Artigo de método

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

DOI:

10.3791/58448

⸱

7 de janeiro de 2019

 , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infarto do miocárdio (MI) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Dos principais objetivos da medicina regenerativa é reabastecer o miocárdio morto depois de MI. Embora várias estratégias têm sido usadas para regenerar o miocárdio, terapia de células-tronco permanece uma grande abordagem para reabastecer o miocárdio morto de um coração de MI. Acumular evidências sugere a presença de células-tronco cardíacas (CSCs) residentes no coração adulto e seus efeitos endócrinas e/ou parácrina sobre regeneração cardíaca. No entanto, o isolamento do CSC e sua caracterização e diferenciação para células do miocárdio, especialmente cardiomyocytes, permanece um desafio técnico. No presente estudo, nós fornecemos um método simples para o isolamento, caracterização e diferenciação do CSCs do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de gradiente de densidade para a isolação do CSCs, onde o coração é digerido por uma solução II de colagenase de 0,2%. Para caracterizar os CSCs isolados, avaliamos a expressão de marcadores de CSCs/cardíaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcadores de pluripotência/stemness OCT4, SOX2 e Nanog. Nós também determinou o potencial de proliferação de CSCs isolados cultivo-os em um prato de Petri e avaliando a expressão do marcador de proliferação Ki-67. Para avaliar o potencial de diferenciação de CSCs, selecionamos sete a dez dias cultivada CSCs. Estamos transferindo-os para uma nova placa com meio de diferenciação de casos. Eles são incubados em um incubador de cultura celular durante 12 dias, enquanto meio de diferenciação é trocado a cada três dias. Os CSCs diferenciados expressam marcadores de casos específicos: actinin e troponina eu. Assim, CSCs isolados com este protocolo tem stemness e marcadores cardíacos, e eles têm um potencial de proliferação e diferenciação em direção a linhagem de casos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doença isquêmica do coração, incluindo infarto do miocárdio (MI), é das principais causas de morte em torno do mundo1. Terapia de células-tronco para regenerar o miocárdio morto continua a ser uma grande abordagem para melhorar a função cardíaca de um MI coração2,3,4,5. Diferentes tipos de células-tronco utilizaram para reabastecer o miocárdio morto e para melhorar a função cardíaca de um coração de MI. Eles podem ser amplamente classificados em células-tronco células-tronco embrionárias6 e adulto. Em células-tronco adultas, têm sido utilizados vários tipos de células-tronco, tais como células mononucleares de medula óssea-derivado7,8, células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea9,10, tecido adiposo 11,12e cordão umbilical13e CSCs14,15. Células-tronco podem promover regeneração cardíaca através do sistema endócrino e/ou parácrina ações16,17,18,19,20. No entanto, uma limitação importante da terapia de células-tronco está obtendo um número adequado de células-tronco que podem proliferar e/ou diferenciar-se em direção a uma linhagem cardíacas específicas21,22. Transplante autólogo e alogênico de células-tronco é um desafio importante na terapia de células-tronco9. CSCs poderiam ser uma melhor abordagem para regeneração cardíaca porque eles são derivados de coração e eles podem ser mais facilmente diferenciados em linhagens cardíacas do que as células-tronco não cardíaca. Assim, reduz o risco de teratoma. Além disso, os efeitos de glândula endócrina e parácrina da CSCs, tais como exosomes e miRNAs derivados os CSCs, poderiam ser mais eficazes do que outros tipos de células-tronco. Assim, CSCs continua a ser uma opção melhor para regeneração cardíaca23,24.

Embora CSCs são um candidato melhor para regeneração cardíaca em um coração MI devido a sua origem cardíaca, uma limitação principal com CSCs é menos rendimento devido à falta de um método eficiente de isolamento. Uma outra limitação pode ser a diferenciação prejudicada dos CSCs em direção cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Para contornar essas limitações, é importante desenvolver um protocolo eficiente para CSC isolamento, caracterização e diferenciação no sentido de linhagem cardíaca. Não há nenhum marcador único aceitável para CSCs e um específico da pilha-superfície marcador de isolamento de CSCs produz menos CSCs. Aqui, podemos padronizar uma abordagem simples centrifugação gradiente para isolar CSCs partir o coração de rato que é cost-effective e resulta em um maior rendimento do CSCs. Estes CSCs isolados podem ser selecionados para marcadores de superfície celular específicos por fluorescência-ativado da pilha curto-circuito. Além do isolamento de CSCs, nós fornecemos um protocolo para CSC cultura, caracterização e diferenciação no sentido de linhagem de casos. Assim, apresentamos um método elegante para isolar, caracterizar, cultura e diferenciar CSCs de corações de rato adulto (Figura 5).

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A habitação, anestesia e sacrifício de ratos foram realizados seguindo o protocolo aprovado IACUC do centro médico da Universidade de Nebraska.

1. materiais

  1. Uso 10 a 12-semanas C57BL/6J preto camundongos machos, mantidos internamente à instalação de animais institucional, para o isolamento de CSCs. CSCs podem também ser isolado de ratos fêmeas não-grávidas.
  2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, bem tesoura cirúrgica, pinça de haste curvada e uma lâmina cirúrgica, por autoclavagem-los antes da eutanásia do mouse.
  3. Preparar os buffers de isolamento CSC em uma condição esterilizada e armazená-los em 4 ° C no gelo. Esses buffers incluem polysucrose e uma solução de diatrizoate de sódio ajustada para uma densidade de 1,077 g/mL, Dulbecco incompleta modificado médio da águia, do 1 x presunto balanceamento de solução salina (HBSS) e cultura-grau 1 x tampão fosfato salino (PBS) da pilha. Prepare uma solução 1% colagenase II estoque (filtrada e esterilizada) e uma solução de trabalho de 0,2% em HBSS.
  4. Mantenha os materiais de cultura de tecidos na condição esterilizada na biossegurança do gabinete, incluindo um prato de Petri de 10 mm, uma placa 6, uma placa 24, T-25 e T-75 frascos de cultura, tubos cônicos de 15 mL e 50 mL e pipetas descartáveis com 40 µm e 100 -filtros de célula µm com filtros de 0,22 µm.
  5. Esterilize a 10 µ l, 200 µ l e pontas de pipetas 1.000 µ l por autoclave.
  6. Utilize luvas de nitrilo sem pó e etanol a 70% para manter uma condição estéril durante todo o experimento.
  7. Use água sanitária 10% como um desinfetante.
  8. Use comercialmente disponível meio de manutenção do CSC e cardiomyocytes meio de diferenciação para a cultura e a diferenciação de CSCs, respectivamente.

2. método isolamento de células-tronco cardíacas

  1. Eutanásia em quatro ou cinco adulto do sexo masculino (ou feminino não grávidas) ratos utilizando uma câmara de2 CO. Consertar armas do cada rato em um cartão separado dissecação com pinos ou fitas adesivas.
  2. Pulverize o etanol a 70% sobre o mouse para se livrar dos germes externos e manter a condição esterilizada durante a colheita do coração. Fazer uma incisão com uma tesoura no meio do abdômen e cortar a pele do abdômen até o tórax em linha reta. Retire a pele de ambos os lados do corte médio para limpar a área abdominal de pele e pelos. Usando uma tesoura e pinça, corte o diafragma abaixo da caixa torácica.
  3. Abra a cavidade torácica do mouse pelo corte da caixa torácica dentro do capô. Expor o coração e remover o sangue perto do coração. Lave a área circundante do coração com PBS gelado para se livrar de qualquer sangue nas proximidades do coração.
  4. Disse o coração usando uma pinça e tesoura cirúrgica. Coloque o coração em um prato de Petri de 100mm contendo 10 mL de PBS gelado.
  5. Palpitar o coração usando pinça haste curvada e remover o sangue residual dentro do coração.
  6. Use o coração inteiro para o isolamento do CSCs.
  7. Transferi todos os quatro ou cinco corações todo para um tubo cónico de 50 mL contendo 10 mL de HBSS gelada. Mantenha o tubo no gelo até o processamento adicional.
  8. Limpe dentro e fora da Biossegurança armário com etanol a 70% para criar um ambiente esterilizado. Esterilize o tubo que contém o coração e outros materiais necessários com etanol a 70%. Coloca o tubo que contém o coração a biossegurança do armário para processamento adicional.
  9. Transferi os corações para um prato de Petri-100mm contendo 10 mL de HBSS gelada. Lave novamente os corações por palpar para remover qualquer sangue residual dentro do coração. Altere a solução HBSS depois de cada lavagem para garantir a remoção completa do sangue.
  10. Corte os corações em pedaços pequenos, usando uma tesoura cirúrgica fina ou uma lâmina cirúrgica em um prato de Petri-100mm contendo 5-7 mL de solução HBSS. Segure cada coração com um par de pinças e usar um par de tesouras cirúrgicas de bem ou uma lâmina de cortar o coração em pedaços de 2 a 4 mm. Altere a solução HBSS com frequência para garantir HBSS livre de sangue. Picar os corações na solução HBSS.
  11. Centrifugue o tecido picado em 500 x g a 4 ° C por 5 min. descartar o sobrenadante e manter a pelota.
  12. Resuspenda o pellet em 5-6 mL de solução II de colagenase de 0,2% em um tubo cónico de 50 mL. O volume de solução de colagenase deve tornar a ser quase 1.5 - a 2 vezes o volume da pelota.
    Nota: para a digestão do tecido, colagenase 0,2% eu e 2,5 U/mL de solução de dispase pode substituir colagenase 0,2% II. Use um volume quase igual de solução de dispase para a colagenase solução.
  13. Misture bem a pelota com solução a 0,2% colagenase II, agitando o tubo ou agite o tubo num agitador a 75 x g durante 45-60 min a 37 ° C. Agite o tubo vigorosamente à mão após cada 20-30 min para realçar a Lise.
  14. Triture a mistura de tecidos lisados utilizando uma pipeta sorológica 5ml e uma ponta da pipeta de 1 mL para dissociar o pedaço de tecido para a suspensão de célula única.
    Nota: Para obter a máxima recuperação dos CSCs, Triture a mistura de Lise pelo menos 5 min. Se os pedaços de tecido são relativamente grandes, corte a ponta de uma ponta da pipeta de 1 mL com tesoura ou lâmina cirúrgica e usá-lo para trituração.
  15. Pare a Lise enzimática do tecido adicionando comercialmente disponível meio de manutenção do CSC. Adicione quase 2-3x tanto meio de manutenção como o volume dos tecidos lisados na etapa 2.14.
  16. Passe a suspensão de eritrócitos digerido através de um filtro de célula de 100 µm para remover quaisquer pedaços de tecido não digerido.
  17. Repita a etapa 2.16 usando um coador de célula de 40 µm.
  18. Separe as células através de centrifugação gradiente de densidade. Para a separação de células, suavemente sobreposição igual volume do filtrado com solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio. Por exemplo, em primeiro lugar, adicionar 20 mL de solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio em um tubo cónico de 50 mL e em seguida, adicionar 20 mL do filtrado da etapa 2.17 sobre a solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio.
    Nota: Durante a polysucrose e solução de diatrizoate de sódio a 37 ° C antes de usam com as células. Adicionar ao filtrado da etapa 2.17 sobre a solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio muito lentamente e com cuidado para evitar qualquer mistura das duas soluções. Isto é considerado um passo crucial.
  19. Centrifugar o tubo contendo ambas as soluções a 500 x g por 20 min à temperatura ambiente utilizando uma centrífuga de balde de balanço. Defina o centrifugador a uma velocidade inferior de aceleração e desaceleração, para evitar misturar as duas soluções e para a separação adequada dos CSCs. Este é um passo importante no isolamento de CSC. Colocar o tubo contendo a mistura gradiente muito lentamente sem perturbação dentro da centrifuga e configurá-lo para centrifugação.
  20. Tire o casaco buffy junto com solução extra da camada superior usando uma pipeta de 1 mL ou uma pipeta Pasteur plástica em um tubo esterilizado 15 mL. Esta camada de buffy conterá os CSCs.
    Nota: Tomar precauções extras durante a pipetagem do buffy coat para não tirar a camada de solução de diatrizoate de polysucrose e de sódio, porque é tóxico para CSCs.
  21. Adicione igual volume de meio de manutenção do CSC para a suspensão de células da etapa 2,20 e misturá-lo corretamente para neutralizar o polysucrose residual e a solução de diatrizoate de sódio, se estiver presente.
  22. Centrifugar a suspensão celular acima de 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
  23. Resuspenda o pellet em 7-10 mL de meio DMEM incompleto e centrifuga-lo a 500 x g por 5 min a 4 ° C, para se livrar de qualquer polysucrose residual e a solução de diatrizoate de sódio.
  24. Colete o sedimento, que contém os CSCs purificadas.
  25. Resuspenda o pellet em 1 mL de meio de manutenção do CSC, contar o número de CSC e usar o pellet de cultura. Para contar o número de CSC, use coloração azul Trypan e um hemocytometer. Com quatro corações de ratos masculinos, o rendimento do CSCs é ~1.8 milhões.
  26. Semente do CSCs em uma placa de cultura de 6-Poços revestidos com uma solução de 0,02% gelatina contendo 0,5% de fibronectina. Uso 2 mL do meio de manutenção completa para propagação. Incube a placa de cultura numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
  27. Substitua o meio de cultura CSCs meio de manutenção do CSC completo todos os dias até o terceiro dia. Depois disso, altere o meio em dias alternados.
  28. Determine o crescimento dos CSCs, observá-los sob um microscópio.

3. cultura de manutenção e passagem de células-tronco cardíacas

  1. Cultura do CSCs isoladas em meio de manutenção disponível comercialmente. Substitua o meio de cultura com meio de manutenção fresco em dias alternados. Quando a cultura de CSC alcançou a confluência, transferi os CSCs para uma nova placa revestida com gelatina e fibronectina, como mencionado na etapa 2.26. Desanexe os CSCs cultivadas pelo buffer de dissociação enzimática da célula. Siga o protocolo padrão de dissociação celular da placa de cultura. Nesta fase, CSCs são considerados na passagem 0 palco (P0).
  2. Cultura P0 CSCs em uma gelatina nova placa revestida de fibronectina em meio de manutenção completo do CSC a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 , permitir que eles sejam confluente e então siga passo 3.1 para obter passagem 1 (P1) CSCs. loja P1 CSCs em nitrogênio líquido ou usá-los para tranforme em mentos.
  3. Sementes de 0,5 milhões de células em uma placa de 6 ou 1 milhão em T-25 para manter a cultura de CSC em seu estágio inicial.
  4. Os CSCs quando tornam-se 85% - 90% de confluencia de passagem. CSCs podem ser cultivadas em meio de manutenção até quatro a seis semanas.
    Nota: Manter a densidade de semeadura inicial dos CSCs relativamente elevadas (40% - 50%) porque, em uma menor densidade de semeadura, os CSCs podem mudar sua morfologia plana e alongada.

4. caracterização de células-tronco cardíacas

  1. Para caracterizar os CSCs culturas, observá-los sob um fago-contraste ou um microscópio de campo claro. Coloque a placa CSC-contendo no objectivo de um microscópio fluorescente. Defina a ampliação bastante baixa (10 X) para concentrar as células. Use o contraste de fase abertura para observar as células. Aumentar a ampliação de 20 X alterando a lente objetiva e o CSCs. aumento o objetivo de 40 X de imagem e imagem do CSCs. Em dois dias, os CSCs aparecem quase redondos em forma, mas o tamanho da célula aumenta com o tempo e em sete dias, os CSCs aparecem quase cilíndricos em forma (Fig. 1A - 1C).
  2. Executar imunocoloração dos CSCs com marcadores de pluripotência/stemness (OCT4, SOX2 ou Nanog), proliferação (Ki-67) (Fig. 2A - 2D) e células de origem cardíaca/progenitoras (Sca-1, NKX2-5 ou GATA4) (Figura 3A - 3C).
    1. Para a imunocoloração dos CSCs, sementes 10.000 CSCs em uma placa de cultura de 24-bem.
    2. No dia seguinte (após 18-24 h), corrigi os CSCs em 300 µ l de paraformaldeído 4% por 10 min.
    3. Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
    4. Permeabilize os CSCs com 300 µ l de 0,2% Triton X-100 diluído em PBS por 10 min.
    5. Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
    6. Realizar o bloqueio dos CSCs com 300 µ l de BSA 1% diluído em PBST (PBS + 0.1% Tween 20) ou 300 µ l de soro normal frango 10% diluído em PBST por 1h.
    7. Incubar os CSCs em 200 µ l de anticorpo primário diluído no bloqueio de solução durante a noite a 4 ° C. Dilua o anticorpo primário, como recomendado pela folha de dados de anticorpos ou conforme padronização.
    8. Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
    9. Incubar os CSCs em 200 µ l de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio (ver passo 4.2.6) por 1h à temperatura ambiente. Dilua o anticorpo secundário, como recomendado pela folha de dados de anticorpos ou conforme padronização.
    10. Lave os CSCs com 500 µ l de PBS gelado, 3x com intervalos de 5 min.
    11. Counterstain os CSCs com 200 µ l de DAPI (1 µ g/mL) diluído em PBS por 5 min.
    12. Lave os CSCs 1 x com 500 µ l de PBS gelado. Em seguida, adicione 300 µ l de PBS gelado em cada poço.
    13. Execute a imagem usando um microscópio de fluorescência. Siga as instruções de fluorescente de imagem, tais como evitar a luz direta na placa. Manter a placa de cultura sob o microscópio. Concentre-se as células em diferentes ampliações. Observar as células sob contraste de fase e/ou filtros de excitação diferentes e salvar as imagens.
    14. Armazenar a placa no escuro a 4 ° C.

5. diferenciação de células-tronco cardíacas em casos

  1. A diferenciação de CSCs, sementes 500.000 CSCs em uma placa de 6 com 2 mL de meio de manutenção de CSC comercialmente disponível durante (37 ° C).
  2. Incubar a placa contendo os CSCs numa incubadora de CO2 a 37 ° C. Permitir que o CSCs anexar e proliferar até crescimento secundário confluente. Se o meio fica amarelo, substitua o meio de cultura com meio de manutenção fresco.
  3. Na confluência de 85-90%, substituir o meio de manutenção com 2 mL de cardiomyocytes durante (37 ° C) meio de diferenciação. Incube a placa numa incubadora de CO2 a 37 ° C por até 2-3 semanas.
  4. Altere o meio de diferenciação cada 2-3 m. observar a morfologia do CSCs sob um microscópio cada vez durante o médio mudar para garantir as condições de boa cultura.
  5. Depois d 12 da cultura CSC num meio de diferenciação, imagem os CSCs para marcadores de diferenciação, seguindo um padrão immunostaining protocolo (consulte as etapas 4.2.1 - 4.2.14). Salve as imagens fluorescentes para a expressão de marcadores cardiomyocytes (Figura 4A - 4B).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No presente estudo, isolamos CSCs de corações de ratos machos C57BL/6J 10 a 12 semanas de idade. Aqui, apresentamos um método simples para CSC isolamento e caracterização utilizando marcadores de pluripotência. Também apresentamos um método elegante para diferenciação do CSC e a caracterização dos CSCs diferenciadas em direção a linhagem cardiomyocytes. Observamos uma morfologia de forma do eixo do CSCs 2 - a 3-dias-cultivadas sob um microscópio de contraste de fase (...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os passos críticos do presente protocolo de isolamento do CSC são como segue. 1) uma condição esterilizada deve ser mantida para extração de corações de ratos. Qualquer contaminação durante a extração do coração pode comprometer a qualidade do CSCs. 2) o sangue deve ser completamente removido antes de a picar o coração, que é feito por várias lavagens de todo o coração e o coração peças com solução HBSS. 3) os pedaços do coração devem ser completamente lysed em uma suspensão de célula única com solução de colagenase. 4) ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho é apoiado, em partes, por subvenções a National Institutes of Health, HL-113281 e HL116205 para Paras Kumar Mishra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CamundongosThe Jackson laboratory, EUAEstoque nº 000664
Anticorpos:
OCT4-Abcamab18976 (policlonal de coelho)OCT4-Anticorpo primário- diluição 1:100, anticorpo secundário- diluição 1:200, em solução de bloqueio
SOX2Abcamab97959 (policlonal de coelho)SOX2-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
NanogAbcamab80892 (policlonal de coelho)Anticorpo Nanog-primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
Ki67Abcamab16667 (policlonal de coelho)Ki67-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
Sca IMilliporeAB4336 (policlonal de coelho)Sca I Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (policlonal de cabra)NKX2-5-Anticorpo primário - diluição 1:50, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
GATA4Abcamab84593 (policlonal de coelho)GATA4-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (policlonal de cabra)MEF2C-anticorpo primário - diluição 1:50, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
Troponina IMilliporeMAB1691 (monoclonal de camundongo)Troponina I-anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução
de bloqueioActininaMilliporeMAB1682 (monoclonal de camundongo)Actinina-Anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
ANPMilliporeAB5490 (policlonal de camundongo)ANP-anticorpo primário - diluição 1:100, anticorpo secundário - diluição 1:200, em solução de bloqueio
Alex Fluor-488 checken anti-coelhoTecnologia de vidaRef no. A21441
Alex Fluor-594 cabra anti-coelhoLife technologyRef nº A11012
Alex Fluor-594 coelho anti-cabraLife technologyRef nº A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technologyRef nº A21200
Alex Fluor-594 checken anti-cabraLife technologyRef nº A21468
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de cultura:
CSC meio de manutençãoMilliporeSCM101Nota: Para cultura CSC, PBS ou meio DMEM incompleto foi usado para lavar as células
cardiomiócitos meio de diferenciaçãoMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NomeEmpresaNúmero de catálogo<strong>Comentários
Cell Isolation buffer:solução de
polissacarose e diatrizoato de sódio (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Colagenase ISigmaC0130
Solução de dispaseSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
Reagente de dissociação celular StemPro AccutaseThermoscientificA1110501
Outros reagentes:
BSASigmaA7030
Normal checken serumVector laboratoryS3000
DAPI solutionApplichemA100,0010Dapi, concentração de trabalho-1 µ g / mL
Trypan azulBiorad145-0013
TripsinaSigmaT4049
StemPro Accutase Reagente de Dissociação CelularThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldeídoSigma158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificLote nº 160170
EtanolThermo Scientific
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais de cultura de tecidos:
100 mm placa de PetriThermo Scientific
Placa de 6 poçosThermo Scientific
Placa de 24 poçosThermo Scientific
Balão T-25Thermo Scientific
Balão T-75Thermo Scientific
Tubo cônico de 15 mlThermo Scientific
Tubo cônico de 50 mLThermo Scientific
40 µ corante de células mFisher Scientific22363547
100 µ corante de células mFisher Scientific22363549
0.22 µ Filtro mFisher Scientific09-719C
Seringa de 10 mLBDRef no. 309604
10 µ L, 200 µ L, 1000 µ Ponteiras de pipeta LFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL pipeta de plástico descartávelThermo Scientific
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumentos
Máquina centrufugadaThermo ScientificLEGEND X1R centrífuga
EVOS microscópio Tecnologiada vida
Contador de células automatizadoBiorad
Lâmina de contagem de célulasBiorad145-0011
Auxiliar de pippteThermo ScientificS1 pipeta filler
Nome< strong>EmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrumentos cirúrgicos:
Tesoura cirúrgicaFerramenta
fina Tesoura cirúrgica finaFerramenta
Pinça de haste curvaFerramenta científica fina
Lâmina cirúrgicaFine Scientific Tool
científicacientífica fina

Referências

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  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
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