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Artigo de método

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

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DOI:

10.3791/58455

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8 de novembro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Resumo

Microdialysis é uma técnica bem estabelecida neurociência que correlaciona as alterações de substâncias neurologicamente activas difusão no espaço intersticial do cérebro com o comportamento e/ou com o resultado específico de uma patologia (por exemplo, convulsões para a epilepsia). Ao estudar a epilepsia, a técnica do microdialysis é frequentemente combinada com a curto prazo ou mesmo a longo prazo vídeo-Eletroencefalografia (EEG de monitoramento para avaliar a frequência de apreensão espontânea, severidade, progressão e clustering). O combinado microdialysis-EEG baseia-se na utilização de vários métodos e instrumentos. Aqui, realizamos na vivo microdialysis e contínua de vídeo-EEG gravação ao monitor glutamato e aspartato de vazão ao longo do tempo, em diferentes fases da história natural da epilepsia em um modelo do rato. Esta abordagem combinada permite o emparelhamento das mudanças na versão do neurotransmissor com estágios específicos do desenvolvimento da doença e da progressão. A concentração de aminoácidos do dialisato foi determinada por cromatografia líquida. Aqui, descrevemos os métodos e as principais medidas de precaução devem tomar durante no vivo microdialysis de estrutura de tópicos-EEG, com particular atenção para a cirurgia estereotáxica, estimulação basal e alto de potássio durante microdialysis, profundidade eletrodo de EEG gravação e análise de cromatografia líquida de alta eficiência de aspartato e glutamato no dialisato. Esta abordagem pode ser adaptada testar uma variedade de drogas ou doenças induzidas por alterações das concentrações fisiológicas de aspartato e glutamato no cérebro. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, pode ser ainda mais usado para testar diferentes moléculas solúveis quando empregando gravação de EEG, ao mesmo tempo.

Introdução

Para fornecer insights sobre o comprometimento funcional da mediada por glutamato excitatório e neurotransmissão inibitória gabaérgica, resultando em convulsões espontâneas em epilepsia do lobo temporal (TLE), nós sistematicamente monitorada concentrações extracelulares de GABA1 e depois do curso os níveis de glutamato e aspartato2 por microdialysis no hipocampo ventral de ratos nos vários pontos de tempo da doença natural, ou seja, durante o desenvolvimento e progressão da epilepsia. Aproveitamos o modelo TLE pilocarpina em ratos, que imita a doença com grande precisão em termos de mudanças comportamentais, eletrofisiológicos e histopatológico3,4 e nós correlacionada à concentração do fluído de amino ácidos para suas diferentes fases: fase aguda após o insulto eletrofisiolÃ, a fase de latência, o tempo da primeira convulsão espontânea e a crônica phass5,6,7. Emoldurando as fases da doença foi habilitado pelo acompanhamento a longo prazo de vídeo-EEG e EEG preciso e caracterização clínica de convulsões espontâneas. Aplicação da técnica microdialysis associado com monitoramento de vídeo-EEG a longo prazo permitiu-na propor hipóteses mecanicistas para neuropatologia TLE. Em resumo, a técnica descrita neste manuscrito permite o emparelhamento de alterações neuroquímicas dentro de uma área do cérebro definidos com o desenvolvimento e progressão da epilepsia em um modelo animal.

Dispositivos emparelhados, compostos de um eletrodo de profundidade justaposto a uma microdialysis cânula, muitas vezes são empregados em estudos de investigação de epilepsia onde alterações em neurotransmissores, seus metabólitos ou substratos de energia devem ser correlacionadas com a atividade neuronal. Na maioria dos casos, é utilizado em livremente, comportando-se os animais, mas também pode ser conduzida de forma semelhante em seres humanos, por exemplo, na categoria fármaco-resistente pacientes epilépticos submetidos a investigação de eletrodo de profundidade antes da cirurgia8. Gravação de EEG e coleção do fluído podem ser realizada separadamente (por exemplo, implantar o eletrodo em um hemisfério e o microdialysis sonda em outro hemisfério, ou mesmo realizando o microdialysis em um grupo de animais durante a execução o único EEG em outro grupo de animais). No entanto, os eletrodos de acoplamento para sondas pode ter múltiplas vantagens: simplifica a cirurgia estereotáxica, limita o dano tecidual para apenas um hemisfério (enquanto o outro, deixando intacto, como um controle para estudos histológicos) e homogeneiza os resultados como estes são obtidos a partir da mesma região do cérebro e o mesmo animal.

Por outro lado, a preparação do dispositivo acoplado microdialysis sonda-eletrodo requer habilidade e tempo se for feito em casa. Um podia passar quantidades relativamente elevadas de dinheiro se tiver comprado no mercado. Além disso, quando microdialysis sondas (sonda dicas são tipicamente 200-400 µm de diâmetro e 7 a 12 mm de comprimento)9e eletrodos de EEG (pontas de eletrodo são geralmente de 300 a 500 µm de diâmetro e o tempo suficiente para alcançar a estrutura cerebral de juros10) são acoplado, o dispositivo montado representa um objeto relativamente pesado e volumoso, de um lado da cabeça, que é problemático para animais e propenso a ser perdidos, especialmente quando está ligado a bomba de diálise e o sistema de gravação de EEG de arame duro. Este aspecto é mais relevante em animais epilépticos que são difíceis de lidar e menos adaptável para as sessões do microdialysis. Técnicas cirúrgicas adequadas e cuidados pós-operatórios adequados podem resultar em implantes de longa duração que causam desconforto animal mínimo e devem ser perseguidos por combinatória microdialysis-EEG experimentos10,11, 12.

As vantagens e limitações da técnica microdialysis foram examinadas em pormenor pelos muitos neurocientistas. Sua principal vantagem sobre outras na vivo perfusão técnicas (por exemplo, fluxo rápido push-pull ou perfusão cortical Copa) é um pequeno diâmetro da sonda que cobre uma área relativamente precisa de interesse13,14, 15. Em segundo lugar, a membrana do microdialysis cria uma barreira física entre o tecido e o perfusato; Portanto, substâncias de alto peso molecular não cruzar e não interfiram com a análise de16,17. Além disso, o tecido é protegido contra o fluxo turbulento do perfusato18. Outra vantagem importante é a possibilidade de modificar o fluxo de perfusato para maximizar a concentração do analito no perfusato (ou seja, o processo de microdialysis pode ser bem definido matematicamente e podem ser modificado para produzir alto concentração do analito na amostra)19. Finalmente, a técnica pode ser usada para infundir a drogas ou substâncias farmacologicamente activas no tecido de interesse e para determinar o seu efeito no local da intervenção20. Por outro lado, o microdialysis tem um tempo de resolução limitada (normalmente mais de 1 min devido ao tempo necessário para a coleta de amostras) em comparação com sensores eletroquímicos ou biológicos; é uma técnica invasiva que provoca danos nos tecidos; compromete o equilíbrio neuroquímico no espaço ao redor da membrana devido ao gradiente de concentração contínua de todas as substâncias solúveis que entra o perfusato juntamente com o analito de interesse. Finalmente, a técnica do microdialysis é altamente influenciada pelos limites das técnicas analíticas utilizadas para a quantificação de substâncias no perfusato9,21,22,23 . A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), após derivatização com orthophthaldialdehyde para análise de glutamato e aspartato em amostras biológicas tem sido bem validado24,25,26 , 27 e sua extensa discussão está fora do escopo deste manuscrito, mas os dados produzidos por meio desse método serão descritos em detalhes.

Quando realizado corretamente e sem modificações da composição perfusato, microdialysis pode fornecer informações confiáveis sobre os níveis basais de liberação do neurotransmissor. A maior parte dos níveis basais é provavelmente o resultado das repercussões de transmissor de sinapses9. Porque em muitos casos a simples amostragem do neurotransmissor no espaço extra sináptico não é suficiente para prosseguir os objectivos de uma investigação, a técnica do microdialysis pode ser empregada também para estimular os neurônios ou privá-los de importante íons fisiológicos como K+ ou Ca2 +, de evocar ou evitar a liberação do neurotransmissor.

Alta estimulação K+ é usada frequentemente em neurobiologia para estimular a atividade neuronal, não só em animais acordados, mas também em culturas primárias e organotypic. A exposição de um sistema nervoso saudável para soluções com concentrações elevadas de K+ (40-100 mM) evoca o efluxo de neurotransmissores28. Essa capacidade dos neurônios para fornecer uma liberação adicional em resposta à alta K+ pode ser comprometida em animais epilépticos1 e em outras de29,de doenças neurodegenerativas30. Da mesma forma, o Ca2 + privação (obtida por perfusing soluções livres Ca2 + ) é usada para estabelecer o cálcio-dependente liberação de neurotransmissores mais medidos pelo microdialysis. Geralmente acredita-se que a liberação de Ca2 + dependente é de origem neuronal, Considerando que a liberação de Ca2 + independente origina glia, mas muitos estudos levantarem controvérsia sobre o significado de Ca2 +-medições sensíveis de, por exemplo, glutamato ou GABA9: assim, se possível, é aconselhável apoiar estudos microdialysis com estudos de microsensor, como estes últimos têm maior resolução espacial e os eletrodos permite para se aproximar de sinapses31.

Sobre microdialysis estudos em animais epilépticos, é importante salientar que os dados obtidos da maioria deles dependem de vídeo ou vídeo-EEG, monitoramento de convulsões, ou seja, da ocorrência de sinais e/ou sintomas devido a anormal transitória síncrona ou excessiva atividade neuronal no cérebro32. Existem algumas especificidades de electrographic convulsões em animais de pilocarpina Tratado que devem ser considerados na preparação do experimento. Convulsões espontâneas são seguidas por atividade deprimida com frequentes EEG picos interictais3 e ocorrem em aglomerados33,34. Sham operados não-epiléptica animais podem apresentar convulsão, como atividade35 e, portanto os parâmetros para avaliação de gravações de EEG devem ser padronizada36 e, se possível, o calendário de sessões do microdialysis deve ser bem definido. Finalmente, é altamente recomendável seguir os princípios e normas metodológicas para monitoramento de vídeo-EEG em roedores adultos controle descrito por peritos da Liga Internacional contra epilepsia e sociedade americana de epilepsia em seus relatórios muito recentes37 ,38.

Aqui, descrevemos microdialysis de glutamato e aspartato em paralelo com as gravações de vídeo-EEG a longo prazo em animais epilépticos e sua análise no dialisato por HPLC. Nós enfatizará os passos críticos do protocolo que um deve cuidar para obter melhores resultados.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Ferrara institucional Animal cuidados e Comissão de uso e pelo Ministério da saúde italiano (autorização: D.M. 246/2012-B) em conformidade com as diretrizes descritas nas Comunidades Europeias Directiva do Conselho, de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de aspartato e glutamato no cérebro de rato dialysates obtidas sob controle de EEG do microdialysis sessões em ratos epilépticos e não-epiléptica. Muitos dos materiais descritos aqui podem ser facilmente substituídos com aqueles que usa em seu laboratório para gravações de EEG ou microdialysis.

1. montagem do dispositivo Microdialysis sonda-terra

  1. Usar um eletrodo de dois trançado 3 canais (pelo menos um 20 mm comprimento do eletrodo registo de corte e um tempo de aterramento eletrodo de 10 cm) e acoplar a uma cânula guia para preparar o dispositivo. Ver exemplos de cânula de eletrodo e guia de 3 canais para diálise na figura 1A-1B.
  2. Remover (Figura 1) e inserir (Figura 1), a cânula de metal guia dentro da cânula de plástico manequim algumas vezes antes do uso para facilitar sua remoção no momento de seu switch para microdialysis sonda no animal.
  3. Dobre os fios torcidos de registrar eletrodo duas vezes (Figura 1E-1F) a fim de alinhar os fios com a cânula de manequim do guia e corte a ponta do eletrodo (Figura 1) para ser mais do que a ponta da cânula guia (Figura 0.5 mm 1 H) usando o paquímetro digital.
  4. Tem pronto a argola de longa silicone 1mm (OD 2 mm, espessura 0,3 mm; Figura 1I) e insira a ponta da cânula guia e a ponta dos eletrodos torcidos na argola de silício usando uma pinça (Figura 1J). Corrigi-lo para o pé do guia de pedestal de cânula com cola de polímero de ação rápida ou resina (Figura 1 K). Consulte o exemplo dos dispositivos preenchidos na Figura 1 L e Figura 2A.
  5. Esterilize o dispositivo sob a luz UV germicida para 4 h. vire o dispositivo quatro vezes tão como cada um de seus lados é exposta à luz por 1h.
    Nota: Muitas sondas eletrodos e microdialysis caseiro podem ser montadas em uma maneira similar. A cabeça do acima descrito implante para ratos tem as seguintes dimensões: largura de 7 mm x 5 mm profundidade x comprimento 10 mm do topo até o pedestal do dedo do pé; a ponta do implante é cerca de 11 mm de comprimento, 600 µm de diâmetro e todo o dispositivo pesa cerca de 330-360 mg. O dispositivo pode ser reutilizado duas ou três vezes se (i) um comprimento suficiente do eléctrodo de terra é deixado no crânio durante a cirurgia para o próximo uso e (ii) quando o animal é morto, e o dispositivo recuperou junto com o cimento dental for deixado em acetona overnigh t, tal que o cimento pode ser mecanicamente desagregado, e o dispositivo lavados e esterilizados novamente.

2. estereotáxica cirurgia

  1. Use um estereotáxica aparelhos e sonda clipe titular (Figura 2B) para a implantação do dispositivo seguindo os padrões contemporâneos para cirurgias asséptica e indolor39,40,41.
    1. Anestesiar a ratos Sprague Dawley do adulto com mistura de xilazina/cetamina (43 mg/kg e 7 mg/kg, i.p.) e corrigi-lo sobre a armação estereotáxica. Adicione anestesia isoflurano (1,4% em ar; 1,2 mL/min) para injeção inicial de xilazina/cetamina como permite para controlar a profundidade da anestesia no tempo. Raspe o pelo na cabeça do animal.
  2. Limpe a superfície da pele cabeça pela solução à base de iodo, seguida por 70% de etanol para prepará-lo para cirurgia asséptica39.
    1. Implantar o dispositivo de cânula-eletrodo guia preparado em precedência (1.1 – 1.5) no hipocampo ventral bem usando as seguintes coordenadas: bar do nariz 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm para bregma1,2. Siga as técnicas padrão para cirurgias estereotáxica10,11,12.
    2. Certifique-se de que não abrange os parafusos de ancoragem. Quando montando-a em aparato estereotáxica, segure o dispositivo para a cabeça de cânula guia como isto pode ser facilmente alinhado ao titular da sonda.
  3. Ancore o dispositivo no crânio pelo menos quatro parafusos de aço inoxidáveis, aparafusando-os dentro do osso do crânio (1 parafuso no parafuso esquerdo e 1 para as placas de certo osso frontal, 1 parafuso para o parietal esquerdo e 1 parafuso para as placas de osso interparietal). Adicione uma gota de cola de tecido para fixar ainda mais cada parafuso no osso do crânio.
    1. Cobrir a metade de roscas do parafuso com cimento metacrílico. Promover a ligação do cimento, tornando superficiais sulcos no osso para aumentar a aderência.
  4. Uma vez que a ponta do dispositivo é posicionada no tecido cerebral, torce o fio do eléctrodo de terra em torno de 3 parafusos de ancoragem. Cobrir os parafusos todos montados e o dispositivo com o cimento dental12,42,43.
  5. Monitore os animais durante a cirurgia e para cerca de 1 h depois disso até ereto e movimentar a gaiola. Mantê-los em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Permitir que os ratos recuperar pelo menos 7 dias após a implantação do dispositivo.
  6. Monitore os animais pelo menos uma vez por dia durante 3 dias após a cirurgia para sinais de dor ou sofrimento. Dar os animais com o creme antibiótico (gentamicina 0,1%) perto do local de incisão para prevenir a infecção e um analgésico (tramadol 5mg/kg, i.p.) por 3 dias para evitar a dor pós-cirúrgica.

3. lobo Temporal epilepsia indução por pilocarpina e cessão de animais para grupos experimentais

  1. Após uma semana de recuperação pós-cirúrgica, atribuir os animais aleatoriamente para grupos: (i) o controle de animais recebendo animais veículo e (ii) epiléptico que receberão a pilocarpina. Uso um número proporcionalmente maior de animais para epiléptico grupo desde que nem todos a pilocarpina administrada a ratos irá desenvolver a doença.
  2. Injete uma dose de methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) e 30 min, após uma única injeção de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para induzir o estado de mal epiléptico (SE). Injete o methylscopolamine e o veículo (soro), aos ratos controle. Use seringa de 1 mL com agulha de 25G para todas as administrações do i.p..
    1. Verificar visualmente os animais para começar a ter convulsões comportamentais (movendo vibrissa dentro de 5 min, balançando a cabeça, os membros de clonagem) e dentro de 25 min para clonar continuamente todo o corpo (SE).
  3. Prenda a SE 2 h após o início para ter uma mortalidade de cerca de 25% e um período de latência médio de aproximadamente 10 dias pela administração de diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observar e registrar qualquer início de comportamento de ataque imediatamente após a injeção de pilocarpina e continuar pelo menos 6 h depois disso.
  4. Dê o soro de animais (1 mL, i.p.) usando a seringa de 1 mL com solução 25g agulha e sacarose (mL 1, p.o.) usando a seringa de 1 mL e agulha de 17G alimentação flexível para 2-3 dias após SE promover a recuperação da perda de peso de corpo.
    1. Exclua os animais que não atingir o peso inicial na primeira semana após a pilocarpina SE partir do estudo (exceto para o grupo agudo matado 24 h após SE, onde o acompanhamento de peso do corpo não é possível).
  5. Atribuir a animais post-SE aleatoriamente para diferentes grupos experimentais (Figura 3): aguda (onde o microdialysis ocorre 24h após SE), latência (7-9 dias após SE), primeira apreensão espontânea (aproximadamente 11 dias após SE) e fase crônica (período começa a cerca de 22 a 24 dias após SE, ou seja, cerca de 10 dias após a primeira convulsão). Monitore os animais para a ocorrência de convulsões espontâneas.
    Nota: Use os seguintes critérios de inclusão/exclusão para novas experiências em ratos epilépticos: desenvolvimento de convulsiva SE dentro de 1 h após a administração de pilocarpina; ganho de peso na primeira semana após SE e o correto posicionamento da sonda microdialysis e eletrodo.

4. epilepsia comportamento monitoramento e análise

  1. Acompanhamento a longo prazo do comportamento epiléptico
    1. Aproximadamente 6 h após a administração de pilocarpina (isto é, ao final da observação directa pelos pesquisadores), colocar os animais em gaiolas de limpar a casa e iniciar o monitoramento de vídeo 24 h.
    2. Continue o vídeo 24h monitorando até dia 5, usando um sistema de vigilância de vídeo digital.
    3. Começando no dia 5, conectar os ratos em jaulas em casa retangulares para sistema de gravação de EEG amarrados e continuar o monitoramento de vídeo 24 h.
    4. Conjunto de parâmetros do amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday (fator de amplificação definido em cada canal de acordo com a especificidade do sinal EEG de cada único animal) e iniciar o EEG aquisição observando o sinal de EEG produzidos pela desconectado cabos. Uso de amostragem taxa de 200 Hz e baixo passar o conjunto de filtro para 0,5 Hz.
    5. O animal Conecte cabos segurando a cabeça do animal entre dois dedos esticados de uma mão e a perna para baixo os conectores para o pedestal de eletrodo usando a outra mão livre. Inicie a aquisição.
      Atenção: Certifique-se de que o sinal é livre de artefatos. Artefatos comuns são os picos extremamente exceder a escala.
    6. Um dia antes de experimentar os microdialysis, transferi os animais para o sistema de EEG amarrado equipado com cilindros de plexiglás para microdialysis. Desconecte os animais do EEG amarrar sistema de gaiola em casa estragando os conectores do elétrodo sem conter o animal. Coloca o animal dentro dos cilindros de plexiglass de alta.
  2. Monitoramento do comportamento epilético, um dia antes e durante a sessão do microdialysis
    1. Ligue o amplificador posicionado fora da gaiola de Faraday. Abra o software de EEG. Iniciar a aquisição do EEG observando o sinal de EEG produzida por cabos desconectados.
    2. Conecte o animal para o sistema de gravação de EEG amarrado segurando a cabeça do animal entre dois dedos esticados de uma mão e a perna para baixo os conectores para o pedestal de eletrodo usando a outra mão livre. Defina um fator de amplificação (ganho) em cada canal do amplificador de acordo com o sinal de eletrodo de único animal assim que o sinal de EEG está em escala. Deixe o animal explorar a nova gaiola (cilindro) pelo menos 1 h sob a observação direta do pesquisador.
    3. Nota: 24 h antes do microdialysis experimento, os ratos são brevemente anestesiados com isoflurano para o interruptor de cânulas de guia para microdialysis sonda. Aproveite o momento quando eles são anestesiados para conectá-los para o sistema de gravação de EEG.
    4. Encurtar ou prolongar penduloso cabo de acordo com o producto do animal. Certifique-se de que os cabos não interferir com os movimentos do animal e postura mentirosa.
    5. Verificar o enquadramento da imagem correta de câmeras de vídeo. Inicie a gravação de vídeo-EEG.
  3. Identificação de convulsões e atividade de EEG
    1. Use um leitor de software para assistir os vídeos. Rolar o filme 8 vezes mais rápido do que o tempo real de jogar e individualizar as convulsões generalizadas (ver animal à retaguarda e clonus membro anterior ou animal de criação e caindo com clonus membro anterior). Desacelerar o vídeo e anote a hora exacta do início e do fim da apreensão comportamental.
    2. Processo os dados contando o número de convulsões generalizadas observada em 24 h de registos vídeo e expressá-los em termos de apreensão de frequência e duração como valores médios de todas as convulsões observadas em 24 h.
    3. Definir as convulsões de EEG que os períodos de atividade paroxística de alta frequência (> 5 Hz) caracterizada por uma > 3 vezes incremento da amplitude ao longo da linha de base com a progressão da frequência da espiga que dura por um período mínimo de 3 s2,44 ou semelhante a28. Use software de EEG para processar as gravações de EEG crus. Dividi os vestígios de EEG em frações de 1 h. Copie as frações de rastreamento do EEG para o arquivo para o software de análise automática de spike.
    4. Analise os dados de atividade do EEG usando software de EEG e parâmetros predefinidos (4.3.3.). Realizar todas as análises de vídeo em dois investigadores independentes que são cegos para o grupo de animais analisados. Em caso de divergência, fazê-los voltar a analisar os dados para chegar a um consenso,45.

5. Microdialysis

  1. Em vitro recuperação de sonda
    1. Prepare a sonda para seu primeiro uso de acordo com as instruções do fabricante, lidando com isso na capa protetora.
    2. Realizar o experimento em triplicado: preparar três tubos de ensaio de 1,5 mL carregá-los com 1 mL de solução de Ringer contendo a mistura de padrões (2,5 µM de glutamato) e 2,5 µM de aspartato. Coloque três tubos de ensaio carregado 1,5 mL em conjunto bloco aquecedor a 37 ° C e posicioná-lo no agitador.
      Nota: Use as mesmas soluções padrão para calibração de cromatografia.
    3. Selar os tubos de ensaio de 1,5 mL com película de parafina e punção-lo por Pinças afiadas tornar-se um buraco de cerca de 1 mm de diâmetro.
    4. Levar a sonda e inseri-lo no buraco feito na película de parafina. Mergulhe a membrana de pelo menos 2 mm abaixo do nível da solução. Correção mais a sonda ao tubo de ensaio de 1,5 mL pela película de parafina.
      Atenção: Certifique-se de que a ponta não toque as paredes do tubo de ensaio de 1,5 mL.
    5. Conecte a entrada da sonda na seringa montado na bomba de infusão, usando adaptadores de FEP-tubos e tubagens. Opcionalmente, uso fino furo tubos de polietileno de 0,28 mm ID e 0,61 milímetros OD e tubos coloridos adaptadores (tubo vermelho e azul) para conexões.
    6. Ligue a bomba 2 µ l/min e deixe o líquido aparecer na ponta da tomada. Conecte a saída da sonda a 0,2 mL tubo de teste usando adaptadores de FEP-tubos e tubos de coleta.
      Nota: Use o FEP-tubulação para todas as conexões. Corte o comprimento desejado do tubo usando uma lâmina de barbear. Use adaptadores de tubos de cor diferente para a entrada e a saída da sonda. Deixe a bomba executada por 60 min. verificação de vazamentos e bolhas de ar. Estas não devem estar presentes.
    7. Conjunto da bomba para o fluxo taxa 2 µ l/min e começar a coletar as amostras no lado da descarga da tubulação.
    8. Colete três amostras de perfusato 30 min e três amostras de igual volume da solução num tubo de ensaio de 1,5 mL. Leve as amostras de igual volume do tubo de ensaio de 1,5 mL cada 30 min usando a micro-seringa imergida na solução-padrão em tubo de ensaio de 1,5 mL.
    9. Repeti a experiência (5.1.1-5.1.8) configurando a bomba para o fluxo taxa 3 µ l/min (5.1.7) para ter uma comparação de recuperação sonda quando usando duas taxas de fluxo diferentes da perfusão.
    10. Quando terminar, parar a bomba e enxaguar o tubo com água destilada, etanol 70% e empurrar o ar para ele. Loja da sonda em um frasco enchido com água destilada limpa. Enxague a sonda por perfusing-2 µ l/min por água destilada prévia do armazenamento.
    11. Analisar a concentração de glutamato e aspartato nas amostras por cromatografia (veja os detalhes abaixo; 6.3).
    12. Calcule a recuperação utilizando a seguinte equação:
      Recuperação (%) = (Cperfusato /Cdialysed solução) x 100.
  2. Microdialysis sessões em ratos movimentando-se livremente
    1. Preparativa procedimentos: sonda de inserção e testes, infusão bomba de configuração e iniciar
      1. Preparar as sondas microdialysis para o primeiro uso de acordo com o manual do fabricante e encha-os com solução de Ringer. Corte cerca de 10 cm longos pedaços de FEP-tubos e conectá-los a cânulas de entrada e saída da sonda usando adaptadores de tubos de cores diferentes.
      2. Certifique-se de que a tubagem toca os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.
      3. 5.2.1.3. 24 h antes do experimento microdialysis, brevemente anestesiar o animal com isoflurano (5% em ar) em uma câmara de indução até reclinada. Remova a cânula manequim de seu guia, usando a pinça e segurando a cabeça do animal com firmeza. Introduzir a sonda microdialysis, dotada de uma membrana dialyzing, dentro da cânula guia e firma mais as cânulas microdialysis inseridas em seu guia por argila de modelagem.
        Atenção: Não deixe que a sonda tocar as paredes da luva protetora sonda ao extrair.
      4. Colocar o animal dentro do cilindro de Plexiglas e deixá-lo a explorar o novo ambiente. Conectar o animal para o sistema de gravação de EEG amarrados, como descrito acima (siga os pontos 4.2.2 e 4.2.3).
      5. Siga o acordado e movimentando-se livremente os movimentos do rato e conectar a entrada da sonda na seringa de 2,5 mL com agulha de 22g embotadas contendo solução de Ringer usando adaptadores de tubos. Empurre a solução de Ringer no interior da sonda ejetando 1 mL de solução de Ringer em 10 s continuamente empurrando o êmbolo da seringa de 2,5 mL. Verifique se a gota do líquido aparecendo na saída. A sonda está agora pronta para uso.
      6. Encher as seringas de 2,5 mL ligadas ao FEP-tubulação por adaptadores de tubos com solução de Ringer e montá-los para a bomba de infusão. Ligue a bomba 2 µ l/min. Deixá-lo correr durante a noite.
        Nota: Use o comprimento desejado do FEP-tubo de tudo mas calcular o volume morto de tubulação para saber quando a estimulação de K+ a alta deve ser iniciada e correlacionar os dados de quantificação com mudanças neuroquímicas no cérebro de animais. Use a bolha de ar criada na tubulação de sob o fluxo de trabalho para calcular esse tempo.
    2. Coleta de amostras durante a estimulação de EEG gravação e potássio
      1. Verificar a ausência de convulsões no 3 h antes do início da coleta de amostra (gravações de vídeo-EEG) e continuar a monitorar a atividade de apreensão durante microdialysis.
      2. Pare a bomba carregando as seringas de FEP-tubulação canulado preenchidas com solução de Ringer. Montagem sobre a bomba de outro conjunto de seringas de 2,5 mL ligado ao FEP-tubulação com tubos adaptadores preenchidos com solução de Ringer modificados contendo 100 mM K+ solução.
      3. Ligue a bomba 2 µ l/min e deixá-lo correr. Para mais rápido enchimento da tubulação, defina a bomba por 5 µ l/min para o tempo de enchimento. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema. Certifique-se de que a tubagem toca os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.
      4. Teste a sonda se pronto para uso em animais como descrito acima (5.2.1.5).
        Nota: Se por algum motivo, a sonda não funciona, mudá-lo. Para esses casos, manter alguns sondas microdialysis preparado prontas para usar perto de estação de trabalho da microdialysis-EEG. Desconecte os cabos de EEG o animal e anestesiá-lo brevemente com isoflurano se necessário realizar a mudança.
      5. Conecte o FEP-tubo de seringas preenchidos com solução de Ringer para a cânula da entrada da sonda em cada animal e esperar pelo aparecimento da gota na ponta de saída do líquido.
      6. Conecte a saída da sonda o FEP-tubulação, que leva à coleção no tubo de teste. Inserir o tubo de FEP para o tubo de ensaio fechado 0,2 mL com tampa perfurada. Certifique-se de que o tubo fica no lugar por fixação com um pedaço de argila de modelagem.
      7. Continue a funcionar a bomba 2 µ l/min por 60 min sem coleta de amostras para equilibrar o sistema (zero amostra).
      8. Recolha 5 amostras de dialisato consecutivos 30 min (respectivo volume 60 µ l) em condições de linha de base (perfusão com solução de Ringer normal). Armazenar as amostras no gelo.
      9. Calcular o tempo que leva o líquido a passar da bomba na cabeça do animal (depende do volume morto da tubulação, ou seja, tempo de bolha de ar) e alternar o FEP-tubulação que vai desde as seringas contendo solução de Ringer normal para seringas contendo modificado a solução de Ringer (100 mM K+) neste momento sem parar a bomba. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema. Deixe a bomba funcionar por 10 min.
        Atenção: Em 10 min de alta estimulação K+ , os animais tendem a mover-se freneticamente e geralmente apresentam um número grande de cachorro molhado shakes (controle e sem animais de aglomerado de apreensão) ou convulsões comportamentais (animais epilépticos), para estar pronto para intervir para protege os cabos e tubos de torção.
      10. Depois de 10 min, alterne a tubagem das seringas contendo 100 mM K+ Ringer solução de solução de Ringer normal e deixe a bomba funcionar. Não desligue a bomba durante as mudanças de solução para que que vai haver uma gota do líquido na extremidade do tubo deve ser ligado em linha.
      11. Desde o momento em que o dialisato contém potássio alto, ou seja, após a coleta do quinto post-equilíbrio de dialisato, recolher as frações do fluído cada 10 min (20 µ l) para as amostras do fluído de 1 h. coletar 3 adicional de 30 min e parar a bomba. Armazene as amostras no gelo.
      12. Armazene as amostras a-80 ° C após a experiência, até análise HPLC.
      13. Repita que os microdialysis experimentar durante 3 dias consecutivos, exceto para a aguda (24 h) e o primeiro grupo de apreensão, em que microdialysis apenas uma sessão realiza 24 h após SE ou dentro de 24 h após a primeira convulsão espontânea (Figura 3).
      14. Após a conclusão de cada experimento, abater o animal com uma overdose de anestésico e remover o cérebro para verificação da colocação de sonda e o eléctrodo.
  3. Procedimentos pós-microdialysis
    1. Enxagúe as sondas microdialysis usado com água destilada e armazená-los em um frasco enchido com água destilada até à próxima utilização.
      Nota: As membranas reutilizadas podem ter aumentado a permeabilidade; seleção para a recuperação de sonda antes da sua utilização repetida.
    2. Enxágue o inteiro microdialysis configurar (tubos, conectores e seringas) com água destilada, seguida por 70% de etanol. Substituir o etanol com ar e armazenar o conjunto em um ambiente estéril.
    3. Dividir as amostras basais do fluído em 20 frações µ l e usar fração única 20 µ l para análise de concentração basal de ácido aminado. Armazenar o restante volume de amostra para análise posterior ou confirmação a-80 ° C.
    4. Consertar o cérebro em formol a 10% e preservá-los por incorporação de parafina1. No secção do cérebro em fatias e manchá-las com hematoxilina e eosina. Examine o cérebro para sonda correta e posicionamento de eletrodo1,2.
      Nota: Consertar o cérebro em refrigeração 2-methylbutane e armazená-los a-80 ° C. Use qualquer outra coloração comprovada sobre as seções de tecido nervoso que permite a visualização do trato da sonda e do eléctrodo.

6. cromatográfico análise de glutamato e aspartato

  1. Preparação de derivatizing agente
    1. Misture os respectivos volumes de 20:1 (v/v) de reagente orthophthaldialdehyde (OPA) e 2-mercaptoetanol (5-ME) no frasco. Feche o frasco usando o septo apertado cap e ar.
      Atenção: Trabalhar sob a capa de química.
    2. A solução preparada de vórtice e colocá-lo no mostruário automático para a posição de derivatizing agente.
  2. Preparação de amostras do fluído
    1. Colocar o inserto de vidro com mola inferior a 2ml de mostruário marrom. Prepare os frascos para todas as amostras, medidas em um lote.
    2. Leve as amostras de diálise 20 µ l de congelador-80 ° C e deixe-os derreter. 1 µ l da solução de remover e adicionar 1 µ l de padrão interno (IS) L-Homosserina (50 µM) a 19 µ l da amostra, assim a amostra contém 2,5 µM de IS. Pipetar 20 µ l da amostra diálise para a inserção de vidro no frasco e selá-lo com um septo de ar comprimido.
    3. Coloque os frascos que contêm as amostras para o mostruário automático usando o software cromatográfico para rotular as amostras em suas posições.
  3. Análise cromatográfica de amostras para determinar a concentração de glutamato e aspartato
    1. Execute as análises no sistema cromatógrafo líquido com deteção de spectrofluorometric. Detecta os aminoácidos após 2min pré-coluna derivatização com 20 μL de orthophthaldialdehyde/5-Mercaptoetanol 20:1 (v/v) adicionada à 20 μL da amostra.
    2. Prepare o sistema para análise de aminoácidos. Ligue o mostruário, a bomba, o desgaseificador, o detector e unidade controladora juntamente com o computador.
    3. Mergulhe os sifões nas garrafas contendo a fase móvel e limpar os canais da bomba a ser usado para a análise cromatográfica.
    4. Começar a aumentar o fluxo da fase móvel, verificando a pressão sobre a coluna (por exemplo, começar a 0,2 mL/min e aumentar o fluxo de 0,2 mL/min adicionais cada 5 min até alcançar o fluxo de trabalho). Deixe o sistema funcionar no trabalho fluxo de 0,8 mL/min. para pelo menos 1 h equilibrar a coluna.
      Atenção: Instável pressão indica a presença de ar no sistema. A pressão não deve exceder 25 MPa.
    5. Definir o ganho, alta sensibilidade e excitação e emissão de comprimentos de onda no detector para 345/455 nm respectivamente. Redefina o sinal do detector (analógicos).
    6. Usando o software de cromatografia em fase gasosa, envie o método para o instrumento. Agora, o cromatógrafo deve estar pronto para medir.
    7. Separar as amostras do fluído, padrão cravado amostras do fluído, bem como padrões (0,25 µM – 2,5 µM aspartato e glutamato em solução de Ringer) na coluna cromatográfica apropriada. Calibrar o método cromatográfico e estabelecer os limites de deteção e quantificação antes de qualquer análise de amostras de diálise.
    8. Ativar a única análise ou criar a sequência das amostras a serem analisados utilizando o software de cromatografia e executar a sequência.
      Atenção: Execute mais de uma amostra em branco e amostras-padrão diferentes dentro da sequência de dialisato amostras a fim de controlar a precisão do método.
    9. Uma vez que os cromatogramas são adquiridos, analisá-las com o software de cromatografia. Verifique a integração dos picos de interesse para a trama de calibração. Use a área de altura ou pico pico para quantificação.
    10. Finalizada a gravação de amostra encha a coluna e o sistema com um solvente orgânico (por exemplo, 50% acetonitrila em água ultrapura) para evitar seu envelhecimento e molde crescimento nele.
    11. Desligar o sistema.

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Resultados

Recuperação de sonda

A recuperação média (ou seja, o conteúdo do ácido aminado no perfusato como uma porcentagem do conteúdo em um volume igual de solução frasco) foi 15.49 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6.32 ± 0,64 a 3 µ l/min por glutamato e 14.89 ± 0,36% a uma taxa de fluxo de 2 µ L/min e 10.13 ± 0,51 em 3 µ l/min para aspartato ao usar a sonda de membrana cuprophane. Se usar a sonda de membrana de poliacri...

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Discussão

Neste trabalho, mostramos como uma gravação de vídeo-EEG contínua juntamente com microdialysis pode ser executada em um modelo experimental de TLE. Técnicas de gravação de vídeo-EEG são usadas para diagnosticar corretamente as diferentes fases da progressão da doença em animais e a técnica do microdialysis é usada para descrever as alterações na liberação de glutamato que ocorrem no tempo (sem alterações foram encontradas para aspartato em um estudo publicado anteriormente2). Recomendamos o uso de...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon e Eleonora Palma à sua contribuição para manuscritos publicados em precedência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Eléctrodo de 3 canais de dupla torçãoInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCCânula guia de material
Agn Tho's, Lindigö, SuéciaMAB 4.15.ICMaterial
Resina KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItáliaKK2Material
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milão, Itália2047420_71941material
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, França221300288 (AIC)Solução
XylazineSigma, Milano, ItáliaX1251Material
Isoflurano-VetMerial, Toulouse, França103120022 (AIC)Solução
Altadol 50 mg/ml - tramadolFormevet, Milano, Itália103703017 (AIC)Solução
Gentalyn 0,1% crm - gentamicinaMSD Italia, Roma, Itália20891077 (AIC)Material
simplex rapid dental cementKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JapãoPN1167Suporte de
clipe de sondaAgn Tho's, Lindigö, Suéciap/n 100 5001Equipamento
Histoacrílico® Adesivo de Pele Tópico AzulTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, EUATS1050044FPMaterial
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Itália019995063 (AIC)Material
Seringa de 1 mL com agulha 25GVetrotecnica, Padova, Itália11.3500.05Material
agulha de alimentação flexível de rato 17GAgn Tho's, Lindigö Suécia7206Material
Grass Technology aparelhoGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Califórnia, EUAM665G08Equipamento (amplificador AS40, caixa de cabeça, cabos de interconexão, telefator modelo RPSA S40)
aquisição modular de dados e  sistema de análise MP150Biopac, Goleta, Califórnia, EUAMP150WSWEquipamento
sistema de vigilância por vídeo digitalAverMedia Technologies, Fremont, Califórnia, EUAV4.7.0041FD
Sonda de microdiáliseAgn Tho's, Lindigö SuéciaMAB 4.15.1.Sonda de
microdiáliseSynaptech, Colorado Springs, Colorado, EUAS-8010
Aquecedor de blocoGrant Instruments, Cambridge, InglaterraQBD2Agitador de equipamento
Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Itália711
Equipamento bomba de infusãoUniventor, Zejtun, Malta864equipamento
tubo de polietileno de furo finoSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, EUA800/100/100/100Material
azul tubos adaptadoresAgn Tho's, Lindigö Suécia1002Material
vermelho tubos adaptadoresAgn Tho's, Lindigö Suécia1003Material
Seringa de 2,5 mL com agulha 22GChemil, Pádua, ItáliaS02G22Material
tampa do frascoCronus, Labicom, Olomouc, República TchecaVCA-1004TB-100Material
septoThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, EUANacional C4013-60 8 mm TEF/SIL septoMaterial
inserção de vidro com mola inferiorSupelco, Sigma, Milão, Itália27400-UFrasco
amostrador automáticoNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItáliaC4013-2Material
Smartline manager 5000 controlador de sistema e unidade de desgaseificaçãoKnauer, Berlim, AlemanhaV7602
Equipamento Smartline 1000 bomba de gradiente quaternárioKnauer, Berlim, AlemanhaV7603Equipamento
detector espectrofluorométricoShimadzu, Kyoto, JapãoRF-551
Equipamento coluna cromatográficaKnauer, Berlim, Alemanha25EK181EBJMaterial
pré-coluna cromatográficaKnauer, Berlim, AlemanhaP5DK181EBJMaterial
solução de fase móvel Atampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0Solução
solução de fase móvel BTampão fosfato de sódio 40% 0,1 M, 30% metanol, 30% acetonitrila, pH 6,5Solução
Composição da solução de Ringerem mM: MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3% BSAComposição
da solução de Ringer modificadacom solução em mM: MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50,7, CaCl2 1,2, 0,3% BSASolução
salina0,9% NaCl, ph ajustado para 7,0Solução
solução de sacarose10% de sacarose em águaSolução
de material de material de material de de material destilada

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