Neste estudo, nós modificamos um método experimental existente para obter resultados mais reprodutíveis, estabelecendo um modelo do rato (MCAO) de oclusão de artéria cerebral média. A administração oral de Glycyrrhizae Radix et extrato de metanol de rizoma (GR) (GRex), após indução de acidente vascular cerebral, diminuiu significativamente o volume de infarto total em relação ao grupo controle não tratado.
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Artigo de método
Avaliar efeitos Neuroprotective do Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extrair usando um modelo de Mouse de oclusão transitória de artéria Cerebral média
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Isquemia seguida de reperfusão do fluxo sanguíneo cerebral após um acidente vascular cerebral leva à morte das células nervosas e perda de tecido cerebral. O modelo animal mais comumente usado para estudar o curso é o modelo de oclusão (MCAO) da artéria cerebral média. Estudos anteriores relataram tamanhos diferentes de infarto mesmo quando a mesma espécie de animal experimental foi utilizada em condições similares MCAO. Portanto, nós desenvolvemos um método experimental melhorado para resolver esta discrepância. Os ratos foram submetidos a MCAO usando um filamento como o material de oclusão para imitar as condições do acidente vascular cerebral humano e espessura do filamento foi otimizada para estabelecer mais volume de infarto pode ser reproduzido. Camundongos tratados com um metanol extrair do Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex) após a indução de acidente vascular cerebral mostrou um volume de infarto total significativamente diminuída e aumento do número de sobreviventes de células em relação ao grupo controle não tratado. Este modificado com êxito o protocolo experimental e reproducibly demonstrado o efeito benéfico de GRex sobre acidente vascular cerebral isquêmico.
Introdução
Danos cerebrais causados por isquemia e reperfusão do fluxo sanguíneo cerebral leva à morte das células nervosas e perda de tecido cerebral. Este tipo de dano cerebral continua a aumentar com o aumento da prevalência de doenças cerebrovasculares, devido à propagação de doenças metabólicas como obesidade, hipertensão arterial e diabetes mellitus1,2. O número absoluto de pacientes idosos com acidente vascular cerebral tem aumentado drasticamente em todo o mundo, e o custo da assistência médica para estes pacientes, que muitas vezes são deixados com deficiência a longo prazo, é um grande fardo societal. Portanto, a deficiência secundária deve ser atenuada tanto quanto possível para reduzir o encargo económico1,2.
O modelo de roedor mais comumente usado de infarto cerebral é o modelo de oclusão (MCAO) de artéria cerebral média (MCA), no qual o MCA é obstruído com um filamento de silicone revestido cirúrgico sutura para bloquear o fluxo sanguíneo, causando acidente vascular cerebral isquêmico3, 4. usando um filamento, como o material de oclusão permite o controle do tempo de oclusão e permanência manipulando-se a duração da inserção do filamento intra-luminal.
Estudos anteriores mostraram que, mesmo quando é usado o mesmo modelo MCAO de roedores, o volume total de infarto cerebral varia entre experimentos, causando baixa reprodutibilidade dos estudos. Para melhorar a reprodutibilidade, nós aperfeiçoamos a espessura do filamento mint utilizado no experimento. Os resultados de um estudo preliminar sobre o período de isquemia cerebral e infarto induzido mostrou que mais de 60 min e um período isquêmico permitido região volumétrica de danificado tecido cerebral para ser observada e quantificada.
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), também conhecida como alcaçuz, consiste nas raízes secas e rizomas de Glycyrrhiza uralensis e g. glabra. Ela tem sido usada na medicina tradicional chinesa e coreana para diversos fins, inclusive como um aditivo alimentar e medicinalmente5,6,7.
Em um anterior estudo8, pré-tratamento com GR extrato de metanol (GRex) mostrou um efeito antiapoptose em ratos MCAO, incluindo significativa prevenção da diminuição na expressão de proteínas de linfoma de célula B 2 (Bcl-2) e Bcl extra-grande (Bcl-xL). Este estudo foi realizado para melhorar a reprodutibilidade do modelo convencional de rato MCAO avaliando sua eficiência em determinar se o tratamento pós-infarto com GRex efetivamente reduziu o volume de infarto em dano cerebral induzida por MCAO.
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Protocolo
Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nacional de Pusan (número de aprovação, PNU-2016-1087). Uma visão geral gráfica deste estudo é mostrada na Figura 1.
1. preparação e administração de GRex
Nota: O GR utilizado neste estudo foi comprado de uma empresa farmacêutica comercial.
- Coloque 200 g de GR em 2.000 mL de metanol e incubar a temperatura ambiente (25 ° C) por 5 dias.
- Filtrar a mistura usando papel de filtro com 0,26 mm de espessura e tamanho de poros de 5 µm e em seguida, remover o sobrenadante. Adicione 1.000 mL de metanol ao resíduo GR e filtrar novamente.
- Combinar os dois sobrenadantes, filtrar por papel de filtro, concentrar-se sob vácuo e em seguida congela o resíduo para produzir GRex.
- Dissolver o GRex em dimetilsulfóxido (DMSO), diluir com soro fisiológico 0,9% e filtrar através de um filtro de seringa de 0,45 µm. Em seguida, ajuste a concentração final de DMSO a < 5%.
- Administre GRex (300 mg/kg de peso corporal) 1 h após a reperfusão de MCAO via oral gavage. Administre DMSO diluída em soro fisiológico (10 mL/kg de peso corporal) só para o grupo normal e grupos de controle, respectivamente.
Nota: A concentração de GRex usado neste experimento foi determinada de acordo com a concentração que foi ativa através de nossa anterior estudo8.
2. Mouse modelo de MCAO
- Camundongos C57BL/6 machos de uso com idades entre 6 semanas e pesando 22-25 g. fornecer a todos os animais com acesso gratuito ao chow padrão e água e casa-los em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 1 ° C) e um ciclo claro/escuro de 12 h.
- Divida os ratos em grupos de seis ratos cada, que devem consistir de GRex grupos de tratamento, controle e operação normal.
- Realizar a cirurgia MCAO (modificação do método de Koizumi et al 9) no controle e tratamento de GRex grupos usando um estereoscópio.
- Induzi a anestesia por inalação em ratos usando 2% de isoflurano em 70% N2O e 30% O2. Anestesia é considerada suficiente quando o mouse se torna não responde a estímulos mecânicos aplicados a sua cauda. Manter a temperatura do corpo dos ratos a 36,5 ± 0,5 ° C, com um corpo de temperatura-terra arrendada cobertor conectado a um termômetro.
- Remover todos os pelos no peito e pescoços dos ratos de corte seguido pelo uso de creme depilatório, desinfectar o local cirúrgico da pele com esfoliante de betadine, alternando com álcool por duas vezes e então fazem uma incisão de aproximadamente 2 cm de comprimento com cirúrgica lâmina no centro do pescoço. Cuidadosamente, isole a artéria carótida comum esquerda (LCCA), artéria carótida externa e o ramo da artéria carótida interna de tecidos conectivos circundantes.
- Ligar a artéria carótida externa e artéria carótida comum com uma sutura cirúrgica (sutura de seda 4-0, half hitch nó) para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo na artéria carótida interna durante a operação.
- Inserir uma sutura de silicone revestido de nylon (monofilamento 8-0, 11 mm de comprimento) através da artéria carótida interna para a origem do MCA a esquerda. Ajustar a espessura da parte do silicone revestido do filamento de uma gama de 0,10-0.12 mm.
- Medir a diminuição do fluxo sanguíneo cerebral relativo (rCBF) no MCA usando um medidor de fluxo Doppler laser. MCAO será confirmada quando o rCBF é mantida no < 20% dos valores de condição de descanso durante todo o período de isquemia.
- Corrigir o filamento inserido para o vaso sanguíneo para 2 h, enquanto a artéria cerebral é obstruída e em seguida, Retire cuidadosamente o filamento para restaurar o fluxo de sangue para 22 h de reperfusão. Sutura da pele por costura em 5 lugares (sutura de seda 3-0, dois engates meio nó) e permitir que cada mouse para despertar da anestesia.
- No grupo normal, realizar uma operação de Souza, seguindo o mesmo procedimento acima (até 2.4), com a seguinte exceção. Ligar a artéria carótida comum e suturar a incisão no músculo e pele.
3. a medição do Volume de tecido cerebral danificado
- Após eutanásia dos ratos para medição de danos cerebrais com inalação de CO2 , impostos especiais de consumo o mouse cérebros 24 h após o início da MCAO usando uma tesoura cirúrgica íris e pinça angular.
- Depois de retirar a cabeça com uma tesoura, fazer uma incisão na pele na linha média da cabeça virar a pele do crânio.
- Quebrar os ossos parietais com pinça angular, descascando dura matéria ao mesmo tempo e então isolar o cérebro cuidadosamente do crânio.
- Corte o tecido excisado em seções (1 mm de espessura) usando uma matriz de cérebro de rato e em seguida mancha as seções para 17 min em uma solução de cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium de 2% (TTC).
- Corrigir as seções em formol a 10% pelo menos 2h e então fotografá-los usando uma câmera digital. TTC será observado para manchar o tecido viável vermelha enquanto que as áreas de necrose será brancas.
- Analisar e quantificar a área de infarto cerebral de cada seção usando o ImageJ.
4. hematoxilina e eosina (H & E) e cresilo coloração violeta de cortes histológicos
- Eutanásia por inalação de CO2 em ratos para estudo histológico e perfundi-los transcardially com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS), seguido por 10 mL de paraformaldeído 4% (PFA). Isolar o cérebro usando o mesmo procedimento acima (3.1) e mergulhe o cérebro em 10 mL de 30% de sacarose durante a noite.
- Incorporar o tecido cerebral no ideal da temperatura de corte (OCT) composto e cortá-lo em seções de 15 µm de espessura usando um criostato. Monte as seções em lâminas de vidro, seguidas de coloração com hematoxilina e eosina (H & E) ou cresilo violetas.
- Imergir as lâminas de vidro em etanol a 80% por 1 min, seguido de coloração na solução de hematoxilina por 5 min.
- Mergulhe os slides em álcool ácido 1% duas vezes, mergulhe na solução saturada de carbonato de lítio por 30 s, lave com água da torneira por 30 s e em seguida corante de contraste em solução de eosina por 30 s.
- Lavar as lâminas em água da torneira, mergulhe em 95% e etanol absoluto consecutivamente.
- Secar ao ar livre os slides, eliminá-los em xilol pelo menos 10 min e montar as lamelas usando o meio de montagem.
- Coloque as lâminas de vidro em um slide mais quente pelo menos 1 h, seguido de imersão em etanol a 50% diluída com clorofórmio durante a noite.
- Mancha os slides com violeta de cresilo 0,1% por 10 min em forno seco de 40 ° C.
- Mergulhe em etanol a 95% por 30 min e, em seguida, desidrata-se em etanol absoluto por 2 vezes.
- Clear 2 vezes em xilol por 5 min e, em seguida, montar com meio de montagem após a secagem do ar.
- Usando um microscópio, observe as alterações histológicas que ocorreram após a lesão cerebral induzida por MCAO.
5. análise estatística
- Expressar os resultados experimentais como meios ± desvio-padrão e determinar a significância estatística entre os grupos usando um só de ida de análise de variância (ANOVA) seguido de análise post hoc de Tukey usando um software de análise de dados.
- Definir a significância estatística em um p-valor < 0,05.
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Resultados
O grupo normal de operação, sem infarto cerebral observa-se Considerando que no grupo controle, observa-se uma gama relativamente ampla de áreas danificadas. Nos ratos, 300 mg/kg administrado GRex no grupo modelo MCAO, uma redução estatisticamente significativa na área danificada é observada (Figura 2).
As alterações histológicas são investigadas pela coloração de seções de isquemia cerebral com H &...
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Discussão
Com o aumento da prevalência de doenças metabólicas como hipertensão crônica, diabetes e hiperlipidemia, quais são os principais fatores de risco para AVC, tratamento e prevenção de acidente vascular cerebral tornaram-se uma importante área de pesquisa médica12, 13. déficits na linguagem e movimento após um acidente vascular cerebral estão fortemente correlacionados com o grau de dano ao tecido14 no cérebro e resultar em uma pobre qualidad...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Não aplicável.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Coreia | Glycyrrhizae Radix et Rhizoma | |
| Papel de filtro qualitativo | Advantec | Papel de filtro nº 2 | Papel de filtro qualitativo |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418-250ML | Dimetilsulfóxido (DMSO) |
| Filtro de seringa (0,45 µ m) | Filtro | Sigma CLS431220 | (0,45 µ m) |
| Microscópio Estéreo | Leica | M50 | Microscópio Estéreo |
| Microscópio Estéreo | Nikon | SMZ745 | Microscópio Estéreo |
| Laser Doppler | Moor Instrumento | moorVMS-LDF | Laser Doppler |
| Mesa com N2O& Sistema de medidor de vazão de O2 | Harvard Appratus | 34-1352 | Suporte de mesa de anestesia com N2O& Sistema de medidor de vazão de O2 |
| Sistema de monitoramento homeotérmico | Harvard Appratus | 55-7020 | Sistema de monitoramento homeotérmico |
| Câmera digital | Canon | Eos-M2 | Câmera digital |
| Criostato | Leica | CM3050S | Microscópio criostato |
| Carl Zeiss | Zeiss Axio | ||
| Microscópio Análise de dados | Systat Software Inc. | SigmaPlot versão 12 | Análise de |
| Dados Análise de Dados | NIH Image | ImageJ | Análise de Dados |
| Dieta de rato | Doo Yeol Biotech | Ração padrão para roedores | Dieta de rato |
| Isoflurano | JOONGWAE | A02104781 | Isoflurano |
| Isoflurano | TROIKAA | ISOTROY 100 | Isoflurano |
| Sutura de seda (4-0 Seda preta) | AILEE | SK47510 | Sutura de seda (4-0 Seda preta) |
| Sutura de seda (3-0 Seda branca) | Sutura de seda Baekjae | 57 | (3-0 Seda branca) |
| Sutura de nylon (monofilamento 8-0) | AILEE | NB825 | Sutura de nylon (monofilamento 8-0) |
| Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) | Sigma | T8877-25G | Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) |
| Formalina (solução de formaldeído) | JUNSEI | 69360-1263 20KG | Formalina (solução de formaldeído) |
| Hematoxilina (Harris Hematoxilina) | YD Diagnostics | EasyStain | Hematoxilina (Harris Hematoxilina) |
| Eosina (Solução de Eosina Y a 1%) | MUTO PURE CHEMICALS | 3200-2 | Eosina (Solução de 1% de Eosina Y) |
| Violeta de Cresil (acetato) | Sigma | C5042-10G | Violeta de Cresil (acetato) |
| Paraformaldeído | Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sacarose | JUNSEI | 31365-0350 1KG | Sacarose |
| Temperatura de corte ideal (OCT) composto | Scigen | 4583 | Temperatura de corte ideal (OCT) composto |
| Faca de dissecação Ferramentas de | ciência fina | 10055-12 | Faca de dissecação |
| # 4 Fórceps | de ciências finas | 11241-30 | # 4 Fórceps |
| # 5 Fórceps | Ferramentas de ciências finas | 11254-20 | # 5 Fórx |
| # 6 Fórceps | Fine Science Tools | 11260-20 | # 6 Fórx |
| # 7 Fine Forcep | Fine Science Tools | 11274-20 | # 7 Pinça Fina |
| Tesoura Cirúrgica | Fine Science Tools | 14001-12 | Tesoura |
| Cirúrgica Tesoura Bonn Extra Fina | Ferramentas de Ciências Finas | 14084-08 | Tesoura Bonn Extra Fina |
| Moria Pascheff-Wolff Spring Tesoura | Fine Science Tools | 15371-92 | Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors |
| Vessel Dilating Forcep | Fine Science Tools | 18153-11 | Vessel Dilating Forcep |
Referências
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Reimpressões e permissões
