Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fatores secretados, receptores de membrana-amarrados e seus parceiros de interação são os principais reguladores da comunicação celular e início de cascatas de sinalização durante a homeostase e a doença e como tal representam alvos terapêuticos. Apesar de sua relevância, estas redes de interação permanecem significativamente sub-representados em bancos de dados atuais; Portanto, mais proteínas extracelulares não tem nenhum parceiro de vinculação documentada. Esta discrepância deve-se principalmente os desafios associados com o estudo das proteínas extracelulares, incluindo a expressão de proteínas funcionais e a fraca, baixa afinidade, interações proteína frequentemente estabelecidas entre receptores de superfície celular. A finalidade desse método é descrever a impressão de uma biblioteca de proteínas extracelulares em um formato de microarray para rastreio de interações da proteína-proteína. Para habilitar a detecção de interações fracas, é descrito um método baseado na multimerization da proteína consulta sob estudo. Acoplado a essa abordagem baseada em Microconta multimerization para multivalency de aumento, o microarray da proteína permite a detecção robusta de interações da proteína-proteína transitória em alta taxa de transferência. Este método oferece uma amostra rápida e baixo consumo-abordagem para identificação de novas interações aplicáveis para qualquer proteína extracelular. Impressão de microarray de proteína e protocolo de triagem são descritos. Esta tecnologia será útil para os investigadores procuram um método robusto para descoberta de interações da proteína no espaço extracelular.
Introdução
O método aqui analisado descreve a impressão de uma coleção de proteínas extracelulares em um formato de microarray, seguido por um método para a seleção de um alvo de interesse com esta biblioteca. Nós identificamos proteínas multimerization como um passo crucial para a deteção de interações caracterizada por afinidades de ligação baixa. Para realçar a deteção dessas interações, descrevemos um protocolo baseado em multimerization da proteína de interesse usando microbeads consulta.
Segregada e célula superfície-expresso proteínas (coletivamente denominadas proteínas extracelulares) juntamente com seus parceiros de interação são reguladores....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. geração de uma biblioteca de proteínas humanas extracelulares
- Compile uma lista de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas de interesse para criar a biblioteca de microarray de proteína. Famílias de proteínas específicas (por exemplo, a superfamília das imunoglobulinas) ou proteínas seletivamente expressaram em particular célula tipos que podem ser selecionados para o estudo.
- Para receptores de superfície celular, determine os limites do domínio extracelular (ECD), identificando o peptídeo sinal e regiões transmembranares, usando ferramentas de software. Alguns dos relevantes ferramentas, disponível gratuitamente online, são ref....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um diagrama de fluxo de trabalho para a tecnologia de microarray de proteína extracelular é mostrado na Figura 1. Uma vez que os slides de microarray que contém a biblioteca de proteína extracelular estão disponíveis, o rastreio da proteína de interesse e análise de dados pode ser concluído dentro de um dia. Muitas interações fisiologicamente relevantes entre os receptores de membrana-incorporado são caracterizadas por forças de ligação muito fraca (KD
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Um número significativo de órfãos receptores permanecem no genoma humano, e novos parceiros de interação continuam a emergir para proteínas extracelulares com ligantes anteriormente caracterizadas. Definindo as interações ligante-receptor em humanos e organismos modelo é essencial para compreender os mecanismos que determinam a comunicação celular durante a homeostase, bem como a desregulação levando a doença e, portanto, informar novos ou melhorados opções terapêuticas. Não obstante, deteção de interações proteína extra.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
B.H., Renée-R e n. m-M. são empregados da Genentech e acções próprias no grupo Genentech Inc. / Roche.
Agradecimentos
Agradecemos Philamer Calses e Kobe Yuen criticamente a ler o manuscrito. Nós somos gratos a Randy Yen para aconselhamento técnico excelente.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ultra Puro MB Grade glicerol | USB Corporation | 56-81-5 | Armazenamento de proteínas |
| SeptoMark bloqueando tampão | Zeptosens | BB1, 90-40 | Lâminas de microarray de tampão de bloqueio |
| Albumina de soro bovino | Roche | 03-117-957-001 | Controle de slides para encaixe de máscara (opcional) |
| Placas multipoços de polipropileno | Greiner Bio One | 82050-678 Armazenamento de | proteínas |
| Placas multipoços de polipropileno | Arrayit | MMP384 | Impressão de slides |
| NanoPrint LM60 ou contato similar microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, ou microarrayer de contato similar | Impressão de slides |
| Micro pinos de detecção | Arrayit | Micro pinos de detecção | Estação |
| de bloqueio ZeptoFOG Zeptosens | Estação de bloqueio Zeptosens, 1210 | Bloquear slides após a impressão | |
| Leite em pó desnatado | Thermo Fisher | LP0031 | Solução de bloqueio |
| Corrediça de vidro revestida com epóxi | Nextrion Slide E | 1064016 | Corrediças de microarray |
| Suporte de vidro e conjunto de rack de lâminas | Wheaton | 900303 | Armazenamento de lâminas |
| Corante monorreativo Cy5 GE | Healthcare | PA23031 | Rotulagem de albumina |
| Corante monorreativo Cy5 | GE Healthcare | PA25001 | Rotulagem de IgG humana |
| Coluna de dessalinização Pro-spin | Princeton Separações | CS-800 | Remove corante livre |
| Selo adesivo de folha de alumínio | AlumaSeal | F-384-100 | Placas de estoque |
| de vedação Frascos criogênicos de polipropileno Frascos | Corning | 430658 | Master para armazenamento de biblioteca de proteínas |
| Microesferas de proteína | A Miltenyi | 120-000-396 | Consulta multimerização de proteínas |
| IgG humana | Jackson Immunoresearch | & nbsp; 009-000-003 | IgG irrelevante para marcação da |
| Proteína A | Sigma | P7837 | Bloqueio de lâminas de microarray |
| Estação de hibridização, a-Hyb ou similar | Miltenyi | , a-Hyb ou similar | Processamento automatizado de microarray (opcional) |
| Scanner GenePix 4000B ou similar | Dispositivos Moleculares | Scanner GenePix 4000B ou | similar Digitalização de lâminas |
| GenePix Pro ou software de extração de dados equivalente | Molecular Devices | GenePix Pro ou software de extração de dados equivalente | Processamento de dados |
| Sinal P4.1 | DTU Bioinformática, Universidade Técnica da Dinamarca | software on-line | Ferramenta de previsão para determinar a presença e localização de locais de clivagem de peptídeos de sinal |
| Servidor TMHMM 2.0 | DTU Bioinformática, Universidade Técnica da Dinamarca | software on-line | Previsão de hélices transmembranares em proteínas |
| Phobius | Software | on-line | Uma topologia transmembrana combinada e preditor de peptídeos de sinal |
| TOPCONS | Software on-line | Universidade de Estocolmo | Previsão de topologia de membrana e peptídeos de sinal |
Referências
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interact....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
