Artigo de método

Técnicas de fenotipagem mícron-escala de milho feixes vasculares, com base na tomografia computadorizada de Microcomputed de raio-x

DOI:

10.3791/58501

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9 de outubro de 2018

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1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Nós fornecemos um método inovador para melhorar o contraste de absorção de raio-x do milho tecido apropriado para digitalização de tomografia computadorizada de microcomputed comum. Com base em imagens de CT, apresentamos um conjunto de fluxos de trabalho de processamento de imagem para diferentes materiais de milho que efetivamente extrair fenótipos microscópicos de feixes vasculares de milho.

Resumo

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É necessário quantificar com precisão as estruturas anatômicas do milho materiais baseados em técnicas de análise de imagem de alta produtividade. Aqui, nós fornecemos um 'protocolo de preparação de amostra' para materiais milho (ou seja, caule, folha e raiz) apropriados para tomografia computadorizada normal microcomputed (micro-CT) digitalização. Com base em imagens de alta resolução do CT de milho caule, folha e raiz, descrevemos dois protocolos para a análise fenotípica de feixes vasculares: (1) com base na imagem CT do milho caule e folha, desenvolvemos um pipeline de análise de imagem específica para extrair automaticamente 31 e 33 características fenotípicas de feixes vasculares; (2) baseado na série de imagem CT da raiz do milho, montamos um esquema de processamento de imagem para a segmentação de tridimensional (3D) dos vasos metaxylem e extraído bidimensional (2D) e a área dos navios de metaxylem, de superfície 3D características fenotípicas, tais como o volume, etc. Os protocolos propostos comparado com medição manual tradicional de feixes vasculares de milho materiais, melhorar significativamente a eficiência e a precisão de quantificação fenotípica mícron-escala.

Introdução

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O sistema vascular milho atravessa toda a planta, da raiz e caule para as folhas, que forma os caminhos de transporte chave para o fornecimento de água, nutrientes minerais e substâncias orgânicas1. Outra função importante do sistema vascular é fornecer suporte mecânico para a planta de milho. Por exemplo, a morfologia, número e distribuição dos feixes vasculares em raízes e caules estão intimamente relacionadas à resistência de alojamento de plantas de milho2,3. Actualmente, estudos sobre a estrutura anatômica dos feixes vasculares principalmente utilizam técnicas microscópicas e Ultramicroscópicos para exibir as estruturas anatômicas de uma determinada parte do caule, folha ou raiz e em seguida medem e contam essas estruturas de interesse pela investigação manual. Sem dúvida, medição manual de várias estruturas microscópicas em microimages em grande escala é um trabalho muito tedioso e ineficiente e limita severamente a precisão dos traços microphenotypic, devido a sua subjetividade e inconsistência4, 5.

O milho não tem nenhum crescimento secundário, e o conteúdo da célula consiste essencialmente de água no meristema primário. Sem qualquer tratamento prévio, frescas amostras de tecidos de milho podem ser diretamente digitalizadas usando um dispositivo micro-CT; no entanto, os resultados da verificação são provavelmente pobre e difícil. As principais razões são resumidas como segue: densidades (1) baixa atenuação dos tecidos da planta, resultando em um baixo contraste de número atômico e alto ruído em imagens; (2) materiais vegetais frescos são propensas a desidratar e encolher durante o varredura ambiente normal, conforme relatado por Du6. Os problemas acima referidos tornaram-se as principais restrições para o desenvolvimento e a aplicação da tecnologia de microphenotyping de milho, trigo, arroz e outras monocotiledôneas. Aqui, apresentamos o 'protocolo de preparação de amostra' para o pré-tratamento das amostras de milho caule, folha e raiz. Este protocolo evita a desidratação e deformação de materiais vegetais durante o CT varredura; assim, é benéfico aumentar o tempo de preservação de amostras de plantas com nondeformation. Além disso, a etapa de tingimento com base em iodo sólido também aumenta o contraste dos materiais de planta; assim, faz-se melhorias significativas na qualidade de imagem do micro-CT. Além disso, desenvolvemos o software de processamento de imagem, chamado VesselParser, para processar as imagens de CT de milho caules e folhas. Este software integra um conjunto de condutas de processamento de imagem para executar análise de fenotipagem do elevado-throughput e automático para imagens de CT 2-D de tecidos vegetais diferentes. Feixes vasculares na toda seção transversal do caule de milho e folha são detectados, extraídos e identificado usando um método automático de processamento de imagem. Como resultado, obtemos 31 fenótipos microscópicos da haste milho e 33 fenótipos microscópicos da folha do milho. Para a série de imagem CT da raiz do milho, desenvolvemos um esquema de processamento de imagem para adquirir características fenotípicas 3D dos vasos metaxylem. Este esquema é superior em eficiência de aquisição de imagem e reconstrução em comparação com métodos tradicionais.

Estes resultados indicam que a imagem processamento de dutos, Considerando que as características da imagem latente de micro-CT ordinário do raio-x fornecem um método eficaz para o microscópico fenotipagem de feixes vasculares; isso extremamente amplia as aplicações das técnicas de CT na ciência de planta e melhora a fenotipagem automática de materiais vegetais no celular resolução6,7.

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Protocolo

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1. protocolo de preparação de amostra

  1. Para a amostragem, coletar o caule, folha e raiz de plantas de milho frescas e dividi-los em três tipos de grupos de amostra (cada grupo com quatro repetições). Em seguida, cortá-los em pequenos segmentos, usando uma lâmina cirúrgica da seguinte maneira: (1) corte um segmento do meio da haste entrenó 1-1,5 cm de comprimento; (2) cortar um segmento da largura máxima da folha 0.5 - 3 cm de comprimento ao longo da direção vertical com a veia principal; (3) corte um segmento da raiz coroa 0,5 cm de comprimento.
  2. Para a fixação da FAA, mergulhe os segmentos da amostra em uma solução de FAA (90:5:5 v/v/v, 70% etanol: 100% formaldeído: 100% ácido acético) pelo menos 3 d.
  3. Execute o procedimento de desidratação em seis gradientes de etanol sequencial (ou seja, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100%) e definir o tempo de processamento de cada gradiente de etanol como 30 min.
  4. Guarde o material de planta nas cestas de amostra correspondente, fabricadas usando uma impressora 3-d; em seguida, rapidamente transferi as cestas de amostra para a célula de amostra de um CO2 ponto crítico sistema de secagem. Defina os parâmetros de secagem da seguinte forma:
    (1) CO2 em: velocidade rápida. Enchimentos de titular: 100%.
    (2) charge: CO2 carga demora 120 s no ciclo. Troca de velocidade: 5. ciclo número: 12.
    (3) gás fora: aquecer, rápido. Velocidade: lento, 50%.
    1. De acordo com as diferenças morfológicas de milho raiz, caule e folha, design e cestas de amostra imprimir usando uma impressora 3D (por exemplo, Figura 1).
  5. Coloque os materiais de planta seca (milho raiz, caule ou folha) num tubo de centrífuga de 50 mL com 2 g de iodo sólido para tingir os materiais de planta com vapor de iodo voláteis e, em seguida, coloque os tubos num quarto opacos para 4-5 h.

2. micro-CT varredura protocolo

  1. Para digitalizar para os dados brutos do CT, definir o CT parâmetros de digitalização da seguinte forma: 40 kV/250 µA (para o tronco e folha) ou 34 kV/210 µA (para o root). Definir o correspondente digitalização varia para os diferentes tamanhos e volumes de materiais vegetais utilizados e ajustar o tamanho do pixel da imagem latente da seguinte maneira: 2,0 µm (para a raiz do milho), 6,77 µm (para a haste de milho) e 10,0 µm (para a folha de milho).
  2. Para reconstruir imagens de fatia, converta os dados de CT brutos em imagens de fatia CT com uma resolução de 2K (2.000 x 2.000 pixels) usando um software de reconstrução de imagem. Mais detalhes são fornecidos no Manual do usuário NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. imagem protocolo de análise para um único CT imagem de um caule de milho ou folha

Nota: Use o software de imagem automático para feixes vasculares para realizar a análise de fenotipagem de feixes vasculares dentro as imagens de fatia CT do milho caule e folha (Figura 2). As etapas de uso de software são descritas como segue.

  1. Nomear o tipo de órgão para inicializar o algoritmo diferente pipelines. Clique no botão parâmetros de método e selecione haste de milho ou folha de milho na primeira caixa suspensa.
  2. Para importar as imagens, clique em Gerenciamento de dados , definir o diretório de trabalho e importar automaticamente todas as imagens de fatia neste diretório. Selecione imagens simples ou multi-slice em pipelines a imagem.
  3. Determine o tamanho real do pixel da imagem. Clique no botão parâmetros de método e digite o tamanho real do pixel da imagem no item de editar o tamanho de pixel.
  4. Para o cálculo de fenotipagem, clique no botão de cálculo de fenotipagem para extrair automaticamente características fenotípicas dos feixes vasculares para todas as imagens de fatia selecionada.
  5. Clique no botão de análise estatística para gerar os resultados como um formato de arquivo TXT ou CSV.

4. imagem protocolo de análise para a série de imagem CT de uma raiz de milho

Nota: A série de imagem CT de raízes de milho é utilizada para extrair as estruturas 3-d dos vasos metaxylem, usando o software de processamento de imagem. As etapas principais são as seguintes.

  1. Importar as imagens reconstruídas de raízes de milho (no formato de arquivo BMP) e determinar os parâmetros exatos de espaçamento (do tamanho de um voxel [ou seja,x, y, z]). Use a ferramenta de Gaussian recursiva para suavizar as imagens para melhorar a qualidade de imagem.
  2. Conduta em 3D segmentação dos vasos metaxylem, ajustando os parâmetros do limiar; Isso gera uma etiqueta de cor uniforme para cada navio metaxylem conectados.
  3. Melhorar e identificar os vasos metaxylem interativamente usando morfologia, bit a bit e operações de inundação-preenchimento.
  4. Realizar a reconstrução de superfície e visualização volume dos vasos. Use a ferramenta de estatísticas de máscara para contar e medir as características fenotípicas de um navio nos níveis de 2-D e 3-d.

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Resultados

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O protocolo de preparação de amostra adequado para a digitalização de micro-CT normal não só impede a deformação dos tecidos vegetais, mas também aumenta o contraste de absorção de raios-x. Materiais vegetais pré-tratados são verificados usando um sistema de micro-CT em imagens de alta qualidade fatia, e a maior resolução pode chegar a 2 µm/pixel. A Figura 4 mostra as imagens digitalizadas de micro-CT de caule, folha e raiz, e o contraste da imagem tem uma me...

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Discussão

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Com o sucesso da aplicação da tecnologia de CT nos domínios da biomedicina e ciência dos materiais, esta tecnologia foi gradualmente introduzida nos campos da botânica e agricultura, promover pesquisas nas ciências da vida de planta como uma ferramenta técnica promissora . Na década de 1990, a tecnologia de CT foi usada primeiramente para estudar as estruturas morfológicas e desenvolvimento de sistemas de raiz da planta. Na década passada, síncrotron HRCT tornou-se uma ferramenta poderosa, não destrutiva para os biólogos...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pelo nacional natureza Science Foundation da China (No.31671577), a ciência e tecnologia inovação especial construção financiados pelo programa de Pequim Academia da agricultura e silvicultura Sciences(KJCX20180423), a pesquisa Programa de desenvolvimento da China (2016YFD0300605-01), a Fundação de ciência Natural de Beijing (5174033), o Beijing pós-doutorado pesquisa Foundation (2016 ZZ-66) e a Academia de Pequim de agrícola e Grant de Ciências Florestais (KJCX20170404) ( JNKYT201604).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Skyscan 1172 Sistema de tomografia computadorizada de raios-XBruker Corporation, BélgicaNAPara varredura de tomografia computadorizada
CO2 sistema de secagem de ponto crítico (Leica CPD300)Leica Corporation, AlemanhaNAPara secagem de amostras
EtanolQualquerNAPara fixação de FAA
FormaldeídoQualquerNAPara fixação de FAA
Acético ácidoQualquerNAPara fixação FAA
Lâmina cirúrgicaQualquerNAPara cortar os conjuntos de amostras
Impressora 3DReplicador Makerbot 2, MakerBot Industries, USANAPara imprimir os cestos de amostra de raiz, caule e folha de milho
Tubo de centrífugaCorning, USANAColoque os materiais da raiz, caule ou folha
Iodo sólidoQualquerNAPara tingimento de amostras
SkyScan Nrecon softwareSkyScan NRecon, Versão: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BélgicaNAPara reconstrução de imagem
VesselParser softwareVesselParser, Versão: 3.0, Centro Nacional de Pesquisa de Engenharia para Tecnologia da Informação na Agricultura (NERCITA), Pequim, ChinaNAProtocolo de análise de imagem para imagem única de TC de caule ou folha de milho
ScanIPScanIP, Versão: 7.0; Simpleware, Exeter, REINO UNIDONASoftware de processamento de imagem 3D
Luvas de látexQualquerpinça NA
QualquerNA

Referências

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