamente em cima selagem sacos estéreis (feitos firmemente torcendo a parte superior dos sacos e aplicando-se uma pinça de plástico).
  4. Retorne os sacos estéreis com as inserções de cultura de tecidos e placas com meio experimental 6-poços em incubadora a 37 ° C.
  5. Depois de 1 h, cuidadosamente malas a estéril com as inserções de cultura de tecido em caixas de plástico dentro de uma caixa de thermo-regulado, preenchido com água deionizada a 37 ° C a fim de manter as fatias de organotypic a temperatura fisiológica durante a exposição de ondas de choque protocolo.

4. preparação do tubo de choque e exposição de ondas de choque Hippocampal Organotypic fatia

  1. Use botas de biqueira de aço de proteção, luvas e um casaco de laboratório durante a preparação do tubo de choque e de exposição a ondas de choque.
  2. Parafuso o chassis de suporte do saco estéril para o flange distal tubo de choque, garantindo que o furo central está alinhado com a saída do tubo de choque (usando uma haste de tapagem).
  3. Montar dois transdutores de pressão radial: sensor 1, na parte média da seção conduzida e sensor 2 na falange distal do tubo de choque (figura 1A). Conecte os transdutores de pressão para um osciloscópio através de uma unidade de energia de fonte atual.
  4. Certifique-se de que todas as válvulas de liberação de tubo de choque e controles de fluxo estão fechados.
  5. Abra a linha de ar comprimido externo e cobrar a válvula de solenoide para 2,5 bar.
  6. Abra a válvula de segurança do cilindro de ar comprimido e abra lentamente a válvula reguladora de pressão para aumentar a pressão para aproximadamente 5 bar.
    Nota: A pressão definida para este regulador deve estar ligeiramente acima do diafragma maior estourando a pressão.
  7. Prepare os diafragmas por 23 folhas de poliéster µm de espessura, corte em quadrados de 10 x 10 cm2 . Prepare as alças usando fita de autoclave e colando-as para cima e em baixo de cada diafragma.
  8. Posicione um diafragma (único slot de duplo culatra - configuração de diafragma único) ou dois diafragmas (ambos os slots de duplo culatra - configuração de duplo diafragma) na culatra (figura 1B).
  9. Centralize os diafragmas e colocar os cabos usando quatro M24 parafusos e porcas, fixando-os sequencialmente, de forma simétrica na diagonal e assegurar que os diafragmas são livre de rugas.
  10. Fixe cada saco estéril individualmente na posição vertical sobre o chassis de suporte, garantindo que a superfície das pastilhas com as fatias hippocampal organotypic cultura de tecido é virado para a saída do tubo de choque e a inserção de cultura de tecidos é centrada dentro o estéril saco (Figura 1). Certifique-se de que o saco estéril é firmemente apertado ao redor para garantir a imobilização firme e mesmo.
  11. Use protectores auriculares e óculos de segurança quando pressionar o tubo de choque. Ligue a unidade de energia de fonte atual e osciloscópio para adquirir os dados da onda de choque (taxa de aquisição de 50 mega-amostras/s, recorde de comprimento 20 ms, 1 milhão de pontos) e feche a válvula de solenoide.
  12. Usando o botão de controle de fluxo no painel de controle do tubo de choque, pressurizar lentamente a seção de drivers volume do tubo para configuração de diafragma único choque ou seção volume condutor e a seção duplo culatra do tubo choque de diafragma duplo configuração.
    Nota: Para configuração de diafragma único, a pressão de ruptura depende apenas do material do diafragma e a espessura e o diafragma se romper espontaneamente, uma vez que o material estourando a pressão é alcançado. Configuração de duplo diafragma, a pressão de rotura dependerá também a pressão do gás diferencial em ambos o driver e as câmaras de duplo culatra e, para os diafragmas estourar em uma maneira controlada, a válvula de segurança dupla culatra é aberta manualmente uma vez atingem-se as pressões de alvo.
  13. Tão logo o diafragma rupturas (produzindo um barulho alto), rapidamente fechar o fluxo de ar comprimido através do manípulo de fluxo e abra a válvula de solenoide.
    Nota: O volume total da seção de condutor pode ser modificado através da inserção de segmentos, permitindo uma ampla gama de sobrepressão de pico de ondas de choque e durações obtidos de fechamento. A combinação ideal de parâmetros de ondas de choque deve ser suficiente para causar danos em tecidos, mas não tão alto que ela provoca ruptura ou distorção saco estéril ou inserção de cultura de tecidos.
  14. Expor cada saco estéril com uma inserção de cultura de tecido para uma onda de tubo de choque único e devolvê-lo imediatamente à caixa thermo-regulado antes de uma nova bolsa estéril é retirada da caixa e aperta sobre o chassis de suporte. Certifique-se de que etapas 4.10 – 4.14 são executadas como suavemente e rapidamente possível (dentro de alguns minutos) para evitar o resfriamento médio experimental, como temperaturas abaixo de 37 ° C podem interferir com o desenvolvimento de lesões.
  15. Uma vez que todas as inserções de cultura de tecidos foram expostas a uma onda de choque (ou protocolo de Souza), retornar as inserções de cultura de tecidos para a placa de 6 original e seus respectivos bem (dentro de um capuz de cultura de tecidos de fluxo laminar) e retornar para a incubadora.
  16. Mantenha a placa de 6 na incubadora com 5% de dióxido de carbono no ar a 37 ° C até mais de imagem.
  17. Incluem controles de Souza para cada experimento, juntamente com a exposição de onda de choque de fatia.
    Nota: Fatias de Souza são tratadas de forma idêntica para as fatias expostas a uma onda de choque (selados em sacos estéreis com meio experimental, transportadas para o laboratório de tubo de choque na mesma caixa thermo-regulado e suspenso sobre o frame do metal por um período equivalente de tempo) mas o choque não é acionado, tubo.

5. hippocampal Organotypic fatia lesão quantificação

  1. Em 24 h, 48 h e 72 h, imagem as fatias conforme descrito nas etapas 2.8 e 2.9.
  2. Depois imaging na exposição de ondas de choque de post de 72 h, descartar o tecido biológico local seguir protocolos de resíduos e desinfectar e autoclave o metal anéis.

Resultados

O tubo de choque usado neste método permite a geração de transientes de sobrepressão que simulam explosões de vida real de campo aberto, modeladas pela função Friedlander7,8. Ondas de choque supersônicas, com velocidade de 440 m/s (Mach 1.3) foram obtidas (Figura 2A). Os dados de forma de onda relatados são do sensor 2, posicionada radialmente no final da seção de tubo de choque conduzida.

Usando o protocolo descrito acima, organotypic fatias hippocampal culturas expostas a uma única onda de choque (Figura 2A) desenvolvem lesão significativa quantificado usando iodeto de propidium, uma tintura fluorescente altamente polar que só penetra as células com comprometida com membranas celulares24,25 (Figura 2B, C).

Mesmo sob condições ideais e consistentes para outro OHSC publicaram modelos21,22, há um baixo nível de fluorescência de iodeto de propidium fundo devido, em parte, para pequenos danos resultantes o tecido inerente manipulações ( tais como alterações de mídia durante o período de cultura ou remoção da incubadora para a imagem latente). Esta explosão protocolo TBI envolve manipulação substancial que inclui a submersão das fatias em média dentro de sacos estéreis e um considerável grau de manipulação durante o protocolo de exposição de ondas de choque (EG., aperto os sacos estéreis para o chassis de suporte). No entanto, se todas as etapas são executadas com cuidado, esta manipulação adicional não tem um impacto sobre a saúde subjacente da OHSC como viam-se não há diferenças significativas entre um grupo de controle de fatias mantidos nas placas de 6-poços em todos os momentos (i. e., as inserções não eram submersos ou tratadas) e o grupo de Souza, que incluía as fatias que foram submergidas dentro de sacos estéreis fixados ao tubo de choque (Figura 2B).

As duas ondas de choque, escolhidas, em 50 kPa e pressão de pico de 55 kPa, produziu significativa (p < 0,05 e p < 0,0001, respectivamente) e lesões podem ser reproduzidos quando comparado com a farsa ileso fatias em todos os pontos de tempo após a exposição de explosão protocolo (Figura 2B) sem causar qualquer dano para as inserções de cultura de tecido ou de sacos estéreis. A fim de determinar a sensibilidade do modelo às pequenas diferenças de pico-sobrepressão, decidimos selecionar valores que eram diferentes de ~ 10%. Esses resultados mostram também que, como esperado, o prejuízo resultante de 55 kPa é maior do que após uma onda de choque de 50 kPa.

Os dados são expressos como média ± erro padrão da média. Significância foi avaliada por meio de uma análise de variância 2 vias medidas repetidas usando teste post hoc de Holm-Sidak. Fator 1 foi o grupo (controle, farsa, explosão) e fator 2 foi tempo após a lesão (h-1, 24 h, 48 h e 72 h), onde o fator 1 foi o fator repetido. Utilizou-se o ajuste do valor de p para comparações múltiplas. Valores de P de menos de 0.05 foram levados para indicar uma diferença significativa entre os grupos. Testes estatísticos foram implementados usando um pacote de software de gráficos e estatísticas.

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Figura 1: esquemático do dispositivo de tubo de choque com o chassis de suporte do saco estéril. (A). O tubo de choque é um tubo de aço inoxidável longo de 3,8 m, composto de três seções longas de 1,22 m, ligadas por gaxetas e flanges, com diâmetro interno de 59 mm. Inset (B) mostra a montagem duplo culatra. Um ou dois diafragmas de Mylar podem ser pinçados no assembly com o selo fornecido por anéis de borracha. (C) chassis de suporte do saco estéril. O corpo do quadro consiste de duas placas de metal com um orifício circular centrado (59 mm de diâmetro) que se alinha com a saída do tubo de choque. Duas folhas finas (4 mm) de elastómero de silicone contam-se entre as duas placas de metal. O objetivo dessas folhas é fornecer uma superfície uniforme e não-escorregadia para fixar os sacos estéreis. A distância entre o saco e a saída do tubo de choque é 7 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: shockwave típico e lesão resultante em organotypic hippocampal fatia culturas. (A) exemplo representativo da onda de choque obtido usando 23 µm de espessura película de poliéster, 2.16 bar pressão de ruptura, 55 kPa sobrepressão de pico, duração de onda positiva de 0,4 ms, 10,1 kPa·ms impulso. Obtiveram-se dados de forma de onda do sensor 2 montado radialmente na falange distal do tubo de choque conduzido seção. A velocidade das ondas de choque foi 440 m/s (Mach 1.3). (B) o desenvolvimento da lesão é proporcional à intensidade da onda de choque. Tanto kPa 50 e 55 kPa pico sobrepressão ondas de choque causado prejuízo significativo que se desenvolveu em todo o protocolo de 72 h quando comparado com o grupo farsa. O prejuízo resultante de uma exposição de onda de sobrepressão de pico de 55 kPa foi significativamente maior do que após 50 kPa a 48 h e fatias de Souza 72 h. foram tratadas de forma idêntica para fatias de explosão mas tubo de choque não foi demitido. Fatias de controle foram mantidas em 6 pratos bem na incubadora sem qualquer manipulação. Barras representam valores médios e as barras de erro são erros-padrão (n = 7, controles; n = 48, farsa; n = 30, explosão 50 kPa; n = 51, explosão 55 kPa; n = número de fatias, 6 experimentos separados). * p < 0,05, *p < 0,0001 comparado com a farsa. # p < 0,05, #p < 0,01 comparado com explosão 55 kPa. (C) representante propidium imagens de fluorescência iodeto de organotypic fatias de Souza (eu), (ii) explosão 50 kPa e (iii) explosão 55 kPa grupos a 72 h após a lesão. A fatia de Souza mostra baixos níveis de fluorescência, i. e., lesão e a explosão fatias expostas apresentam altos níveis de lesão difusa, mais pronunciada na fatia de sobrepressão exposto de pico de 55 kPa (barra de escala = 500 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Entre todos os mecanismos de lesão associada com explosão TBI (mecanismos de lesão primária, secundária e terciária de explosão), principal lesão de explosão é exclusivo ao trauma da explosão e é o menos compreendido do mecanismos de explosão-associado1,2 . O romance protocolo descrito aqui foi desenvolvido para estudar o impacto TBI usando um tubo de choque em aberto para expor em vitro culturas hippocampal fatia de rato a uma onda de choque única usando um protocolo simples e rápido que permite a criação de um reproduzíveis explosão primária TBI com uma alta taxa de transferência.

O primeiro em vitro explosão primária TBI modelos aplicados ondas de pressão hidrostática para células26,27. No entanto, a saída de pressão não modelou a função Friedlander, como a duração de um pulso de pressão hidrostática foi muito mais do que de ondas de sobrepressão de explosão no ar13. A característica Friedlander função pode facilmente ser modelada no laboratório usando um tubo de choque1,8. O tubo de choque pode produzir ondas de choque que simulam explosões de vida real campo aberto em um ambiente de laboratório convencional, permitindo o controle preciso dos parâmetros de onda, tais como a pressão de pico, duração de onda positiva e impulso, variando a material do diafragma e espessura e o motorista volume8,28,29.

Modelos simples em vitro como culturas celulares geralmente faltam a heterogeneidade dos tipos de células e conectividade sináptica30. Recentemente, o efeito de explosão em vitro neurónio 'esferoides' incorporando diferentes tipos de células tem sido investigados31. Outras investigações dessas preparações interessante é merecida; no entanto, não está claro como a sua organização celular e conectividade espelha o cérebro intacto. OHSC são um bem estabelecido em vitro modelo experimental23,,32, são fáceis de cultura e seus cytoarchitecture de tecido tridimensional, diferenciação celular e conectividade sináptica estão bem preservadas e muito semelhante a na vivo33,34,35,36. OHSCs representam um nível intermediário de complexidade entre a cultura de células e no vivo modelo23,32. OHSCs tenham sido demonstradas a reproduzir em vitro neurodegenerativas patológica cascades, vistos em modelos na vivo e tem sido muito útil para o rastreio de drogas potenciais neuroprotetor e na compreensão de seus mecanismos de ação17,21,22,37,38. Finalmente, a área anatômica estudada, o hipocampo, é altamente relevante em estudos translacionais de TBI, como esta região é frequentemente danificada no TBI pacientes39,40,41. OHSC têm sido utilizados para explosão modelo TBI28,42,,43,44, no entanto, nosso modelo é relativamente simples e pode ser adaptado para choque-tubos existentes em qualquer horizontal ou vertical configurações sem adaptações complexas.

OHSC pode ser mantido em cultura por muitos dias, o que facilita a investigação de processos biológicos ao longo do tempo,34. Neste modelo, a lesão tecidual que resultou de exposição de ondas de choque foi medida diariamente durante três dias, após a exposição de explosão usando iodeto de propidium, um bem estabelecido marcador de danos celulares. Iodeto de propidium é uma tinta altamente polar não tóxica que penetra as células com membranas celulares comprometidas, onde liga para ácidos nucleicos e apresenta uma característica fluorescência vermelha brilhante24,25,45. A fluorescência medida com iodeto de propidium foi mostrada para ter uma boa correlação com a contagem de células lesadas usando Nissl mancha46,47.

Dado que a lesão produzida neste modelo era difusa (Figura 2), a fluorescência da fatia inteira foi medida quando realizar a análise, similar ao trabalho anteriormente publicado em outro cérebro lesão paradigmas21,22 , em vez de usar regiões específicas, como foi feito em outros em vitro explosão TBI modelos28,,43,44,48. A abordagem global usada no modelo descrito neste artigo também elimina a variabilidade potencial é introduzido quando delineando definido regiões de interesse e fornece uma visão mais global das lesões relacionadas com a explosão. Tanto sobrepressões de pico de ondas de choque, 50 kPa e 55 kPa, produziu significativa (p < 0,05 e p < 0,0001, respectivamente) lesão quando comparado com fatias de Souza (Figura 2B). Como previsto, a onda de choque com a sobrepressão de pico mais alto, 55 kPa, produzido mais prejuízo do que a onda de 50 kPa. Em um modelo in vitro com cérebro isolado tecido exposto diretamente a uma onda de choque, como dimensionar com precisão para todo o organismo ou de um ser humano não é tão simples. No entanto, as ondas de choque que usamos estão dentro da faixa de sobrepressões pico observado no campo, tipicamente 50 – 1.000 kPa8,49.

A fim de manter o OHSC exposto a temperatura fisiológica e níveis de oxigênio e dióxido de carbono, garantindo que eles estavam livres de contaminação em todo o protocolo de exposição de ondas de choque, as inserções de cultura de tecidos foram seladas em estéril sacos de polietileno, seguindo uma técnica asséptica, submergida num meio experimental aquecido a 37 ° C e recentemente borbulhava com 95% oxigênio e 5% de dióxido de carbono, semelhante ao trabalho anteriormente publicado28,,43,44 ,48. Ao contrário destes modelos onde dispositivos complexos foram usados para segurar os sacos estéreis durante a exposição de ondas de choque, neste protocolo, utilizou-se um método simples e rápido para suspender as inserções de cultura de tecidos OHSC na frente da saída do tubo de choque (figura 1A, C ). O modelo descrito neste artigo permite o processamento rápido e alto throughput, minimizando o risco de hipotermia. Estes aspectos são particularmente relevantes para estudos de neuroproteção, dado que algumas intervenções terapêuticas podem ter uma janela de tempo muito limitado de potencial aplicação após TBI. Este protocolo de exposição novela onda de choque permite 6 a 9, cultura de tecidos insere (tipicamente de 36 para 54 hippocampal organotypic fatias de tecido) para ser exposto a uma onda de choque em um curto intervalo de tempo (cerca de 1 h).

Os OHSCs requerem boa técnica asséptica durante todo. É importante usar um capuz asséptica de fluxo laminar durante todo o cultivo e ao transferir para os sacos estéreis para explosão. Para realizar a imagem da fatia em condições assépticas, com as tampas das placas 6-poços em lugar, usamos anéis metálicos sob medidos para elevar as inserções de cultura de células para o plano focal do microscópio. Uma parte importante do nosso protocolo é que incluímos fatias de Souza ileso em cada experimento. Fatias de Souza são tratadas de forma idêntica para fatias de explosão, com a exceção de que o tubo de choque não é acionado; outro passo importante é que todas as fatias são fotografadas 1h antes de lesão ou tratamento de Souza, para garantir que a saúde da população de fatias usadas são idênticas (Figura 2B).

Além de quantificar a lesão celular nas fatias ao longo do tempo, o tecido pode ser corrigido ao final do experimento por imuno-histoquímica convencional50. Desenvolvemos e avaliado o método usando fatias hippocampal do rato. No entanto, nossa técnica poderia ser facilmente adaptada para usar outros tecidos que podem ser cultivados em cultura, tais como a medula espinhal, retina, pulmão ou tecido epitelial. Este papel e nosso trabalho anterior com o modelo, investigamos apenas o efeito da exposição a um único disparo. No entanto, o modelo seria bem adequado para investigar os efeitos de repetidas explosões de baixo nível no cérebro ou outros tecidos. OHSCs podem ser mantidos em cultura por muitas semanas ou mesmo meses, permitindo que os efeitos crônicos de ser investigadas.

Em vitro modelos, sendo mais simples do que na vivo modelos, têm uma maior taxa de transferência, são menos caro e experimentos geralmente podem ser concluídos em um curto tempo de escala17. No entanto, os resultados obtidos em vitro modelos precisam ser validados em modelos animais, como tecidos em vitro cultivadas são mantidos em um ambiente artificial e podem responder a lesão de forma diferente do que fariam na vivo17. Não obstante, em vitro modelos tem sido extremamente valiosos em aumentar a nossa compreensão de cascatas de lesão cerebral e em triagem neuroprotetor drogas antes do uso da mais complexa na vivo modelos17,22 , 51 , 52. apesar de muitas vantagens ofereceram por este modelo, é importante observar que em vitro modelos faltam a chave características de TCE presente em animais e em vivo modelos, tais como os efeitos no sistema vascular, do aumento intracraniana pressão, resposta imune sistêmica e comprometimento funcional comportamental, que destaca a necessidade de validar os resultados encontrados em modelos em vitro no animal inteiro. Não obstante, em vitro modelos tais como o modelo descrito neste artigo são extremamente úteis ferramentas científicas translationally relevantes.

Em conclusão, este trabalho descreve um método simples e direto romance, onde culturas de tecido hippocampal do rato organotypic estão expostas a rigidamente controladas e reprodutíveis vida real relevantes as ondas de choque através de um tubo de choque de laboratório. O prejuízo global resultante, que foi quantificado utilizando iodeto de propidium, um bem estabelecido marcador de danos celulares, é muito reprodutível e é proporcional a sobrepressão de pico de ondas de choque aplicada.

Divulgações

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Apoiado por: real centro de medicina de defesa, Birmingham, Reino Unido, Royal centro Legião britânico para estudos de lesão de explosão, Imperial College de Londres, Reino Unido. Conselho de pesquisa médica, Londres, Reino Unido (MC_PC_13064; MR/N027736/1). A segurança de gás Trust, Londres, Reino Unido. Rita Campos-Pires foi o destinatário de um prêmio de formação doutoral da Fundação para uma Ciência e uma Tecnologia, Lisboa, Portugal. Katie Harris foi o destinatário de uma bolsa de estudo de doutorado do Westminster Medical School pesquisa Trust, Londres, Reino Unido.

Este modelo foi desenvolvido com o apoio do centro de Legião real britânica para explosão lesão estudos (RBLCBIS) no Imperial College. Gostaríamos de agradecer o apoio financeiro da Legião real britânica. Pesquisadores interessados em colaborações ou um detalhe mais adicional podem contactar os autores ou RBLCBIS.

Agradecemos Dr Amarjit Samra, diretor de pesquisa, centro de defesa medicina, Birmingham, Reino Unido, para apoiar este trabalho, Scott Armstrong, departamento de cirurgia & câncer, Imperial College London, para obter assistência com experimentos preliminares , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, departamento de bioengenharia Imperial College London e William Proud, departamento de física Imperial College London, para aconselhamento sobre o tubo de choque, Raquel Yustos, técnica, departamento de investigação de Ciências da vida, Imperial College London, para suporte técnico, Paul Brown MBE, gerente de oficina e Steve Nelson, técnico de oficina, departamento de física, Imperial College London, para fazer o metal anéis, Neal Powell do departamento de física, Imperial College London, para obras de arte.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Geys solução salina balanceadaSigma UKG9779
D-glicoseSigma UKG8270
Antibiótico / antimicóticoSigma UKA5955
Meio essencial mínimo EagleSigma UKM4655
Hanks solução salina balanceadaSigma UKH9269
Soro de cavaloSigma UKH1138
L-glutaminaSigma UKG7513
HEPESVWR Prolabo, Bélgica441476L
Hidróxido de sódioSigma UKS-0945
Insertos de cultura de tecidosMillicell CM 30 mm de baixa altura MilliporePICM ORG 50
placas de 6 poçosNUNC, Dinamarca140675
Iodeto de propídioSigma UKP4864
Sacos de polietileno estéreis - Sacos de amostra estéreis Twirl'emFisherbrand01-002-30
Tubo de enchimento Portex Avon Kwill 5" (127 mm)Smiths Medical SuppliesE910
Microscópio de epifluorescênciaNIKON Eclipse 80i, UK
Objetiva de microscópioNikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Filtro de microscópioNikon G-2B (emissão de passagem longa)
Filme isolante elétrico Mylar, 304 mm x 200 mm x 0,023 mmComponents UK785-0782
Transdutor de pressãoDytran Instruments Inc.2300V1
Picador de tecidosMickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, Reino Unido.de tecidos Mcllwain
Elastômero de siliconeDow Corning, EUASylgard 184
Software gráfico e estatísticoGraphPad Software, EUAPrism 7.0
RS Picador

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