Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Abstract

Fatores secretados, receptores de membrana-amarrados e seus parceiros de interação são os principais reguladores da comunicação celular e início de cascatas de sinalização durante a homeostase e a doença e como tal representam alvos terapêuticos. Apesar de sua relevância, estas redes de interação permanecem significativamente sub-representados em bancos de dados atuais; Portanto, mais proteínas extracelulares não tem nenhum parceiro de vinculação documentada. Esta discrepância deve-se principalmente os desafios associados com o estudo das proteínas extracelulares, incluindo a expressão de proteínas funcionais e a fraca, baixa afinidade, interações proteína frequentemente estabelecidas entre receptores de superfície celular. A finalidade desse método é descrever a impressão de uma biblioteca de proteínas extracelulares em um formato de microarray para rastreio de interações da proteína-proteína. Para habilitar a detecção de interações fracas, é descrito um método baseado na multimerization da proteína consulta sob estudo. Acoplado a essa abordagem baseada em Microconta multimerization para multivalency de aumento, o microarray da proteína permite a detecção robusta de interações da proteína-proteína transitória em alta taxa de transferência. Este método oferece uma amostra rápida e baixo consumo-abordagem para identificação de novas interações aplicáveis para qualquer proteína extracelular. Impressão de microarray de proteína e protocolo de triagem são descritos. Esta tecnologia será útil para os investigadores procuram um método robusto para descoberta de interações da proteína no espaço extracelular.

Introduction

O método aqui analisado descreve a impressão de uma coleção de proteínas extracelulares em um formato de microarray, seguido por um método para a seleção de um alvo de interesse com esta biblioteca. Nós identificamos proteínas multimerization como um passo crucial para a deteção de interações caracterizada por afinidades de ligação baixa. Para realçar a deteção dessas interações, descrevemos um protocolo baseado em multimerization da proteína de interesse usando microbeads consulta.

Segregada e célula superfície-expresso proteínas (coletivamente denominadas proteínas extracelulares) juntamente com seus parceiros de interação são reguladores....

Protocol

1. geração de uma biblioteca de proteínas humanas extracelulares

1. Compile uma lista de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas de interesse para criar a biblioteca de microarray de proteína. Famílias de proteínas específicas (por exemplo, a superfamília das imunoglobulinas) ou proteínas seletivamente expressaram em particular célula tipos que podem ser selecionados para o estudo.
2. Para receptores de superfície celular, determine os limites do domínio extracelular (ECD), identificando o peptídeo sinal e regiões transmembranares, usando ferramentas de software. Alguns dos relevantes ferramentas, disponível gratuitamente online, são ref....

Results

Um diagrama de fluxo de trabalho para a tecnologia de microarray de proteína extracelular é mostrado na Figura 1. Uma vez que os slides de microarray que contém a biblioteca de proteína extracelular estão disponíveis, o rastreio da proteína de interesse e análise de dados pode ser concluído dentro de um dia. Muitas interações fisiologicamente relevantes entre os receptores de membrana-incorporado são caracterizadas por forças de ligação muito fraca (K_D

Discussion

Um número significativo de órfãos receptores permanecem no genoma humano, e novos parceiros de interação continuam a emergir para proteínas extracelulares com ligantes anteriormente caracterizadas. Definindo as interações ligante-receptor em humanos e organismos modelo é essencial para compreender os mecanismos que determinam a comunicação celular durante a homeostase, bem como a desregulação levando a doença e, portanto, informar novos ou melhorados opções terapêuticas. Não obstante, deteção de interações proteína extra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Puro MB Grade glicerol	USB Corporation	56-81-5	Armazenamento de proteínas
SeptoMark bloqueando tampão	Zeptosens	BB1, 90-40	Lâminas de microarray de tampão de bloqueio
Albumina de soro bovino	Roche	03-117-957-001	Controle de slides para encaixe de máscara (opcional)
Placas multipoços de polipropileno	Greiner Bio One	82050-678 Armazenamento de	proteínas
Placas multipoços de polipropileno	Arrayit	MMP384	Impressão de slides
NanoPrint LM60 ou contato similar microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, ou microarrayer de contato similar	Impressão de slides
Micro pinos de detecção	Arrayit	Micro pinos de detecção	Estação
de bloqueio ZeptoFOG Zeptosens	Estação de bloqueio Zeptosens, 1210	Bloquear slides após a impressão
Leite em pó desnatado	Thermo Fisher	LP0031	Solução de bloqueio
Corrediça de vidro revestida com epóxi	Nextrion Slide E	1064016	Corrediças de microarray
Suporte de vidro e conjunto de rack de lâminas	Wheaton	900303	Armazenamento de lâminas
Corante monorreativo Cy5 GE	Healthcare	PA23031	Rotulagem de albumina
Corante monorreativo Cy5	GE Healthcare	PA25001	Rotulagem de IgG humana
Coluna de dessalinização Pro-spin	Princeton Separações	CS-800	Remove corante livre
Selo adesivo de folha de alumínio	AlumaSeal	F-384-100	Placas de estoque
de vedação Frascos criogênicos de polipropileno Frascos	Corning	430658	Master para armazenamento de biblioteca de proteínas
Microesferas de proteína	A Miltenyi	120-000-396	Consulta multimerização de proteínas
IgG humana	Jackson Immunoresearch	& nbsp; 009-000-003	IgG irrelevante para marcação da
Proteína A	Sigma	P7837	Bloqueio de lâminas de microarray
Estação de hibridização, a-Hyb ou similar	Miltenyi	, a-Hyb ou similar	Processamento automatizado de microarray (opcional)
Scanner GenePix 4000B ou similar	Dispositivos Moleculares	Scanner GenePix 4000B ou	similar Digitalização de lâminas
GenePix Pro ou software de extração de dados equivalente	Molecular Devices	GenePix Pro ou software de extração de dados equivalente	Processamento de dados
Sinal P4.1	DTU Bioinformática, Universidade Técnica da Dinamarca	software on-line	Ferramenta de previsão para determinar a presença e localização de locais de clivagem de peptídeos de sinal
Servidor TMHMM 2.0	DTU Bioinformática, Universidade Técnica da Dinamarca	software on-line	Previsão de hélices transmembranares em proteínas
Phobius	Software	on-line	Uma topologia transmembrana combinada e preditor de peptídeos de sinal
TOPCONS	Software on-line	Universidade de Estocolmo	Previsão de topologia de membrana e peptídeos de sinal