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Artigo de método

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

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DOI:

10.3791/58478

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21 de outubro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.

Resumo

Descrevemos um fluxo de trabalho para a análise da expressão gênica de células endoteliais, sujeito a um fluxo constante de laminar usando múltiplas câmaras monitoradas fluxo paralelo-placa. As células endoteliais formam o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos e são cronicamente expostas para a força de fricção do fluxo de sangue chamado tensão de cisalhamento. Sob condições fisiológicas, a função de células endoteliais na presença de várias condições de tensão de cisalhamento. Assim, a aplicação das condições de tensão de cisalhamento em modelos em vitro pode fornecer maior conhecimento sobre respostas endotelial em vivo. A câmara de fluxo paralelo-placa anteriormente publicada por Lane et al 9 é adaptado para estudar a regulação gênica endotelial na presença e na ausência de fluxo laminar (não-pulsátil) constante. Principais adaptações na configuração para o fluxo laminar, tal como apresentada aqui incluem um ambiente grande, dedicado aos circuitos de casa fluxo simultâneo, o controlo das taxas de fluxo em tempo real e a inclusão de uma referência exógena do RNA para a normalização da dados PCR quantitativos em tempo real. Para avaliar tratamentos/condições múltiplas com a aplicação da tensão de cisalhamento, vários circuitos de fluxo e bombas são utilizadas simultaneamente dentro da mesma incubadora aquecida e umidificada. O caudal de cada circuito de fluxo é medido continuamente em tempo real para padronizar as condições de tensão de cisalhamento ao longo dos experimentos. Porque estas experiências têm várias condições, também utilizamos um RNA exógeno de referência que é cravado no momento da extração do RNA para a normalização da extração do RNA e eficiências de síntese do cDNA da primeiro-costa. Estas etapas minimizam a variabilidade entre as amostras. Esta estratégia é empregada em nosso pipeline para a análise de expressão de gene com tensão de cisalhamento experimentos utilizando a câmara de fluxo paralelo-placa, mas partes desta estratégia, tais como os exógenos referência pico-no RNA, podem facilmente e custos reduzidos a ser usadas para outras aplicações.

Introdução

Vascular em células endoteliais forma o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos no sistema cardiovascular fechado de espécies superiores. Eles formam a interface entre o sangue e os tecidos e são caracterizados por luminal e superfícies abluminal. O endotélio é um sistema adaptável, ativo e diversificado que regula o fluxo de sangue, tráfico de nutrientes, imunidade e o crescimento de embarcações de sangue novo1. No corpo, as células endoteliais normalmente existem em um ambiente onde eles são expostos para a força de fricção de circulação, tensão de cisalhamento2. Tensão de cisalhamento é um importante regulador da célula endotelial gene expressão3, e células endoteliais tentam manter a tensão de cisalhamento dentro de um determinado intervalo de2,4. Células endoteliais demonstram angiogênico padronização na ausência de tensão de cisalhamento5 que podem melhorar a perfusão do tecido. Padrões regionais de fluxo perturbado e alterado tensão de cisalhamento estão associados com a expressão de genes inflamatórios6 e o desenvolvimento de aterosclerose7,8. Assim, modelos que incluem a tensão de cisalhamento são um componente importante da compreensão de regulação gênica endotelial.

Nós descrevemos um método para estudar a regulação gênica em células endoteliais vasculares sob tensão de cisalhamento. Este sistema usa fluxo não-pulsátil e imita os níveis de tensão de cisalhamento fluido e concentração de oxigénio que as condições de modelo para as células endoteliais arteriais. Este protocolo inclui detalhes de métodos para o knockdown de gene usando o RNA de interferência (RNAi), o set-up para a aplicação da tensão de cisalhamento com o dispositivo de fluxo paralelo-placa e métodos para o pico-de uma referência exógena do RNA antes da análise por transcriptase reversa quantitativa cadeia da polimerase (RT-qPCR). Esse pipeline é usado para estudar a regulação gênica em células endoteliais na presença e na ausência de tensão de cisalhamento laminar e inclui uma adaptação do aparato de fluxo paralelo-placa descrita por Lane et al 9. esta configuração particular foi projetada para facilitar a avaliação simultânea das várias condições experimentais que permite a comparação direta das condições de tensão de cisalhamento, bem como a normalização de análise de RNA. Uma grande unidade aquecida com umidade controlada é utilizada para permitir que várias câmaras de fluxo separado e bombas para ser executados simultaneamente, com taxas de fluxo monitorizadas para cada conjunto de câmara de fluxo em tempo real. A aplicação desta configuração é usada para knockdown gene usando RNAi na configuração da tensão de cisalhamento/fluxo laminar, mas aspectos do presente protocolo podem ser aplicados a qualquer avaliação da expressão do RNA.

Abordagens comuns para a aplicação da tensão de cisalhamento por células endoteliais incluem microfluidic sistemas10, um viscosímetro cone-placa e11e uma câmara de fluxo paralelo-placa12. Microfluidic sistemas de vários fabricantes tem sido útil no estudo de mechanobiology e mechanotransduction em células múltiplas e tipos de tecido e uma variedade de estímulos biofísicos. Por células endoteliais, eles tem sido usados para estudar células endoteliais em isolamento, bem como a interação de células endoteliais e o tráfico de imune ou tumor de células10. No entanto, estes sistemas são menos adequados para a recuperação de um grande número de células9. O viscosímetro cone-e-placa e câmaras de fluxo paralelo-placa permitam a recuperação de um grande número de células em monocamadas confluente12. Estes sistemas podem gerar uma gama de cisalhamento forças e padrões de12. A câmara de fluxo paralelo-placa montagem9 tem a vantagem essa imagem em tempo real pode ser realizada através da janela de vidro para avaliar a morfologia celular em qualquer ponto do tempo. Além disso, o perfusato pode ser coletado em condições estéreis. Para o sistema aqui apresentado, o fluxo também pode ser monitorado em tempo real e em um set-up multi-câmara, que facilita a manutenção das condições de cisalhamento entre as câmaras.

Para experiências representativas, veia umbilical humana células endoteliais (HUVEC), que representam um tipo de célula endotelial macrovascular, são utilizadas, e as condições de tensão de cisalhamento, usamos (1 Pa) refletem condições arteriais (0,1 - 0,7 Pa). No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos de células endoteliais, e as condições de tensão de cisalhamento podem ser ajustadas de acordo com a questão experimental. Por exemplo, a avaliação de células endoteliais humanas em condições que o modelo de circulação venosa exigiria mais baixos níveis de tensão de cisalhamento (Pa 1-6) e estudos que o modelo de circulação microvascular utilizaram-se os níveis de tensão de cisalhamento de 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Além disso, a tensão de cisalhamento pode variar mesmo entre células endoteliais dentro do vaso sanguíneo mesmo6. Na configuração atual, é usado um único sistema de monitoramento que pode monitorar simultaneamente quatro loops de fluxo separado. Para laboratórios que precisam de mais fluxo de loops, há espaço no ambiente dedicado para um sistema de monitoramento adicional.

RT-qPCR é usada para a quantificação absoluta de expressão gênica na configuração da tensão de cisalhamento. A expressão relativa dos genes-alvo é frequentemente usada para comparar a expressão do RNA através de condições. Algumas espécies de RNA podem existir em quantidades muito baixas ou estar ausente, complicando assim as medições relativas. Por exemplo, há muito tempo não codificante RNAs em células endoteliais podem exercer efeitos potentes em números relativamente baixos de cópia por célula5. Além disso, as diferenças na eficiência da primeira demão podem levar a uma interpretação imprecisa do utilizando o método de limiar (Ct) do ciclo de delta-delta para analisar os dados. Para resolver esta preocupação, realizamos quantificação absoluta, gerando uma curva de calibração usando uma quantidade conhecida de plasmídeo. Além disso, complementar síntese de DNA (cDNA) é um processo ineficiente, e as diferenças na eficiência do cDNA podem contabilizar diferenças na expressão do RNA entre condições e entre amostras15. A aplicação da tensão de cisalhamento e/ou reagentes de transfecção pode afetar a viabilidade, apoptose e proliferação celular, ou adicionar componentes que podem interferir com a síntese do RNA de isolamento e/ou de cDNA. Para considerar a possibilidade de viés de isolamento de RNA e a síntese do cDNA, usamos um pico-em controlo RNA sintetizados no laboratório, adicionado no momento da extração do RNA e medido com cada cDNA síntese através de RT-qPCR. Isto permite não só o ajustamento técnico diferenças na síntese do RNA de extração e cDNA mas também permite o cálculo das quantidades absolutas por célula, quando a contagem de células é conhecida.

Este sistema utiliza etapas adicionais para manter a similaridade ou esclarecem diferenças técnicas entre as condições. Enfatizamos especialmente estes passos devido à natureza complexa dessas experiências, que envolvem múltiplas instalações físicas e condições experimentais que podem levar à variabilidade experimental.

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Protocolo

1. preparação de referência exógena do RNA

Nota: Escolha uma referência exógena do RNA que não existe em espécie ou modelo de interesse. Para sistemas de mamíferos, luciferase de vaga-lume do RNA pode ser utilizado.

  1. Linearização de plasmídeo de referência exógena do RNA
    1. Prepare a referência exógena do RNA pelo menos 48 h antes da extração de RNA antecipada. Obter ou produzir um clone de cDNA escolhido exógena da referência de RNA, como um clone de cDNA de luciferase de vaga-lume em um vetor do plasmídeo adequado para a transcrição em vitro (ver Tabela de materiais).
    2. Executar a enzima de restrição (RE) digestão de 1 µ g de longa-metragem do plasmídeo (o plasmídeo de luciferase de vaga-lume é pSP-luc + que tem 4100 bp) single-cortador RE (XhoI) em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Escolher um RE que é um único cortador (corta o plasmídeo apenas 1x) na extremidade 3' da sequência de RNA que deixa uma 5' saliência ou fim brusco referência exógena. Para uma preparação típica, realizar sete reações de linearização do plasmídeo (etapas 1.1.4 - 1.1.7) em paralelo para gerar suficiente concentração de RNA e quantidade para completar um conjunto de experiências ou um projeto.
      1. Medir a concentração de plasmídeo utilizando espectrofotometria ou spectrofluorometry.
      2. Prepare uma mistura RE em cada tubo: adicione 4 µ l de XhoI (20.000 unidades/mL), 8 µ l de tampão, x µL de plasmídeo (1 µ g) e suficiente H2O para chegar a uma solução total de 80 µ l.
      3. Incubar a mistura RE por 2 h a 37 ° C. Use o RE de acordo com o protocolo do fabricante, pois qualquer modificação pode resultar em aumento da atividade estelar ou clivagem não-específicas do ADN alvo. Calor inativar a mistura de reação por 20 min a 65 ° C.
      4. Termina o resumo RE com precipitação do álcool etílico em cada tubo. Para a mistura RE, adicione diretamente 4 µ l de pH de EDTA 0,5 M 8.0, 8 µ l de pH de acetato de sódio 3M 5.2 e 184 µ l de etanol 100%. Misture bem e congelar a mistura a-20 ° C por 30 min.
      5. Girar a mistura em 4 ° C por 20 min em uma força centrífuga relativa (RCF) 16.100 x g.
      6. Remova o sobrenadante com uma ponta fina, sem tocar a pelota. Secar ao ar livre a pelota por 5 min e Resuspenda-lo em 6 µ l de H2O (aquecido a 37 ° C) pipetando e descer 5x - 10x.
      7. Confirme a linearização do plasmídeo luciferase executando o produto digerido em gel de agarose 2% contendo brometo de etídio (EtBr) juntamente com uma 1 kb + escada, uma escada supercoiled e corte e plasmídeo sem cortes. Inspecionar o gel e prossiga para a transcrição em vitro , se a pista para o corte do plasmídeo mostra uma única banda no ~ 4 kb (o plasmídeo sem cortes terá três bandas; A Figura 1).
        Cuidado: EtBr é cancerígeno. Trabalho em uma coifa de química.
  2. Em transcrição de vitro do plasmídeo de referência exógena do RNA
    1. Para cada tubo de produtos plasmídeo digerido, executar a transcrição in vitro usando um método de transcrição em vitro (ver Tabela de materiais). Siga as instruções do fabricante e use o apropriado do fago RNA polimerase. Se o método de síntese do cDNA requer uma cauda poli (a), ou outras aplicações exigem uma cauda poli (a), escolha um método de transcrição em vitro que inclui uma adição da cauda poli (a) (ver Tabela de materiais).
    2. Combinar tudo em vitro transcrito produtos em um único tubo de polipropileno de 1,5 mL antes da purificação.
  3. Purif icação do RNA a partir da reação de transcrição em vitro
    1. Purificar em vitro transcrito kit de produtos com um em vitro transcrição limpar (ver Tabela de materiais). Por favor, siga o protocolo do fabricante.
    2. Avaliar a concentração de RNA medindo absorvância a 260 nm, utilizando espectrofotometria.
      Nota: A concentração de RNA é calculada usando a lei de Beer-Lambert. Este afirma que a absorvância de ácidos nucleicos (que absorvem a luz fortemente em 260 nm) é proporcional à concentração. Uma absorvância de 1.0 é igual a 40 µ g/mL de single-stranded do RNA.
  4. Alíquotas do estoque do RNA em PCR tubos para uso experimental
    1. Certifique-se que a concentração de RNA é 1 µ g / µ l.
      1. Se a concentração de RNA é > 1 µ g / µ l, diluir o estoque de 1 µ g / µ l. alíquota 1 µ l em PCR tubos e armazená-los a-80 ° C.
      2. Se a concentração de RNA é < 1 µ g / µ l, precipitação adicional usando acetato de amónio de 5m (fornecido no kit) pode ser realizada conforme o protocolo do fabricante. Se a concentração de RNA ainda é < 1 µ g / µ l, prosseguir com alíquotas de 1 µ l em cadeia da polimerase.

2. Deslize o revestimento

Nota: Os passos 2.1-2.10 devem ser realizada 24-48 h antes da semeadura a célula antecipada.

  1. Pré-aqueça o forno a 250 ° C.
  2. Usar luvas estéreis, enrole cada lâmina de vidro 2 x com folha de alumínio. Evite tocar a superfície da lâmina diretamente.
  3. Asse os slides no forno por 1 h a 250 ° C e permitir que os slides arrefecer à temperatura ambiente.
    Nota: Este passo é importante para destruir qualquer contaminante endotoxinas.
  4. Enquanto os slides são de arrefecimento, fazer uma solução stock de fibronectina de 1 mg/mL com água destilada e incube durante 30 min a 37 ° C para dissolver. Fazer alíquotas de 100 µ l. Reserve as alíquotas para uso imediato e congelar as alíquotas restantes para uso futuro.
  5. Desembrulhe o revestimento externo da folha de alumínio antes de colocar a lâmina de vidro em uma biossegurança do armário. Execute etapas 2,6-2,7 e 2.9 no armário a biossegurança.
  6. Coloque a lâmina de vidro em um prato de cultura de célula estéril de 4-bem retangular.
  7. Dilua a fibronectina solução 1: 100 com água destilada. Cubra cada slide com 1 mL de fibronectina diluída, gota a gota, com uma pipeta. Verifique se que o slide inteiro é coberto.
  8. Incube os slides em uma incubadora de cultura de tecidos, a 37 ° C por 24-48 h.
  9. Após a incubação, Aspire a fibronectina inclinando o prato de cultura de células 4-bem. Evite tocar o slide diretamente com o aspirador.

3. célula de propagação no vidro desliza

  1. Contar as células endoteliais humanas no início passagem (passagem 2-5) e sementes de ~1.0 x 106 células para cada slide fibronectina revestido de vidro com 1ml de mídia (1.0 x 106 células/mL meios de comunicação). As células 24h antes da aplicação antecipada de fluxo laminar as sementes se nenhum tratamento for executada.
    Nota: Estes números são usados como um guia para experimentos com 24 h de fluxo.
    1. Ajuste a densidade de semeadura para alcançar uma monocamada confluente das células no momento da colheita de célula e extração do RNA.
  2. Deixar que as células aderem ao slide por 15 min a 37 ° C.
  3. Adicionar 3 mL de mídia em cada poço do prato de cultura celular para cobrir o slide e incubar a 37 ° C por 24 h com 5% CO2células.

4. pequenos parasitas RNA (siRNA) Transfection

  1. Preparação de células em lâminas de vidro para experimentos de transfecção e fluxo de siRNA
    1. Siga o protocolo nas etapas 2 (revestimento de slide) e 3 (célula semeadura em lâminas de vidro) para preparação de slide de vidro e revestimento para experiências de fluxo.
    2. Semente células 24 h antes do tratamento de siRNA (48 h antes da aplicação do fluxo laminar).
    3. Semente endoteliais células humanas na mídia sem antibióticos em 750.000 a 1 x 106 células por slide para atingir 85% - 95% confluência no dia seguinte.
      Nota: HUVEC são utilizados no presente protocolo.
  2. Preparação de complexos de reagente de transfeccao siRNA-lipídios-baseado (por slide)
    1. Design personalizado siRNAs ou ordem premade siRNAs para o gene desejado de interesse.
      Nota: Execute as seguintes etapas em uma armário de biossegurança.
    2. Adicione 6 µ l de siRNA (estoque de 20 µM) em 414 µ l de meio de soro reduzida (ver Tabela de materiais) e misture suavemente pipetando.
    3. Diluir a 49,5 µ l de reagente de transfeccao suavemente mistos baseados em lipídios (ver Tabela de materiais) em 130,5 µ l de meio de soro reduzida.
    4. Misture delicadamente e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
    5. Combine siRNAs diluídos e reagente de transfeccao baseadas em lipídios, misture delicadamente e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Misture delicadamente para evitar a interrupção dos complexos de reagente de transfeccao baseada em lipídios.
      Nota: A solução pode parecer nublada como forma de complexos.
    6. Enquanto estão se formando complexos, remover o meio de crescimento e lavar as células 1 x com médio reduzido de soro.
    7. Adicione 2,4 mL de meio de soro reduzida para cada slide.
    8. Adicionar 600 µ l de complexos de reagente suavemente misturados transfeccao siRNA-lipídios-baseado para cada prato e a placa de trás e a mistura de rock. Assegurar a concentração final de siRNA é 40 nM. Certifique-se de que o slide é completamente coberto.
    9. Incube as células a 37 ° C por 4 h.
    10. Adicione 1 mL de meio de crescimento de células endoteliais livre de antibióticos contendo 3 x a concentração normal de soro fetal bovino (FBS) sem remover a mistura de transfeccao.
    11. Incube as células a 37 ° C até que esteja pronto para usar.

5. cálculo da taxa de fluxo baseado no desejada tensão de cisalhamento9

  1. Calcule a taxa de fluxo com base nas tensões de cisalhamento desejadas de acordo com a seguinte equação:
    figure-protocol-1
    Aqui,
    Q é a taxa de fluxo em mL/min;
    Τ é a tensão de cisalhamento desejado em Dinas/cm2 (1 Pa = 10 Dinas/cm2);
    w é a largura da câmara de fluxo paralelo-placa em cm;
    h é a altura da câmara de fluxo paralelo-placa em cm;
    µ é a viscosidade da mídia no cP (g/cm·s).
    Nota: A tensão de cisalhamento laminar típico experimentos (não-pulsátil) este fluxo de trabalho são conduzidos no τ = 1 Pa (10 Dinas/cm2). µ pode ser medido usando um viscosímetro como um viscosímetro cone-e-placa e pode variar dependendo do conteúdo dos meios de comunicação incluindo o soro e o dextran adicional9.
  2. Para alcançar um específico τ (tensão de cisalhamento), ajuste a taxa de fluxo e/ou viscosidade. Em taxas de fluxo superiores, células aderentes podem dissociar-se do slide. Taxas de fluxo de amostra com câmaras de fluxo típico são mostradas na tabela 1.

6. configuração de um ambiente dedicado para monitorar o sistema e várias câmaras de fluxo paralelo-placa (Figura 2)

  1. Use uma grande unidade/incubadora aquecida com várias prateleiras, acesso interno da electricidade e portas de vidro — conhecido como da praia (ambiente interno com ajustável CO2 ) e calor — abrigar múltiplas câmaras de fluxo simultaneamente para experimentos que exigem tanto a tensão de cisalhamento e a comparação direta entre dois ou mais tratamentos ou saídas (ou seja, DNA, RNA e proteína).
    Nota: A praia permite a monitorização frequente do circuito de fluxo, incluindo a taxa de fluxo, sem interrupções frequentes do ambiente.
  2. Assegure a adequada CO2 está disponível para o experimento, e que o CO2 monitor é funcional. Certifique-se a bandeja de água é devidamente preenchida, tal que haverá ar umidificado.

7. instalação do aparato de fluxo paralelo-placa

Nota: Para a fabricação de placas paralelas, por favor consulte Lane et al 9.

  1. Autoclave o fluxo câmara Luers, reservatório, amortecedor, tubos e placas para cada configuração de câmara de fluxo paralelo-placa conforme indicado na tabela 2.
  2. Instalação da Assembleia de circuito de fluxo (Figura 3).
    1. Coloque toalhas estéreis para a segurança biológica do armário. Monte o sistema de malha de fluxo, primeiro sem a câmara de fluxo paralelo-placa, no gabinete de segurança biológica.
    2. Conecte o conjunto de tubos para o reservatório:
      1. Inserir um tubo duro #14 para um buraco e dois #14 tubos macios nos outros dois furos na tampa do reservatório de fluxo. Certifique-se de que um dos tubos de suave toque o fundo do reservatório como tubo de saída .
      2. Coloque um 1/16" Luer macho no final do disco #14 tubo e anexar um filtro estéril como uma entrada de ar.
      3. Coloque um 1/16" Luer fêmea no final do #14 suave influxo do tubo, proveniente do reservatório e anexar uma torneira de 4 vias.
        Nota: Para análise de expressão do gene ou outros estudos onde perfusates não precisam ser coletados, 2 vias torneiras podem ser usadas em vez de 4 vias torneiras neste protocolo.
      4. Coloque um 1/16" Luer macho na extremidade do tubo de escoamento suave #14, proveniente do reservatório.
    3. Conecte a tubulação de saída do reservatório à tubulação da bomba: Coloque um 1/16" Luer fêmea em cada extremidade de um tubo rígido #13 (tubulação de bomba). Ligar o tubo de escoamento suave #14 do reservatório para o tubo duro #13 conectando-se 1/16" Luers masculino e feminino juntos.
    4. Conecte o tubo de bomba com tubo 'ponte de amortecedor': Coloque um 1/8" macho Luer e um 1/8" Luer fêmea em cada extremidade de um tubo macio de #16. Conectar-se a 1/16" Luer fêmea do tubo duro #13 (na extremidade de saída da tubulação da bomba) com o 1/8" macho Luer do tubo macio #16.
    5. Montar a tubulação para o amortecedor de fluxo: Coloque um 3/16" Luer macho em uma extremidade do tubo macio de #25 e repita isto para o outro lado do amortecedor do fluxo. Prenda as extremidades livres dos tubos macios #25 para cada lado do amortecedor do fluxo.
    6. Conecte o tubo de 'ponte de amortecedor' com a tubulação para o amortecedor de fluxo: Conecte um tubo macio #25 do amortecedor de fluxo com o tubo macio #16 da 'ponte amortecedor' usando a 1/8" fêmea Luer do lado #16 'ponte amortecedor' e o já colocado 3/16" Luer macho do lado de tubo macio amortecedor #25.
    7. Monte o tubo 'ponte de câmara':
      1. Coloque um 1/8" fêmea Luer e um 1/8" macho Luer em cada extremidade de um tubo macio de #16 (tubulação 'ponte de câmara').
      2. Conectar-se a 1/8" fêmea Luer da ponte câmara' com o 3/16" Luer macho no #25 tubo macio da extremidade livre do amortecedor do fluxo.
      3. À 1/8" Luer macho (extremidade livre) do tubo de 'ponte de câmara', coloque uma torneira de 4 vias.
    8. Conecte a torneira de 4 vias da extremidade livre 'ponte de câmara' a torneira de 4 vias do tubo macio influxo reservatório (da etapa 7.2.2.3). Feche as torneiras.
    9. Adicione mídia para o reservatório e o amortecedor. Para a exposição de 48h a tensão de cisalhamento, adicione 35 mL de mídia para o reservatório e 25 mL para o amortecedor. Ajuste o volume dos meios de comunicação em função da duração do experimento o fluxo e o número de células semeado.
    10. Trazer o sistema de malha de fluxo montado na bomba na praia. Coloque o tubo duro #13 (tubulação de bomba) na cabeça da bomba e fixá-lo. Abra as torneiras.
    11. Ligue a bomba e lentamente, aumentar a velocidade da bomba. Deixa a mídia circular através do sistema de laço. Verifique se há qualquer vazamento ou obstrução (por exemplo, acúmulo de pressão). Certifique-se de que a mídia está fluindo para o reservatório.
  3. Instalação do conjunto de câmara do fluxo
    1. Coloque um 1/8" fêmea Luer em uma extremidade de um #16 suave do tubo e anexar uma torneira de 4 vias. Conecte a extremidade livre do tubo para o lado direito da placa superior (entrada lateral).
    2. Coloque um 1/8" Luer macho em uma extremidade de um #16 suave do tubo e anexar uma torneira de 4 vias. Conecte a extremidade livre do tubo ao lado esquerdo da placa superior (saída lateral).
    3. Coloque um 1/8" macho Luer e um 1/8" Luer fêmea em cada extremidade de um tubo macio de #16 (tubulação de armadilha de bolha). Fixar o tubo de bolha armadilha através a 1/8" macho Luer. Anexar uma torneira de 4 vias para a outra extremidade da tubulação através de 1/8" fêmea Luer.
    4. Usando uma pinça estéril, transferi a lâmina de vidro celular-semeado do prato de cultura de células 4-bem para o recesso na placa inferior. Certifique-se de lado célula-semeado da lâmina de vidro é virada para cima.
    5. Utilizando uma seringa de 10 mL, adicione 10 mL de mídia quente para a placa de fundo dentro da linha de gaxeta vermelha ao redor da placa. Permitir que a mídia de fluxo através do slide e cobrir as células. Evite adicionar mídia diretamente para o slide.
    6. Coloque delicadamente a placa superior sobre a placa inferior, alinhando-se de um lado para o outro. Evite a introdução de bolhas de ar. Aparafuse as placas firmemente.
    7. Remova as bolhas de ar da bolha armadilha abrindo a torneira de passagem no lado direito (influxo) da placa e suavemente irrigando 20ml de mídia quente, usando uma seringa de 30 mL. Verifique se a torneira do lado esquerdo (saída) da placa está fechada e que a mídia está fluindo através da torneira de armadilha de bolha (aberto). Descarte a mídia corada.
    8. Feche a torneira de passagem sobre o borbulhador e abra a torneira do lado esquerdo (vazão) da câmara. Elevar o lado esquerdo (vazão) da câmara para um ângulo de 45° e lave delicadamente 20ml de mídia quente usando uma seringa de 30 mL do lado direito (influxo) da câmara para remover as bolhas de ar da câmara. As bolhas podem ser visualizadas através da janela. Descarte a mídia corada.
    9. Feche as torneiras de ambos os lados da câmara e cap. Inspecione as células por microscopia.
    10. Transporte a câmara para a praia com o sistema de malha previamente montado.
    11. Lentamente, diminuir a velocidade da bomba e pausar a bomba. Feche as torneiras sobre o sistema de malha de fluxo para evitar fugas.
    12. Ligue a câmara e loop sistema juntos através de torneiras. Abra todas as torneiras.
    13. Lentamente, aumentar a velocidade da bomba e examinar o set-up para qualquer vazamento ou obstrução. Assegure os meios de comunicação circula em uma direção e retorna para o reservatório.
    14. Coloque o sensor de fluxo do tubo 'ponte de câmara' localizado no lado de entrada da câmara. Certifique-se que o sensor é orientado corretamente na direção do fluxo.
    15. Ajuste a velocidade da bomba para obter a taxa de fluxo que foi calculada anteriormente, baseia a desejada tensão de cisalhamento.
      Nota: A taxa de fluxo pode variar dependendo da altura e largura de cada câmara, bem como a viscosidade dos meios de comunicação.
    16. Ligue o CO2 tanque para atingir 5% de CO2 e coloque uma bandeja de água dentro da praia.

8. a colheita de células e extração do RNA da câmara de fluxo

  1. Concluído o período de tempo desejado de fluxo, lentamente, abaixe a velocidade da bomba peristáltica para 0 e desligá-lo. Rapidamente, feche todas as torneiras abertas e remova a câmara e o tubo anexado com uma torneira de passagem em cada extremidade.
  2. Levar a câmara para uma bancada limpa e suavemente, desparafuse todos os parafusos para remover a placa superior. Usando uma pinça de ponta, remova a lâmina de vidro da placa inferior e coloque-o em um prato de cultura de tecidos de diâmetro de 100 mm.
  3. Lave o slide com 10 mL de frio fosfato salino (PBS)- / - e verificar as células sob um microscópio para confirmar a aderência de célula e alinhamento na direção do fluxo.
  4. Aspirar a PBS da placa e transferir o slide para um prato de diâmetro 100mm limpo. Adicione 350 µ l de tampão de lise da extração de RNA kit (veja a Tabela de materiais), que contém 1/100 de beta-Mercaptoetanol, para o slide.
    Atenção: Adicione beta-Mercaptoetanol em uma coifa de química.
  5. Raspe as células fora do slide com uma espátula de lâmina de polietileno de célula. Incline o prato de cultura de tecidos, permitindo que o líquido a piscina na parte inferior e remover a lâmina de vidro com a pinça. Pipetar o lisado em um tubo de 1,5 mL de celular e mantê-lo no gelo.
  6. Dilua o estoque referência exógena do RNA (RNA de luciferase) a 0,0025 ng / µ l através de diluição serial antes de adicioná-lo à amostra. Por exemplo, se a concentração das ações é de 1 µ g / µ l, uma diluição de 1/400.000 é necessário para alcançar 0,0025 ng / µ l. adicionar 10 µ l de diluído luciferase RNA para cada amostra de lisado para isolamento de RNA a jusante e análise celular.
  7. Prossiga com o protocolo de extração de RNA conforme as instruções do fabricante, ou congelar o lisado a-80 ° C até capaz de prosseguir com a extração.

9. cálculo da eficiência da extração do RNA e síntese de cDNA

Nota: Calcule a eficiência do luciferase após RT-qPCR, comparando o rendimento teórico e o rendimento experimental.

  1. Determine o rendimento teórico de luciferase RNA.
    1. Determine a quantidade total de cópias do luciferase adicionado por amostra. (Adição de 0,025 ng/amostra = 2,73 x 107 cópias de luciferase RNA por amostra antes da extração do RNA.)
    2. Calcule a massa molecular da luciferase RNA usando uma massa molecular média por nucleotídeos de 330 g/mol e multiplicando-o pelo comprimento do luciferase de vaga-lume RNA, nucleotídeos de 1652.
    3. Divida a quantidade de luciferase RNA adicionado (0,025 ng) para cada amostra antes da extração do RNA pela massa molecular para produzir a quantidade molar. Então, multiplique por do número de Avogadro para produzir as cópias adicionadas por amostra.
    4. Calcule o rendimento teórico para as cópias de luciferase para cada reação de RT-qPCR usando a equação:
      figure-protocol-2
  2. Calcule o rendimento experimental para as cópias de luciferase para cada reação de RT-qPCR usando o plasmídeo luciferase para gerar uma curva padrão para RT-qPCR.
  3. Calcule a eficiência do luciferase (%) usando a equação:
    figure-protocol-3

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Resultados

Bem sucedida linearização do plasmídeo de luciferase usando enzimas de restrição foi confirmada pela execução produtos digeridos em um gel de agarose (Figura 1). O tamanho do produto linear foi confirmado usando escadas de DNA e em comparação com o plasmídeo sem cortes.

Nós adaptamos a afinação de câmara de fluxo paralelo-placa de Lane et al 9 para experimentos que r...

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Discussão

Tensão de cisalhamento é uma condição fisiológica que modula a função endotelial, em parte, por afetar o estado estacionário gene expressão2,5. Modelos de regulação gênica em diferentes condições de tensão de cisalhamento irão contribuir para uma melhor compreensão da função endotelial. Este fluxo de trabalho pragmático inclui um circuito de fluxo utilizando uma câmara de fluxo paralelo-prato adaptada de Lane et al 9 e representa ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela CIHR MOP 142307 ao P.A.M. H.S.J.M. é um destinatário de um canadense institutos de saúde pesquisa programa de treinamento em comunhão de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. são os destinatários da Rainha Elizabeth II bolsas pós-graduação em ciência e tecnologia.

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Materiais

2
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% Tripsina-EDTAgibco25300-062
Seringa de 10 mLBD302995
10 mm2 Prato de culturaSarstedt83.3902
Seringa de 30 mLBD302832
torneiras de 4 viasDiscofixD500
Folha
PRAIADarwin Chambers CompanyMN: HO85, SN: Raspadores
MN: P120, SN: 0342
Sensor de CO2BioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
Água destiladagibco15230-170
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) -/-gibco14190-144
Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2Promo CellC-22011
Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2 Mix de SuplementosPromo CellC-39216
Fibronectina (pura)Filtro11051407001
(0.20 um)Sarstedt83.1826.001
Amortecedor de Fluxo e TampaU
Medidor de Fluxo: Console da Série 400Transonic Scisense Inc.T402
: Tubulação da série 400Transonic Scisense Inc.TS410
Reservatório de Fluxo e TampaU of T Sensor de Fluxo de Loja
de VidroTransonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F FornoFisher ScientificFI-737F
Pano JPano
Microscópio (25 x 75 x 1 mm)Fisherfinest12-544-4
BombaCardinal Health92713
(Masterflex L/S Economy Drive)Cole-Parmer7554-90
Cabeça de Bomba (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
Prato Retangular de 4 PoçosThermo Scientific267061
Pinças
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Tubulação
Masterflex C-Flex L/S 25 Tubo MacioCole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Tubo MacioCole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Tubo MacioCole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Tubo DuroCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Tubo DuroCole-Parmer06508-14
NomeEmpresaNúmero do CatálogoComentários
Luer
3/16" Macho LuerCole-Parmer45518-08Para tubulação #25
1/8" Macho LuerCole-Parmer30800-24Para tubulação #16
1/8" Fêmea LuerCole-Parmer30800-08Para tubulação #16
1/16" Macho LuerCole-Parmer45518-00Para tubulação #14
1/16" Fêmea LuerCole-Parmer45508-00Para tubulação #14
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes knockdown
Reagente de oligofectaminaInvitrogen12252-011
Opti-MEM I Soro Reduzido Meiogibco31985-070
Nome< strong>CompanyNúmero de catálogoComentários
In vitro transcrição
Generuler 1kb+ escada de DNAThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
Kit de Transcrição mMESSSEGE mMACHINE SP6AmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
Escada de DNA SuperenroladaNew England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Brometo de EtídioInvitrogen15585011
XhoI Enzima de RestriçãoNew England BioLabs Inc.R0146S
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Extração de RNA
Beta-mercaptoetanolSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
de alumínio de células de 4947549 CO Meter BioSphenix, Ltd.Sigma-Aldrichof T loja de sopro de vidroMedidor de vazão de SoproLâmina de Bolsa de esterilização de papel

Referências

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