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Artigo de método

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

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DOI:

10.3791/58439

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7 de janeiro de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Autoimmunity, Transplantation and Inflammation, Novartis Institutes for BioMedical Research

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

MALT1 regula a imunidade inata, mas como isso ocorre permanece indefinida. Usamos o inibidor seletivo de paracaspase MALT1 MIT-827 para desvendar a contribuição da MALT1 para sinalização inata, a jusante dos receptores Toll-like ou tipo C do tipo lectina, demonstrando que MALT1 regula a produção de citocinas mieloides e a jusante dos receptores do tipo lectina do tipo C, seletivamente.

Resumo

Além de sua função nas células linfoides, que foi abordada por numerosos estudos, o paracaspase MALT1 também desempenha um papel importante nas células inatas a jusante dos receptores de reconhecimento padrão. Mais bem estudados são os membros da família de receptores de lectina tipo C-tipo Dectin-1 e Dectin-2 que induzem um dependente SYK - e CARD9-sinalização em cascata, levando a ativação do NF-κB, em uma maneira MALT1-dependente. Por outro lado, receptores do tipo Toll (TLR), como o TLR-4, propaga a ativação de NF-κB, mas sinal através de uma cascata de MYD88/IRAK-dependente. No entanto, se MALT1 possam contribuir para a sinalização de TLR-4 manteve-se pouco clara. Evidências recentes com MIT-827, um inibidor potente e seletivo da MALT1 paracaspase atividade, indicam que o TNF-produção a jusante de TLR-4 em células mieloides humanas é independente de MALT1, ao contrário do TNF-produção a jusante de Dectin-1, que é MALT1 dependente. Aqui, abordámos o envolvimento seletivo de MALT1 em reconhecimento de padrões, sentindo-se ainda mais, usando uma variedade de humanos e rato celular, produtos de higiene e estimulação de Dectin-1, MINCLE ou TLR-4 vias. Nós também forneceu insights adicionais explorando citocinas TNF-e comparando MIT-827 para um inibidor SYK (Cpd11) e um inibidor IKK (AFN700). Coletivamente, os dados fornecidos ainda mais evidência para a dependência de MALT1 dos receptores de lectina tipo C-tipo — sinalização em contrapartida para sinalização de TLR.

Introdução

A atividade de paracaspase de MALT1 (proteína associada a Mucosa tecido linfoide linfoma translocação 1) foi revelada em 20081,2. Desde então, vários estudos têm relatado sua contribuição fundamental para respostas de receptor do antígeno em linfócitos. Modelos genéticos no mouse, bem como dados de farmacologia suportam um papel-chave em células T, de auto-imunidade dependente de células T e células B linfoma configurações3,4. Em linfócitos, MALT1 paracaspase ativação ocorre após a montagem de um CARD11-BCL10-MALT1 complexo5, que é acionado por sinalização proximal do antigénio-receptor a jusante do receptor de células T ou B. Também há ampla evidência de que um complexo CARD9-BCL10-MALT1 semelhante é importante para a propagação de sinais a jusante dos receptores do tipo lectina tipo C (CLLR), por exemplo,, Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE em mieloide células6,7. Dectin-1 tem sido particularmente bem estudado, pois esta via é fundamental para a defesa do hospedeiro contra infecções fúngicas8,9. Implicação de MALT1 em vias de receptores do tipo Toll (TLR), no entanto, manteve-se controversa10. Evidências recentes em células mieloides humanas descartaram um papel direto para a atividade de paracaspase MALT1 na regulação do TNF-produção a jusante de TLR-411.

No presente trabalho, costumávamos várias configurações experimentais e condições estimulatórios em humanos e pilhas myeloid rato sonda inatas vias de sinalização, baseando-se na ferramenta farmacológica específica inibidores e medição da produção de citocinas.

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Protocolo

Experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e normas do Comitê de ética pesquisa humana da Novartis.

1. preparação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de casacos Buffy humanas

Nota: Recebemos a buffy casacos de voluntários saudáveis, um dia após a coleta, em sacos de 50 mL. Foram fornecidas sob consentimento informado e coletadas através do Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Lidamos com eles usando o procedimento abaixo, à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário.

  1. Prepare um par limpo e estéril de tesoura e um copo de 1 L com um saco de plástico (sob um fluxo de lâmina).
  2. Transferir o buffy coat para o copo e com cuidado, abra-o com a tesoura.
  3. Utilizando uma pipeta de 25 mL, adicionar 100 mL de ácido tampão fosfato salina tampão/etilenodiaminotetracético (EDTA/PBS: pH de 1X PBS 7,4 contendo não CaCl2 e não MgCl2, suplementado com 2 mM pH EDTA 8.0).
    Nota: Usando a mesma pipeta e depois lentamente pipetagem a solução acima e para baixo, dispense 25 mL do revestimento buffy diluído em 6 tubos de centrifuga conico de pré-preenchido com 15 mL de gradiente de densidade baseados em polissacarídeo de 50 mL.
  4. Centrífuga 20 min a 800 x g com aceleração moderada (fixado em 4 de 9) e sem freio para permitir a separação de células com base em suas densidades.
    Nota: Após a centrifugação, três camadas serão visíveis; uma pelota contendo hemácias e granulócitos, uma camada superior feita de plasma e no meio de um anel branco contendo células mononucleares de sangue periférico (PBMC).
  5. Colha o anel PBMC usando uma pipeta de 10 mL e transferência para novos tubos de 50 mL.
    Nota: Dois ou três tubos de 50 mL são normalmente exigidos por demão buffy. Nesta fase, alguns plasma provável contamina os PBMCs coletados, que devem ter nenhum impacto sobre as etapas subsequentes de enriquecimento.
  6. Superior a 50 mL cada tubo utilizando PBS/EDTA e proceder a três lavagens sucessivas com diminuindo o tempo de centrifugação e velocidade (15 min 520 x g, 10 min a 330 x g, 8 min a 150 x g).
    Nota: A cada passo, o sobrenadante é coado em um recipiente de resíduos líquido e o centrifugado é resuspended em 50 mL de PBS/EDTA (Pelotas podem ser colocados em pool após a primeira lavagem).
  7. Após a lavagem final, resuspenda o pellet em 25 mL de um tampão de Lise gelada (consulte a Tabela de materiais) para lisar os glóbulos vermelhos por pressão osmótica.
  8. Incubar até que a solução torna-se claro (≤ 5 min à temperatura ambiente).
  9. Pare a reação adicionando 25 mL de tampão de separação (PBS 1 x pH 7,4 contendo não CaCl2 e não MgCl2, suplementado com 2% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1 mM EDTA pH 8.0).
  10. Lave mais uma vez a 150 x g por 8 min.
    Nota: Nesta fase PBMCs podem ser usados como uma população em massa (consulte a etapa 3: tratamentos PBMCs e monócitos e condições estimulatórios) ou transformadas para enriquecimento de monócitos (consulte a etapa 2: preparação de monócitos de PBMC), ou congelado para baixo para uso subsequente (consulte a etapa 5: Monócitos e PBMCs procedimentos de congelamento/descongelamento).

2. preparação de monócitos de PBMC

  1. Ressuspender os PBMCs obtidos no passo 1.10 no buffer de separação e contá-las para alcançar 5 x 107células/mL.
  2. Transferi a suspensão de células para um tubo de centrifuga conico de 14 mL com tampa.
  3. Adicionar 50 µ l de anticorpo de enriquecimento monócito cocktail por mL de suspensão de células, vórtice e incube 10 minutos a 4 ° C.
  4. Adicione 50 µ l de grânulos de enriquecimento monócito de células por mL.
    Nota: Os grânulos devem ser completamente vortexed para garantir a homogeneidade da suspensão.
  5. Depois de adicionar as contas, em breve levar a suspensão de célula e incubar 5 min a 4 ° C.
  6. Lave a parte superior do tubo com buffer de separação até que o tubo está cheio até 10 mL.
  7. Misture lentamente a solução pipetando para cima e para baixo.
  8. Coloca o tubo sem tampa em um ímã de separação.
  9. Incube durante 2,5 min à temperatura ambiente.
  10. Despeje lentamente em um tubo de centrifuga conico de 15 mL.
  11. Nesta fase, use os monócitos diretamente (consulte a etapa 3: tratamentos PBMCs e monócitos e condições estimulatórios) ou diferenciá-los em euangelinhos Monocyte-derivado Dendritic Cells (iMoDCs) (consulte a etapa 4), ou congelá-los para baixo para uso subsequente (Veja passo 5).

3. PBMCs e tratamentos de monócitos e estimulatórios condições

  1. Contar as células e diluí-los em meio de cultura (meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10% FBS 1 mM piruvato de sódio + 100 U/mL Estreptomicina de penicilina (Pen/Strep) + β-Mercaptoetanol de 5 µM), até 1,25 x 104 células/poço.
  2. Distribua 30 µ l de suspensão de células por poço de uma placa de 384.
  3. Adicionar 15 µ l de 4 x soluções concentradas de composto e pre-incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.
  4. Adicionar lipopolissacarídeo (LPS) a uma concentração final de 10 ng/mL, ou empobrecido ZnPPIX (DZ) a uma concentração final de 100 µ g/mL ou manter-se em simples meio.
  5. Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.
  6. Leve 10 µ l do sobrenadante para medir níveis de TNF-a secretada (consulte a etapa 7: medições de citocinas e viabilidade).

4. monócitos diferenciação em iMoDCs e estimulatórios condições

  1. Contagem de monócitos (enriquecidos no passo 2) e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 520 x g por 5 min.
  2. Pipetar fora o sobrenadante e adicionar o meio de cultura (RPMI + 10% FBS para obter uma suspensão de célula final de 0,4 x 106 células/mL.
  3. Adicione 80 ng/mL recombinante humano IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.
  4. Dispense a 5 mL de suspensão de células por poço em uma placa de 6.
  5. Incube durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO2.
  6. No dia 7, colha células pipetando suavemente para evitar a sua ativação.
  7. Centrifugar a 520 x g por 5 min.
  8. Aspirado de vácuo e ressuspender em 50 mL de meio de cultura sem fatores de crescimento.
  9. Centrifugar a 520 x g por 5 min e ressuspender a 1 x 106 células/mL em meio de cultura.
  10. Dispense 100 µ l de suspensão de células (105 células) por bem de uma placa de fundo chato de 96 poços.
  11. Pre-incubate por 1 h a 37 ° C, após a adição de 50 µ l de 4 x concentrado compostas soluções, preparadas como descrito no passo 8: preparação de compostos.
  12. Adicione 50 µ l de estímulos (4 x concentrado), preparado como descrito no passo 9.
  13. Incubar 24 horas a 37 ° C.
  14. Misture cada poço e transferência de células e o sobrenadante (SN) em uma placa de V-fundo de 96 poços.
  15. Spin para baixo a 475 x g por 5 min.
  16. Transferir o sobrenadante para um novo prato fundo plano 96 poços, selar e congelar a-20 ° C até utilização posterior.

5. monócitos e procedimentos de congelamento/descongelamento PBMCs

  1. Congelamento
    1. Spin para baixo PBMC ou monócitos preparações da pilha a 520 x g por 5 min.
    2. Vácuo, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em congelamento médio a 1 x 107 células/mL.
    3. Diluir 1 mL de suspensão de células em cryotubes, transferir os tubos para um dispositivo de resfriamento específico (veja a tabela dos materiais) e coloque-a-80 ° C.
  2. Descongelamento
    1. Descongelar o criotubo e rapidamente transferir seu conteúdo para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo 9 mL de meio de cultura.
    2. Centrifugar a 520 x g por 5 min.
    3. Aspirador de aspirado de sobrenadante e ressuspender células em 5 mL de meio de cultura. Células estão agora prontas para mais processamento experimental.

6. Mouse baço células preparação e tratamento

Nota: Realizamos sacrifícios de animais, de acordo com as diretrizes e normas da organização de bem-estar Animal Novartis. Estudos foram aprovados pelo Comitê de ética da autoridade governamental regional (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Sacrificamos animais por excesso de exposição de isoflurano, com todos os esforços para minimizar o sofrimento.

  1. Colheita do baço e dissociar o tecido usando um tubo equipado com um dispositivo de moedor de tecido mecânico e preenchido com 5 mL de meio RPMI frio.
  2. Use o programa de baço da máquina dissociação para moer os órgãos.
  3. Filtre as células através de um filtro de célula de nylon 100mm.
  4. Transferi a suspensão em tubos de 50 mL e centrifugar a 4 ° C por 10 min a 320 x g.
  5. Vácuo, aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em 3 mL de tampão de Lise gelada e incube por ≤ 2 min no gelo.
  6. Pare lise adicionando 7 mL de meio RPMI.
  7. Filtrar novamente através de um filtro de célula de nylon µm 100.
  8. Spin para baixo a suspensão de células a 330 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
  9. Aspirador de aspirado de sobrenadante e ressuspender as células em 11 x 106 células/mL em meio completo (RPMI suplementado com 10% FBS, 100 U/mL caneta/etapa e β-Mercaptoetanol de 5 µM).
  10. Placa 1 x 106 células/poço (90 µ l) em uma placa de 96 poços (fundo plano).
  11. Adicionar 5 µ l de 20 x concentrado composta solução previamente diluída em meio RPMI conforme descrito no passo 8.3: diluição Serial para células de baço murino.
  12. Incube durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO2.
  13. Adicione 5 µ l de 20 x concentrado DZ (concentração final de 30 µ g/mL) ou 20 x concentrado LPS + IFN-g (TLR-4) (concentração final de 1 µM LPS e 10 ng/mL IFN-g).
  14. Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.
  15. Centrifugar a 330 x g por 10 min.
  16. Sobrenadantes em novas placas de transferência, selar e congelar a-20 ° C até utilização posterior.

7. citocinas e medições de viabilidade

  1. Medição humana de TNF-a por HTRF (homogênea tempo resolvido fluorescência)
    Nota: O protocolo seguido as recomendações do fornecedor, brevemente resumidas a seguir.
    1. Misturar 1 volume de reagente reconstituído (anti-TNF-por-cryptate e anti-TNF-a-XL665) com 19 volumes de tampão de reconstituição (50mm tampão fosfato pH 7,0, 0,8 M de fluoreto de potássio (KF), 0,2% albumina de soro bovino (BSA)).
    2. Misture as duas soluções ready-to-use anticorpo 1:1 antes de dispensar os reagentes.
    3. Dispense 10 µ l de sobrenadantes de passo 3.6 em chapas de 384-poço brancos.
    4. Dispense 10 µ l da mistura anticorpo.
    5. Cubra o prato com um aferidor e incubar a 4 ° C durante a noite.
    6. Leia a placa em um leitor de microplacas (50 – 200 flash).
  2. Medição de IL-23 humana por HTRF (homogênea tempo resolvido fluorescência)
    Nota: O protocolo seguido as recomendações do fornecedor, brevemente resumidas a seguir.
    1. Misture um volume de reagente reconstituído (anti-IL-23-cryptate-anticorpo e anti-IL-23 D2-anticorpo) com 19 volumes de tampão de deteção #3.
    2. Misture as duas soluções ready-to-use anticorpo 1:1 antes de dispensar os reagentes.
    3. Dispense 10 µ l de sobrenadantes de passo 3.6 em chapas de 384-poço brancos.
    4. Dispense 10 µ l da mistura anticorpo.
    5. Cubra o prato com um aferidor e incubar a 4 ° C durante a noite.
    6. Leia a placa em um leitor de microplacas (flash de 50 – 200 nm).
  3. Humano IL-6, IL-8, IL-1 β e medições de TNF-α por eletroquimioluminescência
    Nota: Todas as amostras foram diluídas em 1/150 em diluente 2 (primeira diluição: 10 µ l em 150 µ l e, em seguida, 20 µ l de 180 µ l). O protocolo seguido as recomendações do fornecedor:
    1. Dilua as amostras e padrão em diluente 2.
    2. Proceda à diluição da norma em diluente 2 usando uma diluição de série dobra de 1/4.
    3. Placas de lavar três vezes com tampão de lavagem.
    4. Dispense a 50 µ l de norma por alvéolo ou amostras.
    5. Incube durante 2 h à temperatura ambiente sob agitação.
    6. Lavar a placa quatro vezes com PBS + 0,05% polissorbato 20.
    7. Adicione 25 µ l de anticorpo de detecção (60 µ l de cada anticorpo para final 3 mL) no diluente de 3.
    8. Incube durante 2 h à temperatura ambiente sob agitação.
    9. Lavar a placa quatro vezes com PBS + 0,05% polissorbato 20.
    10. Evitando bolhas, adicionar 150 µ l por alvéolo do buffer de leitura (buffer de Tris contendo tripropilamina, diluídas 2x em ddH20) como um reagente co para a geração de luz em imunoensaios eletroquimioluminescência.
    11. Leia a placa (sem atraso) em um leitor de placa multiplex.
  4. Mouse TNF-a medição por ELISA seguindo o protocolo do fornecedor
    1. Dilua o sobrenadante 1:1 em diluente de ensaio (pronto para usar tampão proteicos).
      1. Prepare reagentes, amostras e diluições padrão conforme descrito no kit. Adicione 50 μL de diluente de ensaio para cada poço.
      2. Adicione 50 μL de amostra por alvéolo, controle ou padrão.
    2. Misture suavemente tocando a moldura da placa por 1 min.
    3. Cubra com a fita adesiva fornecida e incubar durante 2 h à temperatura ambiente.
    4. Aspire cada bem e lave com 400 μL/poço (repetir este passo cinco vezes no total).
    5. Após a lavagem final, remova qualquer restantes tampão de lavagem por aspiração.
    6. Inverter a placa e borre contra toalhas de papel limpo.
    7. Adicione 100 μL de conjugado de rato TNF-α em cada poço. Cobrir com uma nova tira adesiva.
    8. Incube durante 2 h à temperatura ambiente.
    9. Repita a aspiração/lavagem como na etapa 7.4.4.
    10. Adicionar 100 μL de solução de substrato a cada poço e incube por 30 minutos em temperatura ambiente protegido da luz.
    11. Adicione 100 μL de solução de ácido clorídrico diluído (solução de paragem) a cada poço. Bata levemente a placa para assegurar uma mistura completa.
    12. Medir a densidade óptica a 450 nm (com o comprimento de onda de correção fixado em 560 nm) usando um leitor de microplacas (para ser feito dentro de 30 min).
  5. Viabilidade celular
    1. Depois de remover sobrenadantes de preparações PBMC ou monócitos, avalie a viabilidade celular usando um pronto para usar a solução de resazurina (indicador de oxidação-redução) adicionada diretamente à suspensão de células para a concentração final de 10%.
    2. Incube durante 1 a 2 h a 37 ° C, 5% de CO2.
    3. Lê a fluorescência em 590 nm (excitação 540 nm), utilizando um leitor de microplacas.

8. preparação de compostos

  1. Diluição serial para iMoDCs
    1. Diluir a solução estoque MIT-827 (10mm em dimetilsulfóxido (DMSO) em média para chegar a 8 µM de uma só vez (4 x concentrada).
    2. Realize uma diluição serial da seis-etapa 1:5, usando médio + 0,08% DMSO. Use o mesmo meio de + 0,08% solução de DMSO para a condição do veículo (não composto).
  2. Dose única de teste para iMoDCs
    1. Dilua as soluções estoque MIT-827, AFN700 e Cpd11 em meio para chegar a 4 µM de uma só vez (4 x concentrada).
  3. Diluição serial para células de baço murino
    1. Dilua uma solução de MIT-827 de 10 µM (obtido de uma solução stock de 10mm, seguindo uma diluição vá em média) de 0,01 µM, com uma concentração final de DMSO de 0,1%.
    2. Para as etapas de diluição, tome 2 µ l de cada diluição, adicione 38 µ l RPMI e pipetar 5 µ l para o poço.
      Nota: Todos os tratamentos são realizados em triplicado.

9. estímulos preparação

  1. ZnPPIX empobrecido (DZ)
    1. Adicionar 2 mL de água livre de endotoxinas estéril a 10 mg de DZ.
    2. Vórtice para homogeneizar a solução-mãe, vórtice também prévia de cada utilização.
    3. Alíquotas alíquotas de solução e loja a-20 ° C.
  2. Trealose-6,6-dibehenate (TDB)
    1. Adicione 100 µ l de DMSO TDB, calor de 60 ° C em um banho de água durante 15-30 s de 1 mg.
    2. Vórtice e imediatamente adicionar 900 µ l de PBS estéril, vórtice novamente.
    3. Aquecer durante 10 a 15 min a 60 ° C e homogeneizar por prévio num Vortex de cada utilização.
    4. Manter a solução a 4 ° C.
    5. Realize diluições em série e dose única preparação quanto o composto do MIT-827.
      Nota: Porque TDB precisa ser preparado em DMSO, uma concentração de DMSO final 1% está presente durante a estimulação da célula.

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Resultados

Em células mieloides, MALT1 transmitem sinais de ativação a jusante dos vários receptores do tipo lectina tipo C, tais como Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE6. Essas vias dependem de receptores de (bainha) ITAM contendo motivo (por exemplo,, Dectin-1) ou receptores de co ITAM contendo motivo (por exemplo,, FcRγ, Dectin-2 e MINCLE) que recrutar e ativar a quinase SYK (Figura 1). Isto leva à ativação de uma proteína quinase C...

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Discussão

Neste trabalho, usamos configurações simples experimentais para estudar a sinalização percursos em humanos e inata pilhas do rato e interrogar sua dependência na função proteolítica MALT1. Expansão no anterior trabalho11, nosso estudo mostrou que MALT1 paracaspase atividade controla tipo C lectin como receptor induzida produção de citocinas, incluindo TNF-α. Em contraste, o TLR 4-induzida por TNF-α foi independente de MALT1 em ambas as espécies. Coletivamente, estes dados corroboram a contribuição...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Elsevier para sua autorização (matrícula 4334770630127) reproduzir aqui Figura 2A de Unterreiner et al . (2017).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100 µ m filtro de células de nylonSigmaCLS431752
14 mL Tubo FalconBD Falcon352057
15 mL Tubo FalconFalcon 352090
50 mL Tubo FalconFalcon352070
Placas de 6 poçosCostar3516
Placa de fundo plano de 96 poços, com tampa de baixa evaporaçãoCostar3595
96 poços de placa de fundo em VCostar734-1798
Cloreto de amônio - NH4ClSigmaA9434
Diluente de ensaio RD1-W ELISAR& D895038Diluente
Microplaca de cultura de células, 384 poços,preto Greiner781986
Depleted ZymosanInvivogentlrl-dznagora: tlrl-zyd
Dimetilsulfóxido SigmaD2650DMSO
EDTA-Na2SigmaE5134Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado
ELISA muTNF-&alfa;R& DSMTA00
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
gentleMACS C tubosMACS Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS dissociadorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
GM-CSFNovartis-Soro
bovino fetal inativado por calorGibco10082FBS
HTRF para IL-23CisBio62HIL23PEG
HTRF para TNF-&alfa;Tampão de reconstituição CisBio62TNFPEC
HTRF Tampão de fosfatoCisBio62RB3RDE50mM, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA
IFN-&gama;R& DL4516
IL-4Novartis-Isoflurano
AbbottForene
Lipopolissacarídeos (LPS)SigmaL4391LPS usado em amostras humanas
LipopolissacarídeosSigmaL4516LPS usado em amostras murinas
Tampão de lisefeito por si mesmo155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4
MicroplacaMagnet Stemcell18001
Greiner784075branco de 384
poçosStemcell19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1° C Recipiente de congelamentoNalgene5100-0001dispositivo de resfriamento (contendo Propanol-2)
PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2< / sub> [-] MgCl2< / sub>Gibco10010salina tamponada com fosfato
Gibco15140Pen / Strep
Bicarbonato de potássio - KHCO3< / sub>SigmaP9144
PrestoBlueInvitrogenA13262Solução de resazurina para avaliação de viabilidade
Propanol-2Merck1.09634
Tampão de leituraMesoScale DiscoveryR92TC-3Tampão à base de Tris contendo tripropilamina
Meio de congelamento de cultura de células de recuperaçãoGibco12648-010
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) com GlutamaxGibco61870+ 10% FBS para iMoDCs
+ 10% FBS + 1 mM de piruvato de sódio + 100 U/mL de caneta/estreptococo + 5 µ M β-mercaptoetanol para PBMCs e monócitos humanos
+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 µ M β-mercaptoetanol para esplenócitos murinos
Tampão de separaçãoSelf-made-PBSpH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0
Piruvato de sódioGibco11360
Trealose-6,6-dibehenatoInvivogentlrl-tdbTDB
Tween 20SigmaP7949Polissorbato 20
UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15675Ácido etilenodiaminotetracético
Selante ViewsealGreiner BioOne676070
V-PLEX Painel Proinflamatório 1 Kit HumanoMesoScale DiscoveryK15049Densaio multiplex eletroquimioluminescente (IL-1β, TNF-&alfa;, IL-6, IL-8)
β-MercaptoetanolGibco31350
de ensaio , kit de enriquecimento de monócitos Penicilina / estreptomicina

Referências

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Via da Dectin-1Sinalização de TLR-4Inibidor de SYK Cpd11Inibidor de IKK AFN700Composto MLT-827Células Mononucleares do Sangue PeriféricoMedição de TNF AlfaProtocolo de Diluição Seriada
Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade
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