Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Dan Zhou; Lei Tan; Jian Li; Tanbin Liu; Yi Hu; Yalan Li; Sachiyo Kawamoto; Chengyu Liu; Shiyin Guo; Aibing Wang

doi:10.3791/58467

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

9K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/58467

⸱

20 de novembro de 2018

Dan Zhou^*¹^,² , Lei Tan^*¹ , Jian Li^*³ , Tanbin Liu¹ , Yi Hu¹ , Yalan Li¹ , Sachiyo Kawamoto⁴ , Chengyu Liu⁵ , Shiyin Guo³ , Aibing Wang¹

¹Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), ²Department of Pathology, Georgetown University Medical School, ³College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), ⁴Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), ⁵Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.

Resumo

Relativo a questões dos efeitos fora do alvo e a dificuldade de inserção de um fragmento de DNA a longa na aplicação do desenhador nucleases para tronco embrionárias, edição de genoma tecnologia de gene-alvo baseada em célula (ES) não tem estas deficiências e é amplamente usado para modificar o genoma do animal/rato que vão desde grandes exclusões/inserções para substituições de nucleotídeo único. Notavelmente, identificar os relativamente poucos eventos de recombinação homóloga (HR) necessários para obter desejado ES clones é um passo fundamental, que exige métodos precisos e confiáveis. Mancha do Sul e/ou PCR convencional é frequentemente utilizado para esta finalidade. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados de usar esses dois métodos para identificar o HR eventos que ocorreram em pilhas do ES do rato em que o gene Myh9 endógeno destina-se a ser interrompido e substituído por cDNAs codificação outras cadeias pesadas de miosina nonmuscle do IIs (IIs NMHC). Todo o processo de mancha do Sul inclui a construção de direcionamento vector(s), eletroporação, seleção de drogas, a expansão e armazenamento de células de ES/clones, a preparação, digestão e mancha de DNA genômico (gDNA), a hibridização e lavagem de ição e uma etapa final de autoradiografia sobre os filmes de raio-x. PCR pode ser realizado diretamente com gDNA preparado e diluído. Para obter resultados ideais, as sondas e a enzima de restrição (RE) sites de corte para a mancha do Sul e os primers para PCR devem ser cuidadosamente planejadas. Embora a execução de mancha do Sul é demorada e trabalhosa e resultados PCR tem falsos positivos, a correta identificação pela mancha do Sul e a triagem rápida pelo PCR permite que o aplicativo único ou combinado desses métodos descritos Neste trabalho a ser amplamente utilizado e consultado pela maioria dos laboratórios na identificação de genótipos de pilhas do ES e geneticamente modificado animais.

Introdução

A tecnologia do gene definião HR em pilhas do ES murino fornece uma ferramenta poderosa para dissecando as celulares consequências de mutações genéticas específicas¹^,². A importância e o significado desta tecnologia são refletidas no seu reconhecimento por 2007 Prêmio Nobel de Fisiologia ou medicina de³^,⁴; Enquanto isso, ele representa o advento da era moderna da engenharia do gene⁵. Gene-alvo através de HR pode ser utilizado para engenheiro praticamente qualquer alteração desde mutações pontuais até grandes rearranjos cromossôm....