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Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

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DOI:

10.3791/58487

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7 de janeiro de 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado para investigar como osteoartrite, fatores genéticos e/ou regimes de carregamento diferentes afetam a vulnerabilidade dos condrócitos em situ .

Resumo

Homeostase da cartilagem articular depende a viabilidade de células residentes (condrócitos). Infelizmente, o trauma mecânico pode induzir morte condrócito generalizada, podendo levar a colapso irreversível da articulação e o aparecimento da osteoartrite. Além disso, a manutenção da viabilidade de condrócitos é importante nos procedimentos de enxerto osteocondral para óptimos resultados cirúrgicos. Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações sinoviais murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado em estudos comparativos para investigar os efeitos de carregamento mecânico diferentes regimes, diferentes condições ambientais ou manipulações genéticas, bem como estágios diferentes da degeneração da cartilagem em curto e / ou a longo prazo vulnerabilidade de condrócitos articulares in situ. O objetivo do protocolo introduzido no manuscrito é avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações sinoviais murino. Importante, esse método permite que o teste na cartilagem totalmente intacta, sem comprometer as condições de contorno nativas. Além disso, permite a visualização em tempo real de condrócitos articulares vital manchadas e única análise baseada em imagem de lesão celular induzida pela aplicação de controlada estática e regimes de carga de impacto. Nossos resultados representativos demonstram que em explantes de cartilagem saudável, a extensão espacial do ferimento da pilha depende sensivelmente intensidade magnitude e o impacto de carga. Nosso método pode ser facilmente adaptado para investigar os efeitos de carregamento mecânico diferentes regimes, diferentes condições ambientais ou manipulações genéticas diferentes na vulnerabilidade de mecânica de em situ condrócitos articulares.

Introdução

Cartilagem articular (AC) é uma tecido que cobre e protege os ossos nas articulações sinoviais, proporcionando suave articulação conjunta de rolamento de carga. Homeostase do tecido é dependente da viabilidade de condrócitos, o tipo de célula única que residem em AC. No entanto, exposição da cartilagem a forças extremas devido a um trauma (por exemplo, quedas, lesões desportivas ou acidente de veículo) ou devido à instabilidade articular pós-traumática pode induzir a morte de condrócitos, levando à desagregação irreversível da articulação (artrose) 1. Além disso, em osteocondrais enxertia procedimentos que visam reparar defeitos locais na cartilagem danificada, trauma mecânico associada a inserção de enxerto reduz a viabilidade de condrócitos e tem efeitos prejudiciais sobre os resultados cirúrgicos2.

Modelos de explante de cartilagem são comumente usados para estudar a susceptibilidade de condrócitos articulares à morte celular induzida mecanicamente. Estes modelos normalmente usam explantes de animais de grandes porte para estudar os efeitos do carregamento de condições, condições ambientais e outros fatores na célula vulnerabilidade3,4,5,6, 7,,8,9,10,11,12,13,14,15. No entanto, devido ao grande tamanho das articulações nativos, estes modelos geralmente exigem a remoção de um plug de superfície articular de uma articulação intacta, comprometendo desse modo nativas condições de contorno. Além disso, eles geralmente requerem a aplicação de grandes cargas mecânicas para induzir lesão celular. Alternativamente, modelos de explante de cartilagem murino oferecem diversas vantagens sobre os modelos animais maiores em estudar a vulnerabilidade mecânica dos condrócitos em situ . Em particular, devido a suas pequenas dimensões, estes modelos facilitam testes de cartilagem articular totalmente intacta, sem alterar a integridade do tecido nativo. Além disso, carregamento de cartilagem murino ocorre ao longo de pequenas áreas de contato tal que condrócito morte/lesão pode ser induzida com cargas pequenas (< 1 N). Finalmente, o genoma do rato é facilmente manipulado, permitindo o teste de impacto de genes específicos como a susceptibilidade de condrócitos em situ à injúria mecânica.

O objectivo geral do método introduzido neste manuscrito é quantificar e Visualizar-em real-time, o extensão espacial da morte/ferimento da pilha em situ devido a cargas mecânicas aplicadas na cartilagem totalmente intacto do mouse-na-osso explants in vitro. Este método requer a dissecção cuidadosa das articulações sinoviais rato sem comprometer a viabilidade de condrócitos, seguida de teste mecânico de explantes vital manchadas usando um microscópio montado dispositivo semelhante a uma plataforma de teste que desenvolvemos recentemente para quantificar a cartilagem murino propriedades mecânicas16. Durante o ensaio mecânico, uma grande parte da superfície articular (intacta) do osso dissecado é visível em uma micrografia de fluorescência único, permitindo uma análise rápida da viabilidade celular, depois de uma carga é aplicada. Uma análise similar da viabilidade de superfície celular na cartilagem murino explantes foi realizada anteriormente, mas sem aplicação simultânea de carga17. As aplicações potenciais do nosso método incluem estudos comparativos para investigar a vulnerabilidade dos condrócitos articulares para diferentes condições ambientais e mecânicas controladas, bem como a triagem de tratamentos que visam a redução da sensibilidade de condrócitos para carregamento mecânico.

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Protocolo

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comité de Universidade de Rochester em recursos animais.

1. soluções

  1. Preparar a solução de sal equilibrado do Hank (1 X HBSS) contendo cálcio, magnésio e sem vermelho de fenol. Ajuste o pH para 7,4 pela adição de pequenas quantidades de HCl ou NaOH.
  2. Ajuste a osmolaridade para 303 mOsm adicionando NaCl ou água desionizada. Use o tampão durante as dissecções, preparação das amostras e teste mecânico.

2. as dissecções do fêmur Distal e Proximal do úmero com cartilagem Articular totalmente intacta

  1. Eutanásia o mouse de acordo com as orientações institucionais utilizando uma câmara de inalação de2 CO seguida por deslocamento cervical. Segui técnica asséptica durante todo.
    Nota: Ratos entre 81 e 8 semanas de idade de toda a tensão e o sexo podem ser usados.
  2. Use as seguintes ferramentas cirúrgicas para dissecções: (usada para fazer incisões) microtesoura, tesoura de dissecação padrão (usada para o corte do osso), bisturi com #11 lâmina de bisturi (usado para tecidos moles de corte), fórceps de joalheiro (usado para a remoção de soft tecido) e pinças padrão (usadas para descascar a pele e os tecidos moles).
  3. Siga estas instruções para dissecções do fêmur distal .
    1. Posicione o mouse na posição supina.
    2. Faça uma incisão pequena (~ 5 mm) na pele na porção anterior do joelho.
    3. Estender a incisão ao redor do joelho e puxe a pele para expor os músculos de articulação e a perna do joelho.
    4. A partir da extremidade proximal do fêmur, use uma lâmina de bisturi (#11) para cortar ao longo da direção distal. Posicione a lâmina entre a unidade músculo-tendão do quadríceps e o lado anterior da diáfise femoral. Estender o corte em direção e passado a patela e acabar cortando no meio do tendão patelar, eliminando assim a unidade músculo-tendão do quadríceps.
    5. A partir da extremidade proximal do fêmur, use uma lâmina de bisturi (#11) para cortar ao longo da direção distal. Posicione a lâmina entre a unidade do músculo tendão-tendão e no lado posterior da diáfise femoral. Uma vez que o corte se aproxima da articulação do joelho, iniciar o corte através do tecido macio, evitando o contato entre o bisturi e a superfície articular sobre os côndilos distais do fêmur. Termine o corte passado a articulação do joelho.
    6. Recue o quadríceps e músculos isquiotibiais para expor o fêmur. Corte qualquer excesso muscular nos lados medial e laterais do fêmur.
    7. Cortar o músculo da panturrilha do lado posterior da tíbia proximal e virar a perna para visualizar no lado posterior do fêmur.
    8. Expor os côndilos distais do fêmur e superfície posterior da tíbia proximal, removendo o excesso de tecido ao redor da articulação do joelho.
    9. Corte os ligamentos cruzados anteriores e posteriores, usando um bisturi, corte fora os côndilos femorais. Puxar a tíbia longe do fêmur e cortar todos os ligamentos para separar a parte inferior da perna do fémur.
    10. Usar o padrão de dissecação tesoura, cortar o fêmur na extremidade proximal do osso (8 mm acima da articulação tíbio-femoral) do lado lateral . Depois de cortar o osso, limpe qualquer medula visível do lado de fora do osso para evitar a possível contaminação de células da medula óssea.
      Nota: O corte do lado lateral reduz o risco de propagação ao longo do osso.
    11. Remover em torno de tecidos moles (i.e., ligamentos e músculos em excesso) do fémur usando fórceps do joalheiro e expor a cartilagem em ambos os côndilos na extremidade distal do fêmur. Evite o contacto entre a cartilagem e fórceps.
  4. Para as dissecções do úmero , siga as instruções abaixo.
    1. Posicione o mouse na posição supina.
    2. Fazer uma incisão (~ 5 mm) na pele do lado posterior do cotovelo usando microtesoura, estender a incisão ao redor do cotovelo e puxe a pele para expor os músculos do braço e ombro.
    3. A partir da extremidade proximal do úmero, use uma lâmina de bisturi (#11) para cortar ao longo da direção distal. Posicione a lâmina entre a unidade músculo-tendão do tríceps e no lado posterior do úmero. Estender o corte em direção a extremidade distal do úmero e acabar cortando através do tendão do tríceps.
    4. Em seguida puxe para trás o tríceps em direção a extremidade proximal do úmero até a cabeça do úmero é exposta.
    5. Corte o tecido conjuntivo ao redor da cabeça do úmero, usando uma lâmina de bisturi (#11) sem tocar a superfície articular e retire o membro (braço e ombro) do corpo. Hidrate periodicamente a superfície articular da cabeça do úmero com HBSS.
    6. Desconecte o úmero do braço ao quebrar primeiro a extremidade proximal da ulna no lado posterior do braço usando fórceps e depois cortar o tecido conectivo ao redor da extremidade distal do úmero. Remova qualquer excesso de tecido no úmero.
    7. Corte a tuberosidade deltoide no lado posterior do úmero usando tesoura padrão de dissecação.
  5. Coloca o provete dissecado em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo tampão HBSS.

3. ao vivo (calceína AM) / mortos (iodeto de Propidium) protocolo de coloração

  1. Mancha usando calceína AM como segue.
    1. Fazer uma solução stock de calceína AM adicionando 12,5 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) dentro de um frasco de 50 µ g de calceína AM, resultando em uma concentração das ações de 4 mg/mL (4,02 mM).
    2. Diluir a solução de estoque calceína 1: 400 em HBSS para atingir uma concentração de 10 µ g/mL (10,05 µM) de cálcio AM (por exemplo, adicionar 1,25 µ l da solução estoque a 500 µ l de HBSS).
    3. Centrifugue a solução diluída de coloração para 5 s a 2.000 x g, para garantir que todos da tintura, que ocasionalmente pode aderir às paredes do tubo, se mistura com o buffer. Não retire o sobrenadante. A solução para garantir a mistura adequada de vórtice.
    4. Colocar a amostra dissecada em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 500 µ l da solução diluída coloração. Incube a amostra a 37º C por 30 min em um thermomixer enquanto agita a 800 rpm. Certifique-se que os tubos são cobertos em papel alumínio para proteger da exposição à luz.
    5. Transferi a amostra para buffer de calceína AM-free HBSS. Neste ponto, a amostra está pronta para teste mecânico.
  2. Prepare-se iodeto de propidium (PI) solução de coloração como segue.
    1. Prepare o coloração solução diluindo a solução estoque comprado (1 mg/mL, 1,5 mM) 01:25 em HBSS alcançar 40 µ g/mL (60 µM) de PI PI. Por exemplo, adicione 40 µ l da solução estoque de 1000 µ l de HBSS.
    2. Manter o PI coloração solução coberta de papel alumínio para protegê-lo da exposição à luz. Use a solução de coloração imediata após o teste mecânico para detectar células lesadas (ver secção 4).
      Nota: Um pode realizar a coloração de PI previamente ao seu embarque, bem como a mais rigorosamente para avaliar a qualidade das dissecações.

4. mecânico protocolo de teste

  1. Coloque o espécime (fêmur ou o úmero) a lâmina de vidro de um personalizado montado microscópio teste dispositivo mecânico, tal que a superfície articular no posteriores côndilos femorais ou cabeça do úmero está sentado sobre o vidro (Figura 1).
    Nota: Prenda o aplicador de madeira de 10 mm de comprimento (diâmetro = 2 mm) para o lado distal do úmero usando cola de cianoacrilato antes de colocá-lo para o dispositivo, a fim de estabilizar a amostra sobre a superfície plana. Para uma descrição detalhada da plataforma de teste mecânica consulte arquivo complementar 1: seção 1.
  2. Hidrate o espécime com HBSS e coloque o dispositivo com a amostra em um microscópio de fluorescência.
  3. Imagem de condrócitos articulares manchados com calceína AM (comprimentos de onda de excitação/emissão = 495/515 nm) antes de aplicação (linha de base) da carga sob um microscópio de fluorescência com um 4 X secar lente (at = 0,13). Ajuste os parâmetros de aquisição para otimizar a qualidade de imagem.
  4. Aplica o carregamento mecânico em cima da amostra tal que a cartilagem articular é comprimida contra o vidro da tampa.
    1. Para carregamento estático, aplica uma carga estática prescrita (por exemplo, 0,5 N) no topo da amostra (fêmur ou o úmero). Segurar a carga por 5 min e depois removê-lo.
    2. Para o impacto, aplique uma energia de impacto prescrita (por exemplo, 1 mJ) na amostra, largando um pêndulo cilíndrico de peso conhecido (por exemplo, 0,1 N) de uma altura prescrita (por exemplo, 1 cm). Liberação da carga 5 s após o impacto.
      Nota: O peso do pêndulo (mg) e a altura prescrita (h) pode ser convertido em energia de impacto (E) usando a seguinte equação: E = mgh.
  5. Incube a amostra no PI coloração solução durante 5 min à temperatura ambiente.
  6. Imagem de condrócitos articulares manchados com calceína AM e PI (comprimentos de onda de excitação/emissão = 535/617 nm) sob um microscópio de fluorescência (Figura 2).

5. análise de dados

  1. Quantificar a área de células feridos/mortos devido ao regime de carga mecânica aplicada.
    1. Abra as micrografias da superfície articular, adquiridos antes e após a aplicação da carga mecânica no ImageJ18.
    2. Combine as imagens em uma pilha.
    3. Defina a escala das imagens com base na resolução da imagem.
    4. Use a ferramenta polígono para definir a área onde as células se tornou calceína-negativo (perda de fluorescência verde) e PI-positivo (ganho de fluorescência vermelha). Estas células são consideradas para ser ferido ou morto.
    5. Determine a área de células feridos/mortos usando a ferramenta de medição .

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Resultados

Seis diferentes aplicados protocolos de carga (carga estática: 0,1 N, 0,5 N e 1 N por 5 min; e carregamento de impacto: 1 mJ, mJ 2 e 4 mJ) reproducibly induzido quantificáveis áreas localizadas de ferimento da pilha na cartilagem umeral e femoral, obtido a partir de 8-10-semana de idade (de camundongos BALB/c A Figura 2). Importante, a extensão espacial dos condrócitos lesão na superfície articular foi medida rapidamente e facilmente no ImageJ. Resultados rep...

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Discussão

Os métodos descritos acima foram empregados com sucesso para visualizar viável e feridos/mortos em situ condrócitos articulares das articulações do mouse depois prescrito cargas mecânicas ou impactos. Em particular, fomos capazes de analisar a vulnerabilidade mecânica dos condrócitos na cartilagem articular totalmente intacto de dois diferentes articulações sinoviais: a articulação do joelho (fêmures distais) e ombro (úmeros). Nossos representante resultados mostram que a extensão espacial do ferimento da pilha ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer o Dr. Richard Waugh e Luis Delgadillo para o uso generoso de seu medidor de pH e aparelhos. Além disso, os autores gostaria agradecer a Andrea Lee para contribuir para o desenvolvimento inicial do sistema de teste mecânico. Este estudo foi financiado pelo NIH P30 AR069655.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Calceína, AM Invitrogen da Thermo Fisher ScientificC3100MP20x50mg, Eugene, OR, EUA
Iodeto de PropídioInvitrogen da Thermo Fisher ScientificP35661 mg/mL solução em água, 10mL, Eugene, OR, EUA
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich2768551L DMSO, anidro, ≥ 99,9%, St. Louis, MO, EUA
HBSS (cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol) Gibco by Thermo Fisher Scientific14025-0921X, 500mL, Grand Island, NY, EUA
Lâmina cirúrgica de penas (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, EUA
Osmômetro de pressão de vapor, VAPROELITechGroupModelo 5520Puteaux, França
Medidor de pH ModeloBeckman Phi 32 Brea, Califórnia, EUA
Termomixer EppendorfEppendorf AG Modelo 5350Hamburgo, Alemanha
Microscópio de pesquisa invertido motorizadoOlypmusModelo IX-81Center Valley, PA, EUA
Aplicador de madeiraPuritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Lamínulas de vidroWarner Instruments, LLC64-1696#1.5, 0.17mm de espessura, 40mm de diâmetro, Hamden, CT, USA

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