Aqui nós apresentamos um protocolo para complexos de tilacoides solubilizado, separadas por eletroforese em Gel de verde nativo. Bandas de gel verde posteriormente são caracterizadas por tempo correlacionados Single Photon contagem (TCSPC) e etapas básicas para análise de dados são fornecidas.
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Artigo de método
Separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em Gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único Time-Correlated
Neste artigo
Resumo
Resumo
As reações de luz da fotossíntese são realizadas por uma série de complexos de proteínas pigmentadas nas membranas tilacoides. A estequiometria e organização destes complexos é altamente dinâmico no longo e escalas de tempo curto devido a processos que se adaptam a fotossíntese para mudanças nas condições ambientais (ou seja, não-fotoquímica têmpera, transições de estado e o resposta a longo prazo). Historicamente, estes processos têm sido descritos espectroscopicamente em termos de mudanças na fluorescência da clorofila, e espectroscopia continua a ser um método vital para o monitoramento de parâmetros fotossintéticos. Há um número limitado de maneiras em que a subjacente dinâmica complexa de proteínas pode ser visualizada. Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para a separação de alta resolução e visualização dos tilacoides complexos, eletroforese em gel verde nativo. Este método é acoplado com tempo-correlacionados fotão contando para caracterização detalhada das propriedades de fluorescência da clorofila das bandas separadas no gel verde.
Introdução
Organismos fotossintéticos constantemente devem ajustar sua fisiologia para mudanças nas condições ambientais para maximizar sua produtividade e competir com sucesso com os vizinhos,1. Isto é especialmente verdadeiro para a maquinaria responsável para as reações de luz da fotossíntese, como luz ambiente condições podem flutuar por três ordens de magnitude entre as sombras e a luz do sol. Além disso, fatores ambientais como estresse de calor, frio ou seca podem reduzir a disponibilidade de dióxido de carbono para a fixação de carbono, que é o coletor de elétrons naturais para os produtos das reações luz. Plantas devem, portanto, colher e utiliza....
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Protocolo
1. as soluções preparação para despejar géis verdes nativas
- Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para a resolução de géis, consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 8.3.
- Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para empilhamento géis consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 6.3.
- Armazene esses buffers a 4 ° C para evitar o crescimento de mofo.
Nota: Os buffers são estáveis por meses a 4 ° C, para que preparação de 100-200 mL de cada buffer para uso contínuo é recomendada. - Preparar 1 L de 10x executando o buffer que contém 250 mM Tris HCl ....
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Resultados
Resultados representativos para a electroforese do gel verde são apresentados na Figura 1. Pista 1 fornece um exemplo de resultados ideais para eletroforese em gel verde de espinafre contém, em que um número máximo de faixas verdes claras e nítidas é visível. Estes resultados são um pouco atípicos, em parte porque não todas as bandas que vi na pista 1 estão normalmente presentes em uma determinada amostra. Limpeza da amostra adicional, sob a forma de isolamen.......
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Discussão
Um nativo gel executar e solubilização de tilacoides bem sucedida resultará na resolução de várias bandas de verdes visíveis distintas sobre o gel sem distorção significativa ou manchas das bandas. Sobrecarga do gel, uma alta concentração de detergente, um pH de amostra incorreta, não dissolvido material, executando o gel muito rapidamente ou a uma temperatura muito alta, e um gel impropriamente derramado são todos os fatores que podem contribuir para complexos de tilacoides mal resolvido. Otimizar as condições do gel em.......
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Financiamento e apoio foram fornecidos pelo departamento de química da Universidade de estado de Michigan.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Glicina | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decil Maltosídeo | Sigma | D7658 | n-decil beta d maltopiranosídeo, não dodecil maltosídeo ou alfa decil maltosídeo |
| Octil Glicosídeo | Sigma | O8001 | |
| Acrilamida | BioRad | 161-0148 | Solução de 37,5/1 C a 40% |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Persulfato de amônio | BioRad | 161-0700 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma | M2670 | |
| Cloreto de potássio | Sigma | P9333 |
Referências
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A.
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Reimpressões e permissões
