Aqui, um fluxo de trabalho para a análise de expressão de gene e cultura de células endoteliais sob tensão de cisalhamento fluido é apresentado. Incluído é um arranjo físico para habitação e monitoramento de múltiplas câmaras de fluxo em um ambiente controlado e o uso de um referência exógena do RNA por PCR quantitativo simultaneamente.
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Artigo de método
Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Descrevemos um fluxo de trabalho para a análise da expressão gênica de células endoteliais, sujeito a um fluxo constante de laminar usando múltiplas câmaras monitoradas fluxo paralelo-placa. As células endoteliais formam o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos e são cronicamente expostas para a força de fricção do fluxo de sangue chamado tensão de cisalhamento. Sob condições fisiológicas, a função de células endoteliais na presença de várias condições de tensão de cisalhamento. Assim, a aplicação das condições de tensão de cisalhamento em modelos em vitro pode fornecer maior conhecimento sobre respostas endotelial em vivo. A câmara de fluxo paralelo-placa anteriormente publicada por Lane et al 9 é adaptado para estudar a regulação gênica endotelial na presença e na ausência de fluxo laminar (não-pulsátil) constante. Principais adaptações na configuração para o fluxo laminar, tal como apresentada aqui incluem um ambiente grande, dedicado aos circuitos de casa fluxo simultâneo, o controlo das taxas de fluxo em tempo real e a inclusão de uma referência exógena do RNA para a normalização da dados PCR quantitativos em tempo real. Para avaliar tratamentos/condições múltiplas com a aplicação da tensão de cisalhamento, vários circuitos de fluxo e bombas são utilizadas simultaneamente dentro da mesma incubadora aquecida e umidificada. O caudal de cada circuito de fluxo é medido continuamente em tempo real para padronizar as condições de tensão de cisalhamento ao longo dos experimentos. Porque estas experiências têm várias condições, também utilizamos um RNA exógeno de referência que é cravado no momento da extração do RNA para a normalização da extração do RNA e eficiências de síntese do cDNA da primeiro-costa. Estas etapas minimizam a variabilidade entre as amostras. Esta estratégia é empregada em nosso pipeline para a análise de expressão de gene com tensão de cisalhamento experimentos utilizando a câmara de fluxo paralelo-placa, mas partes desta estratégia, tais como os exógenos referência pico-no RNA, podem facilmente e custos reduzidos a ser usadas para outras aplicações.
Introdução
Vascular em células endoteliais forma o revestimento celular interno dos vasos sanguíneos no sistema cardiovascular fechado de espécies superiores. Eles formam a interface entre o sangue e os tecidos e são caracterizados por luminal e superfícies abluminal. O endotélio é um sistema adaptável, ativo e diversificado que regula o fluxo de sangue, tráfico de nutrientes, imunidade e o crescimento de embarcações de sangue novo1. No corpo, as células endoteliais normalmente existem em um ambiente onde eles são expostos para a força de fricção de circulação, tensão de cisalhamento2. Tensão de cisalhamento é um importante regulad....
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Protocolo
1. preparação de referência exógena do RNA
Nota: Escolha uma referência exógena do RNA que não existe em espécie ou modelo de interesse. Para sistemas de mamíferos, luciferase de vaga-lume do RNA pode ser utilizado.
-
Linearização de plasmídeo de referência exógena do RNA
- Prepare a referência exógena do RNA pelo menos 48 h antes da extração de RNA antecipada. Obter ou produzir um clone de cDNA escolhido exógena da referência de RNA, como um clone de cDNA de luciferase de vaga-lume em um vetor do plasmídeo adequado para a transcrição em vitro (ver Tabela de materiais).
- ....
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Resultados
Bem sucedida linearização do plasmídeo de luciferase usando enzimas de restrição foi confirmada pela execução produtos digeridos em um gel de agarose (Figura 1). O tamanho do produto linear foi confirmado usando escadas de DNA e em comparação com o plasmídeo sem cortes.
Nós adaptamos a afinação de câmara de fluxo paralelo-placa de Lane et al 9 para experimentos que r.......
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Discussão
Tensão de cisalhamento é uma condição fisiológica que modula a função endotelial, em parte, por afetar o estado estacionário gene expressão2,5. Modelos de regulação gênica em diferentes condições de tensão de cisalhamento irão contribuir para uma melhor compreensão da função endotelial. Este fluxo de trabalho pragmático inclui um circuito de fluxo utilizando uma câmara de fluxo paralelo-prato adaptada de Lane et al 9 e representa .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela CIHR MOP 142307 ao P.A.M. H.S.J.M. é um destinatário de um canadense institutos de saúde pesquisa programa de treinamento em comunhão de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. são os destinatários da Rainha Elizabeth II bolsas pós-graduação em ciência e tecnologia.
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Materiais
2
de alumínio de células de 4947549 CO Meter BioSphenix, Ltd.Sigma-Aldrichof T loja de sopro de vidroMedidor de vazão de SoproLâmina de Bolsa de esterilização de papel
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| Seringa de 10 mL | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Prato de cultura | Sarstedt | 83.3902 | |
| Seringa de 30 mL | BD | 302832 | |
| torneiras de 4 vias | Discofix | D500 | |
| Folha | |||
| PRAIA | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: Raspadores | |
| MN: P120, SN: 0342 | |||
| Sensor de CO2 | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Água destilada | gibco | 15230-170 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2 Mix de Suplementos | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectina (pura) | Filtro | 11051407001 | |
| (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Amortecedor de Fluxo e Tampa | U | ||
| Medidor de Fluxo: Console da Série 400 | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| : Tubulação da série 400 | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Reservatório de Fluxo e Tampa | U of T Sensor de Fluxo de Loja | ||
| de Vidro | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Forno | Fisher Scientific | FI-737F | |
| Pano J | Pano | ||
| Microscópio (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Bomba | Cardinal Health | 92713 | |
| (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Cabeça de Bomba (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Prato Retangular de 4 Poços | Thermo Scientific | 267061 | |
| Pinças | |||
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Tubulação | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Tubo Macio | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Tubo Macio | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Tubo Macio | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Tubo Duro | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Tubo Duro | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Nome | Empresa | Número do Catálogo | Comentários |
| Luer | |||
| 3/16" Macho Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | Para tubulação #25 |
| 1/8" Macho Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | Para tubulação #16 |
| 1/8" Fêmea Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | Para tubulação #16 |
| 1/16" Macho Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | Para tubulação #14 |
| 1/16" Fêmea Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | Para tubulação #14 |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Reagentes knockdown | |||
| Reagente de oligofectamina | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Soro Reduzido Meio | gibco | 31985-070 | |
| Nome | < strong>Company | Número de catálogo | Comentários |
| In vitro transcrição | |||
| Generuler 1kb+ escada de DNA | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| Kit de Transcrição mMESSSEGE mMACHINE SP6 | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Escada de DNA Superenrolada | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Brometo de Etídio | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Enzima de Restrição | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Extração de RNA | |||
| Beta-mercaptoetanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Referências
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Cl....
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Reimpressões e permissões
