Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

Resumo

Descrevemos a montagem, operação, e limpeza de um aparelho de fluxo projetado para formação de biofilmes fúngicas de imagem em tempo real enquanto sob fluxo. Também fornecemos e discutir algoritmos quantitativos para ser usado nas imagens adquiridas.

Resumo

Na candidíase orofaríngea, membros do gênero Candida devem aderir e crescer na superfície da mucosa oral, enquanto sob os efeitos do fluxo salivar. Enquanto foram desenvolvidos modelos para o crescimento sob fluxo, muitos destes sistemas são caros, ou não permita que enquanto as células estão sob fluxo de imagem. Nós desenvolvemos uma novela aparelho que permite o crescimento e desenvolvimento das células de Candida albicans em fluxo e em tempo real da imagem. Aqui, detalhamos o protocolo para a montagem e a utilização deste aparelho de fluxo, bem como a quantificação dos dados que são gerados. Somos capazes de quantificar as taxas que as células anexar e desanexar do slide, bem como a determinar uma medida da biomassa no slide ao longo do tempo. Este sistema é econômico e versátil, trabalhando com vários tipos de microscópios de luz, incluindo microscópios de bancada barata, e é capaz de estendido vezes comparados a outros sistemas de fluxo de imagem. Globalmente, este é um sistema de baixa taxa de transferência que pode fornecer informações em tempo real altamente detalhadas sobre o crescimento de biofilmes de espécies de fungos sob fluxo.

Introdução

Candida albicans (C. albicans) é um patógeno oportunista fúngico dos seres humanos que podem infectar vários tipos de tecido, incluindo as superfícies da mucosa orais, causando candidíase orofaríngea e resultando em uma baixa qualidade de vida para os indivíduos afetados¹. Formação de biofilme é uma característica importante para a patogênese da c. albicans, e numerosos estudos foram feitos sobre a formação e a função de c. albicans biofilms^{2,3,4, 5}, muitas das quais têm sido realizadas usando estática (sem fluxo) em vitro modelos. No entanto, c. albicans deve aderir e crescer na presença de fluxo salivar na cavidade oral. Numerosos sistemas de fluxo foram desenvolvidos para permitir viver-pilha de imagem^6,7,8,9,10. Estes sistemas de fluxo diferentes foram projetados para diferentes fins, e, portanto, cada sistema possui diferentes pontos fortes e pontos fracos. Nós achamos que muitos do fluxo de sistemas adequados para c. albicans foram caros, complexo exigido fabricado peças, ou não poderia ser fotografado durante o fluxo e teve que ser interrompido antes da imagem latente. Portanto, desenvolvemos um aparelho novo fluxo para estudar a formação de biofilmes de c. albicans sob fluxo¹¹. Durante o design do nosso aparelho de fluxo, seguimos estas considerações principais. Primeiro, queríamos ser capaz de quantificar os múltiplos aspectos do crescimento do biofilme e desenvolvimento em tempo real, sem exigir o uso de células fluorescentes (permitindo-nos para estudo de cepas mutantes e isolados clínicos não modificados facilmente). Em segundo lugar, queríamos que todas as partes para ser comercialmente disponíveis com pouca ou nenhuma modificação (i. e., sem fabricação personalizada), permitindo que outros para mais facilmente recriar nosso sistema e permitindo a fácil reparação. Em terceiro lugar, queríamos também permitem extensa imagem vezes em taxas de fluxo razoavelmente alta. Por fim, queríamos, após um período de células anexar ao substrato sob fluxo, poder acompanhar o crescimento do biofilme durante um tempo prolongado sem a introdução de novas células.

Estas considerações nos levaram a desenvolver o sistema de recirculação fluxo dois-balão ilustrado na Figura 1. Os dois balões nos permitem dividir a experiência em duas fases, uma fase de fixação que retira o recipiente acessório celular-semeado e uma fase de crescimento que usa mídia sem célula para continuar o crescimento do biofilme sem a adição de novas células. Este sistema é projetado para trabalhar com uma câmara de incubação para o microscópio, com o slide e o tubo de precedê-lo (2 a 5, Figura 1), sendo colocado dentro da incubadora, e todos os outros componentes colocados em um grande recipiente secundário fora do microscópio. Além disso, um agitador de placa de aquecimento com uma sonda de temperatura anexado é usado para manter as células fúngicas no recipiente de apego a 37 ° C. Como ele é de recirculação, este sistema é capaz de imagem contínua durante o fluxo (pode ser mais de 36 h, dependendo de condições) e pode ser usado em microscópios mais padrão, incluindo microscópios de bancada vertical ou invertida. Aqui, vamos discutir a montagem, operação, e limpeza do aparato de fluxo, bem como fornecer alguns algoritmos de ImageJ base quantitativos para analisar os vídeos depois de uma experiência.

Protocolo

1. montar o aparelho de fluxo

1. Configure as partes constantes da Tabela de materiais , de acordo com o esquema na Figura 1 , com as considerações discutidas abaixo.
   Nota: Para sua conveniência, o fluxo de aparelhos é dividido em dois lados, o lado verde (tudo contra a corrente do slide para os frascos de mídia) e a laranja do lado (tudo a jusante do slide para os frascos de mídia).
   1. Certifique-se de que todos os aparelhos de fluxo é ar comprimido para evitar vazamentos, com a única excepção dos frascos mídia (Figura 1, 1). Para fazer isso, aplique fita encanadores a qualquer segmentação masculino antes da montagem, exceto o amortecedor de pulsação (PD) e frasco de filtro de 2 µm (FB), que não necessitam de fita encanadores como as gaxetas de borracha mantém-los hermeticamente.
   2. Aplicar o ouvido grampos em cada encaixe de arame farpado que está sob pressão positiva durante a operação normal (ou seja, a jusante da bomba).
   3. Uso de cor codificada fitas de laboratório para rotular os locais da válvula com um A ou G (para fixação e crescimento, respectivamente), a localização da bomba, os locais de conexão de slide e a conexão de filtro de 0,2 µm.
   4. Determine o comprimento da tubulação deve ser usado com base na distância entre o sistema de fluxo e microscópio, mantendo em mente que todo o aparato de fluxo a jusante da bomba para os frascos (maioria do lado laranja) deve ser a contenção secundária. Adicionar aproximadamente 1 m de tubo extra a montante do slide (e de preferência o borbulhador) para colocar dentro da câmara de incubação do microscópio, como isso garante que todos os meios, atingindo o slide será na temperatura correta.
   5. Lugar do borbulhador tão perto quanto razoavelmente possível para o slide, de preferência dentro da câmara de incubação durante um experimento (bolhas de forma muitas vezes ao longo da parede do tubo); no entanto, tenha em mente que deve ser conectado a um vácuo de operar.
   6. Certifique-se de que a tubulação entre o FB e a 0,2 µm filtro descartável é cerca de 0,5 m de comprimento.
   7. Adicionar uma barra de agitação magnética a aproximadamente 2 cm para cada balão de mídia.
   8. Obter alguma forma de braçadeiras de tubo para atuar como válvulas shut-off (hemostatos podem ser usados).
   9. Para facilidade de uso, mantenha o aparelho de fluxo em uma cesta autoclaváveis. Pode ser útil ter uma segunda cesta menor em um maior para permitir a fácil separação do lado verde e o lado laranja.
   10. Para o balão de fixação, usando uma broca de 4 mm, furo um extra na rolha de borracha para acomodar a sonda térmica (tome cuidado para não passar por outro buraco). Para obter a tubulação através das portas, empurre o tubo com pinças; uma vez, prenda a tubagem para segurá-la no lugar e em seguida puxe a pinça de volta.
       Nota: Se não é possível adicionar o buraco extra para a rolha de borracha, uma garrafa de boca larga parafuso com uma tampa de rosca de quatro portas pode funcionar no lugar a rolha de borracha e balão.
2. Uma vez que o sistema de fluxo foi totalmente montado, feche as válvulas de dois frascos de crescimento do lado verde e laranja. Use água com o tubo do frasco de apego e um cilindro graduado para calibrar a bomba peristáltica de acordo com as instruções do fabricante.

2. realizar um experimento

1. O dia antes do experimento, começar a pre-aquecimento da câmara de incubação de microscópio para 37 ° C e preparar uma cultura durante a noite de uma cepa fúngica (fluorescência não é obrigatório).
2. Recolher a bomba e componentes de uso único e coloque em uma estéril biossegurança do armário.
3. Remover o borbulhador e a temperatura sonda do aparelho fluxo e colocá-los no gabinete de segurança biológica.
4. Desembaraçar e organizar o tubo, se necessário.
5. Autoclave os aparelhos de fluxo, incluindo as barras de agitação, por 30 min garantir a esterilidade; Quando terminar, transfira para a gabinete de biossegurança.
6. Anexe o borbulhador, sonda de temperatura e todos os componentes de uso único (exceto o slide) como ilustrado na Figura 1.
   1. Para o filtro de 0,2 µm (Figura 1, 11), retire o êmbolo da seringa 1 mL para torná-lo como um "adaptador". Forçar a tubagem do FB para este fim e anexar o filtro de 0,2 µm para a tubulação levando ao balão de crescimento.
   2. Aplica vácuo graxa de silicone ao redor da barb do adaptador slide (cuidar para não pegar qualquer graxa dentro) antes de conectá-lo, como este ajuda a evitar vazamentos de ar no sistema.
7. Encha o balão de fixação com 100 mL de 1% (p/v) de extrato de levedura, peptona de 2% (p/v) e 2% (p/v) glicose (YPD) e encha o balão de crescimento com 200 mL de YPD. Certifique-se de que o tubo do lado verde atinge os meios de comunicação em cada frasco.
8. Certifique-se de que todas as válvulas estão abertas. Anexar o borbulhador para um vácuo e conectar a bomba à tubulação do lado verde a jusante da armadilha da bolha.
9. Bombear o líquido em uma taxa de fluxo de 3,3 mL/min para completamente encher o lado verde, então dispense e descartar aproximadamente 1 a 2 mL da mídia, porque o primeiro par de mililitros geralmente contêm células mortas ou fragmentos aleatórios. Certifique-se que o lado verde do tubo é preenchido com a mídia e tem sem bolhas a jusante da armadilha da bolha antes de prosseguir.
10. Preencha o slide de canal e o reservatório com YPD, tomando cuidado para não introduzir bolhas.
11. Conecte o slide para o aparelho de fluxo e a bomba mais fluido para criar uma reserva de cerca de 0,5 m do lado laranja. Isso é para evitar acidentalmente ar prendendo no slide em caso de refluxo.
12. Preparar o aparelho de fluxo para o transporte para o microscópio: grampo fechado a entrada e saída do borbulhador e pinça válvulas de fixação frasco fechadas do lado o verde e o laranja. Certifique-se de que as tampas de rosca para o PD e FB são apertadas como eles podem soltar durante a autoclavagem.
13. Desconecte a bomba ao tubo para facilitar o transporte. Em seguida, mova todos os componentes, incluindo o misturador de chapa, em um recipiente secundário perto o microscópio.
14. Prepare o aparelho de fluxo para a imagem latente.
    1. Fixar a sonda de temperatura para o misturador de chapa e começar a aquecer o frasco do anexo 37 ° c. Mexa a mídia a 300 rpm e manter isso durante todo o experimento.
    2. Montar o slide no microscópio e usar fita se necessário fixá-lo firmemente.
    3. Anexar o borbulhador para um vácuo (não desfazer a pinça ainda).
    4. Ligar a bomba ao aparelho de fluxo no local indicado na Figura 1.
    5. Ligue a bomba com um caudal de 3,3 mL/min, deixe-o funcionar por aproximadamente 5 a 10 s e então remova a braçadeira de entrada/saída de armadilha de bolha.
    6. Permitir que a bomba continuar a execução enquanto aquece o balão de fixação. Uma vez que a mídia tem divulgado em todo o sistema de fluxo, verificar para a operação normal.
       1. Verifique os encaixes para ar vazando no montante da bomba (alguma formação de bolhas é normal), o fluido vazar a jusante.
       2. Verificar que o balão de mídia de crescimento, PD e FB são todos os meios de gotejamento do tubo de entrada (se não, isso poderia indicar um filtro entupido, ou uma pinça de orelha desapertada).
       3. Usando o microscópio, verifique se há células anexadas ou rolamento do slide de canal. Um número excessivo de células pode indicar contaminação durante a configuração, ou que a membrana de politetrafluoretileno (PTFE) da bolha da armadilha deve ser substituído.
15. Uma vez que a câmara de balão e incubação de fixação estão ambos a 37 ° C, adicione chega durante a noite de cultura das células fúngicas no balão de fixação para chegar a 1 x 10⁶ células/mL.
    Nota: O volume para adicionar em µ l pode ser calculado usando esta fórmula:
    
16. Espere 15 min para permitir que as células para se aclimatar.
17. Abra ambas as válvulas de balão de fixação lado verde e laranja ao fechar as duas válvulas de balão de crescimento para iniciar o fluxo de células.
18. Espere por aproximadamente 5 minutos permitir que as células alcançar o slide e permitir a focalização inicial do microscópio (este tempo pode precisar ser ajustada dependendo do comprimento do tubo de lado verde). Durante este tempo, ajuste o microscópio para os mesmos parâmetros de imagem utilizados em experiências anteriores. Se esta é a primeira execução, siga estes passos:
    1. Alternar para um objectivo de ar de baixa ampliação.
    2. Encontrar e se concentrar em um anexo ou brotamento pequenas células.
    3. Configurar o condensador para iluminação de Köhler e, em seguida, alternar para campo escuro.
    4. Defina o tempo de exposição a 300 ms.
    5. Ajuste a intensidade de iluminação até uma pequena célula é dim ainda claramente visível no contexto (um sinal à relação de fundo de aproximadamente 7 a 8 para uma célula filha de brotamento é um valor razoável). Marca/nota a intensidade de iluminação para experiências futuras.
    6. Configure o software para adquirir uma imagem a cada 2 min mais 2 h.
19. Começa a aquisição de imagens para a fase de penhora. Verifique depois de aproximadamente 5 e 10 min para garantir que o foco foi mantido. Se não, tente ajustar o foco imediatamente após a próxima imagem é adquirida.
20. Imediatamente depois de terminar a fase de fixação, salve o arquivo e abra as duas válvulas de balão de crescimento lado verde e laranja ao fechar as duas válvulas de balão acessório. Tome cuidado para não bater o palco se todas as válvulas estão no interior da câmara de incubação.
21. Desconecte a sonda do termómetro de agitador a placa de aquecimento.
22. Retirar o frasco de fixação do agitador a chapa e coloque o frasco de crescimento em seu lugar.
23. Configure o software para adquirir uma imagem a cada 15 min mais 22 h e começar a aquisição de imagens para a fase de crescimento. Re-focagem não deve ser necessário, mas é altamente recomendado para verificar o aparelho de fluxo depois de algumas horas.
    1. Verifique os encaixes para ar vazando no montante da bomba (novamente, alguma formação de bolhas é normal), o fluido vazar a jusante
    2. Verificar que o balão de mídia de crescimento, PD e FB são todos pingando mídia (se não, isso poderia indicar um filtro entupido, uma braçadeira de orelha desapertada ou uma obstrução em um arame farpado apropriado, se as células sendo usadas flocular).
    3. Verificar o nível do líquido no FB. Se a mídia está se aproximando do topo do frasco (mais de 1,5 cm acima da parte superior do filtro), aperte os dois screwcaps (não soltá-las, como este balão está sob pressão). Se eles não vão apertar mais, continuar o experimento (embora isto pode resultar em perda de) e substituir as gaxetas de borracha no PD e FB após a próxima limpeza.
24. Quando terminou a aquisição de fase de crescimento, salve o arquivo e abra as válvulas de balão de fixação lado verde e laranja que podem fazer um barulho, como a pressão libera o lado laranja. Puxe o tubo do lado verde proveniente de dois frascos de mídia até que estejam pelo menos vários centímetros acima da mídia. Funcionar a bomba a uma velocidade elevada (aproximadamente 100 mL/min ou mantenha pressionado o botão de avanço rápido da bomba) para remover todos os meios da tubulação, o que torna a limpeza muito mais fácil. Quando esvaziado, desligue o aparelho de fluxo da bomba e removê-lo do microscópio.

3. Limpe o aparelho de fluxo

1. Remover todos os componentes não-autoclavável (componentes de utilização única, borbulhador e sonda de temperatura), e autoclave aparato de 30 min. descarte de fluxo usado componentes de uso único, sonda limpa com etanol a 70% e reserve borbulhador.
2. Concluída a autoclavagem, descartar a mídia e enxaguar e reserve frascos de mídia. Em seguida, re-conecte o borbulhador, conectar um slide de canal ibidi deve ser usado para limpeza (reutilizáveis) e conectar o sistema de fluxo para a bomba no local mostrado na Figura 1.
3. O grampo fechado a válvula balão crescimento laranja.
4. Coloque aproximadamente 200 mL de água sanitária não diluída num copo de precipitação. Coloque as rolhas de borracha a lixívia e então começar a bomba em uma alta velocidade circular água sanitária em todo o aparato de fluxo (exceto todos os filtros). Uma vez preenchido com água sanitária, pare a bomba porque deixar a bomba em alta velocidade pode usar e quebrar o tubo.
5. Após o branqueamento por 15 min, segure as rolhas de borracha acima do copo e ligue a bomba novamente para remover a água sanitária do aparato de fluxo.
6. Repita as etapas de 3.4 e 3.5 duas vezes com excesso de água em vez de lixívia para lavar o sistema de fluxo. Durante esse tempo, limpe-os apenas com água porque outros agentes de limpeza irão corroer ou entupir os filtros.
   1. Coloque a tubulação que normalmente iria ligar para o filtro de mídia de 0,2 µm (proveniente do µm 2 FB) para a água do copo com as rolhas de borracha da etapa 3.6.
   2. Desconecte o tubo conectado na entrada do filtro embutido 20 µm, que pode geralmente ser separado com facilidade, apesar do gancho de orelha.
   3. Use um frasco de filtro de vácuo e uma longa seção de tubo através de uma rolha de 3 furos a reposição para criar um sistema de vácuo que pode se conectar ao aparelho de fluxo.
   4. Conectar este sistema de vácuo para a entrada da entrada de filtro de 20 µm e começar o vácuo; Isto puxará água através dos filtros na direção inversa, removendo as células mortas.
   5. Puxe pelo menos 200 mL de água através de filtros e, em seguida, remover o tubo da água para esvaziar as linhas de filtro de água.
   6. Desligue o sistema de aspiração do filtro de 20 µm, e reconecte o filtro à sua tubulação normal.

4. quantificar os vídeos

Nota: Todos os arquivos precisam ser convertidas para o formato de arquivo (TIF) de imagem de marca para trabalhar. Além disso, para comparar entre experiências, é fundamental que todas as imagens são tiradas com o microscópio mesmo e parâmetros de imagem, como discutido acima.

1. Baixe e instale o ImageJ, se já não estiver instalado.
2. Baixe o arquivo de macro suplementar e coloque-o na pasta ImageJ\macros.
3. Ajuste a macro fornecida:
   1. Abra uma pilha de imagem de uma experiência anterior no ImageJ e selecione um ponto de tempo com células presentes.
   2. Selecione do menu através de "imagem | Tipo | 8-bit".
   3. Selecione do menu através de "imagem | Ajustar | "Limiar de. Marque a caixa "fundo escuro" . Defina o menu suspenso do lado direito para o vermelho.
   4. Ajuste o valor inferior até que todas as células estão cobertas de vermelho com o mínimo de ruído em excesso (algumas manchas de células não é okey e serão processado para fora pela macro). Anote este valor inferior.
   5. Feche a janela do limiar e a imagem aberta.
   6. Selecione do menu através de "Plugins | As macros | Editar". Quando solicitado a abrir um arquivo: "mover para cima o nível de uma pasta", então selecione a pasta de macros e abra o arquivo de macro fluxo quantificação de biofilme.
   7. Altere o valor 15 em todas as instâncias de "setThreshold (15, 255);" para o valor determinado na etapa 4.3.4. Salve o arquivo e feche esta janela.
4. Selecione no menu através de "Plugins | As macros | Instalar"e selecione o arquivo de quantificação de biofilme de fluxo.
5. Agora, sob a "Plugins | Macros" menu, seis novas opções para vários quantificações vídeo aparecem. Executar a análise completa e selecione os arquivos de vídeo anexo e crescimento quando solicitado para realizar análises disponíveis todos os dados adquiridos e gerar automaticamente arquivos de saída.

Resultados

Imagens representativas de um normal durante a noite o lapso de tempo experimento usando o selvagem-tipo c. albicans células a 37 ° C podem ser vistas na Figura 2 e 1 de vídeo suplementar. As imagens foram aprimorado para melhorar a visibilidade de contraste. Realizou-se a quantificação dos dados originais e gráficos representativos podem ser vistos na Figura 2B. Para ge...

Discussão

Conforme descrito acima usar o sistema de fluxo permite a geração de quantitativos vídeos Time-Lapse de biofilme fungal crescimento e desenvolvimento. Para permitir comparações entre experiências é de fundamental importância para garantir que os parâmetros de imagem são mantidos os mesmos. Isto inclui assegurar que o microscópio é configurado para iluminação de Köhler para cada experimento (muitos guias estão disponíveis on-line para este processo). Além de parâmetros de imagem, existem alguns passos importantes para man...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba	Cole Parmer	07522-20	6
Cabeça da bomba	Cole Parmer	77200-60	6
Tubulação	Cole Parmer	96410-14	N/A
Adaptador de armadilha de bolhas	Cole Parmer	30704-84	3
Adaptador de vácuo de armadilha de bolhas para 1/4" Linha de vácuo ID	Cole Parmer	31500-55	3
Adaptador de filtro em linha (4 necessários)	Cole Parmer	31209-40	8,9
Lado laranja Y	Cole Parmer	31209-55	7
Lado verde Y	ibidi	10827	2
* Slides	ibidi	80196	4
* Slide luers	ibidi	10802	4
Vácuo armadilha de bolhas assistida	Elveflow/Darwin microfluídica	KBTLarge - Kit de armadilha de bolhas microfluídica	3
frascos de mídia	Corning	4980-500	1
0.2 µ m filtro de ar	Corning	431229	1
Garrafa de vidro rosqueada para PD e frasco de filtro (2 necessários)	Corning	1395-100	5,10
Tampa de rosca portada para PD e frasco de filtro (2 necessários)	Wheaton	1129750	5,10
Conector de tubulação com tampa de rosca	Wheaton	1129814	5,10
Conector de tubulação arruela chanfrada	Danco	88579	5,10
Arruela plana do conector de tubulação	Danco	88569	5,10
Braçadeiras para filtros em linha e Y a jusante (7 necessários)	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
Ferramenta de fixação	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 μ m filtro de mídia em linha	Analytical Scientific Instruments	850-1331	8
10 μ m filtro de mídia em linha	Analytical Scientific Instruments	850-1333	9
2 μ filtro de mídia de entrada m	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0.22 µ filtro de mídia m	Millipore	SVGV010RS	11
* 0.22 µ Filtro de mídia M " adaptador"	BD Biosciences	329654	11
Rolha de borracha	Fisher Scientific	14-131E	1
Agitador de placa de aquecimento com porta de sonda externa	ThermoFisher Scientific	88880006	N/A
Sonda de temperatura	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A